化濁解毒方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清IL-1β、IL-8含量及結(jié)腸黏膜NF-κB mRNA表達(dá)的影響

李博林， 趙丹陽(yáng)， 杜朋麗， 才艷茹， 何芳， 景璇， 楊倩， 胡婧楠， 李剛

（河北省中醫(yī)院，河北石家莊 050011）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種病因尚不明確的慢性炎癥性疾病，病變主要累及結(jié)、直腸部位，臨床表現(xiàn)以黏液膿血便、腹痛、腹瀉、里急后重為主。近年來(lái)，隨著生活方式、飲食結(jié)構(gòu)的不斷改變，我國(guó)UC發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)[1]。本病病程長(zhǎng)、易反復(fù)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。目前多認(rèn)為該病與遺傳因素、環(huán)境因素、免疫因素等有關(guān)[2]。在UC的致病因素中，免疫功能異常成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)之一，尤其是核因子κB（NF-κB），其參與介導(dǎo)了一系列免疫炎癥反應(yīng)，在UC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3]。本課題組前期臨床觀察發(fā)現(xiàn)UC的主要病機(jī)為濁毒內(nèi)蘊(yùn)[4]，以此立論的化濁解毒方治療UC療效確切[5-8]，但其具體作用機(jī)制尚不明確。基于此，本研究觀察化濁解毒方對(duì)UC模型大鼠血清IL-1β、IL-8及黏膜組織NF-κB mRNA表達(dá)的影響，以探討其作用機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 8周齡清潔級(jí)雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量（120±20）g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（冀）2015-1-003，動(dòng)物合格證號(hào)：1710300。于室溫20～25℃飼養(yǎng)，濕度50%～70%，予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后分組造模。

1.2 藥物 化濁解毒方（組成：佩蘭15 g，藿香12 g，茵陳蒿15 g，鳳尾草15 g，飛揚(yáng)草15 g，澤瀉6 g，蒼術(shù)12 g，厚樸6 g，胡黃連12 g，石榴皮12 g，地榆15 g，兒茶6 g，烏梅9 g，仙鶴草15 g，白芍15 g，佛手12 g），是由廣州一方制藥有限公司提供的免煎顆粒制劑。將藥物溶于80℃的蒸餾水中，配成質(zhì)量濃度為5 g/mL的混懸液備用。美沙拉嗪腸溶片，規(guī)格為0.25 g/片，國(guó)藥準(zhǔn)字H19980148，由葵花藥業(yè)集團(tuán)佳木斯鹿靈制藥有限公司提供，研缽研成細(xì)粉，溶于蒸餾水配成0.3 g/kg溶液。

1.3 試劑與儀器 2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS；美國(guó)Sigma公司）；無(wú)水乙醇（天津永大化學(xué)試劑有限公司）；白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-8酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（深圳晶美生物工程有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）試劑盒（日本TaKaRa公司）。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（芬蘭雷伯公司）；實(shí)時(shí)熒光PCR定量?jī)x（美國(guó)Thermo Fisher儀器有限公司）；低溫離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；HMIAS-2000顯微圖像分析系統(tǒng)（武漢同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)）。

1.4 模型制備 將60只雄性Wistar大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分為正常組15只和造模組45只。采用TNBS/乙醇復(fù)合法建立UC大鼠模型[9]。具體操作方法：將5%TNBS與50%乙醇等體積混合為造模劑，造模組大鼠禁食不禁水24 h后稱質(zhì)量，乙醚麻醉；將造模劑按照4 mL/kg的劑量用直徑約2 mm橡膠管推入距離肛門約6～8 cm的腸腔內(nèi)，提起大鼠尾部倒置30 s，再捏緊大鼠肛門平放8～10 min。正常組予相同體積9 g/L NaCl溶液。造模結(jié)束后，將大鼠放回籠內(nèi)，常規(guī)飼養(yǎng)。造模期間，造模組大鼠死亡1只。造模3 d后，于造模組隨機(jī)抽取大鼠2只，斷頭處死，取結(jié)腸組織鏡下觀察，若見水腫、充血、糜爛、潰瘍形成等病理改變，即可判斷造模成功。

1.5 分組及給藥 將造模成功的42只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為3組，即UC模型組、美沙拉嗪組及化濁解毒方組，每組14只。根據(jù)“動(dòng)物與人體的每公斤體質(zhì)量劑量折算系數(shù)表”計(jì)算大鼠灌胃中藥劑量，成人與大鼠的折算系數(shù)為6.25，大鼠每日用藥劑量=成人每日用藥總量/一般成人體質(zhì)量（60 kg）×6.25?；瘽峤舛痉浇M：給予化濁解毒方混懸液（劑量為20.0 g·kg-1·d-1）灌胃；美沙拉嗪組：給予美沙拉嗪混懸液（劑量為0.3 g·kg-1·d-1）灌胃；正常組：常規(guī)飼養(yǎng)；UC模型組：給予9 g/L NaCl溶液（劑量為4.0 mL·kg-1·d-1）灌胃。連續(xù)給藥14 d。

1.6 標(biāo)本采集及處理 連續(xù)給藥14 d后，各組大鼠禁食不禁水24 h，稱質(zhì)量后予水合氯醛麻醉，開腹，股動(dòng)脈取血2 mL置于試管中，血液凝固后分離血清，保存于-20℃冰箱備用。同時(shí)迅速在距離肛門8 cm處剪取病變結(jié)腸組織1 cm×1 cm，生理鹽水沖洗，固定于體積分?jǐn)?shù)為10%的中性緩沖福爾馬林液24 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋、切片，蘇木素—伊紅（HE）染色備用。

1.7 指標(biāo)檢測(cè)

1.7.1 疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）評(píng)分 參照Murano等[10]制定的方法，DAI=（體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)）/3。

1.7.2 結(jié)腸黏膜組織大體觀及病理學(xué)觀察 大鼠處死后，取全結(jié)腸，生理鹽水沖洗干凈，肉眼下觀察結(jié)腸黏膜的充血、水腫、糜爛、壞死、出血等情況。顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理學(xué)變化情況，包括有無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腺體結(jié)構(gòu)是否完整、有無(wú)潰瘍等情況。

1.7.3 采用ELISA法測(cè)定血清中IL-1β、IL-8含量具體操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。操作如下：采用抗人IL-1β/IL-8單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的IL-1β/IL-8與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗人IL-1β/IL-8，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入酶底物OPD，出現(xiàn)黃色。加終止液硫酸，顏色變深，在492 nm處測(cè)光密度（D）值。IL-1β/IL-8濃度與D（492 nm）值成正比，可通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中IL-1β、IL-8濃度。

1.7.4 采用RT-PCR法檢測(cè)結(jié)腸黏膜組織中NF-κB mRNA表達(dá)情況 具體操作：采用Trizol法提取結(jié)腸黏膜組織總RNA，使用分光光度計(jì)檢測(cè)260/280 nm處總RNA濃度后，開始反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL，具體操作參照RT試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系20 μL，NF-κB上游引物為5’-CTACCCCGAAATCAA AGACAAG-3’，下游引物為5’-ACTCTTGGCACAATCTCTAGGC-3’。以β-actin為內(nèi)參。PCR反應(yīng)程序如下：95℃30 s預(yù)變性，40個(gè)循環(huán)，95℃5 s變性，59.7℃30 s退火，72℃30 s采集熒光。使用Sequence Delection Soft Wareversion 1.2.3軟件分析PCR過(guò)程中樣本的CT值。通過(guò)2-△△CT計(jì)算NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)水平（p）。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，以均進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)。多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠DAI評(píng)分比較 表1結(jié)果顯示：與正常組比較，UC模型組大鼠DAI評(píng)分升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與UC模型組比較，2個(gè)治療組DAI評(píng)分顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與美沙拉嗪組比較，化濁解毒方組DAI評(píng)分明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠DAI評(píng)分比較Table 1 Comparison of DAI score in various groups (-x±s)

2.2 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織大體觀及病理學(xué)比較 圖1結(jié)果顯示：與正常組比較，各造模組大鼠結(jié)腸黏膜表面均有不同程度的充血、水腫、糜爛等表現(xiàn)。其中，UC模型組最為嚴(yán)重，黏膜可見糜爛、水腫，部分出現(xiàn)潰瘍及壞死，鏡下腺體排列紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與UC模型組比較，2個(gè)治療組大鼠結(jié)腸黏膜均有不同程度緩解，化濁解毒方組黏膜表現(xiàn)接近正常組，其表面較光滑，水腫、充血不明顯，可見愈合的潰瘍面，黏膜腺體結(jié)構(gòu)完整，偶有少量炎性滲出。美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸黏膜表面欠光滑，可見少量水腫、糜爛及表淺潰瘍形成，黏膜腺體結(jié)構(gòu)基本完整，可見部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖1 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)觀察（HE染色，×40）Figure 1 Comparison of pathological features of colonic mucosal tissues in various groups（by HE staining，×40）

2.3 各組大鼠血清中IL-1β、IL-8含量比較 表2結(jié)果顯示：與正常組比較，UC模型組大鼠血清中IL-1β、IL-8含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與UC模型組比較，2個(gè)治療組大鼠血清中IL-1β、IL-8含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與美沙拉嗪組比較，化濁解毒方組血清中IL-1β、IL-8含量均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織中NF-κB mRNA表達(dá)比較 表2結(jié)果顯示：與正常組比較，UC模型組結(jié)腸黏膜組織NF-κB mRNA表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與UC模型組比較，2個(gè)治療組大鼠結(jié)腸黏膜組織中NF-κB mRNA表達(dá)水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與美沙拉嗪組比較，化濁解毒方組結(jié)腸黏膜組織中NF-κB mRNA表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清IL-1β、IL-8含量及結(jié)腸黏膜組織NF-κB mRNA表達(dá)水平比較Table 2 Comparison of the serum contents of IL-1β and IL-8，and colonic mucosal expression level of NF-κB mRNA in various groups (-x±s)

3 討論

UC是一種病因及發(fā)病機(jī)制尚不完全明確的慢性非特異性炎癥性腸病?，F(xiàn)代研究多認(rèn)為，免疫異常是UC發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而細(xì)胞因子在介導(dǎo)異常免疫反應(yīng)中起重要作用。IL-1β是一種由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的致炎因子，可以激活樹突樣細(xì)胞吞噬抗原，釋放抗原片段，參與免疫反應(yīng)的持續(xù)與放大[11]。同時(shí)IL-1β也可誘導(dǎo)單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞趨化，分泌白三烯等大量炎癥物質(zhì)，使腸道黏膜喪失上皮屏障功能，從而加重炎癥反應(yīng)[12]。IL-8是在內(nèi)源性及外源性因子刺激下產(chǎn)生的一種多肽因子。IL-8具有趨化和激活中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞的作用，增加過(guò)氧化物及溶酶體酶數(shù)量，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性，參與UC發(fā)病過(guò)程[13]。NF-κB作為一種具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于各類組織中，主要參與免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、組織修復(fù)等基因信息的表達(dá)[14]。研究發(fā)現(xiàn)，活化后的NF-κB能夠結(jié)合細(xì)胞核基因的增強(qiáng)子或啟動(dòng)子，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，激活相關(guān)細(xì)胞應(yīng)激基因，產(chǎn)生如IL-1、IL-6、IL-8等細(xì)胞因子[15]。NF-κB在UC的發(fā)生發(fā)展中起到了樞紐作用[3]。

在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中并沒(méi)有UC病名記載，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可以將本病歸屬為“久痢”、“痢疾”等范疇[16]。古代醫(yī)家多認(rèn)為素體脾虛為UC發(fā)病基礎(chǔ)，飲食不節(jié)（潔）、情志失調(diào)皆為常見病因，病理性質(zhì)屬本虛標(biāo)實(shí)。本課題組經(jīng)過(guò)大量臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，“濁毒內(nèi)蘊(yùn)”是本病的主要病機(jī)?，F(xiàn)代飲食偏于肥甘厚味，日久則脾胃不和，運(yùn)化失司，水濕內(nèi)停，氣機(jī)阻滯，濕熱蘊(yùn)結(jié)，濕久則化濁，熱久而蘊(yùn)毒，濁毒內(nèi)蘊(yùn)，與氣血搏結(jié)，損傷腸絡(luò)，血肉腐敗化膿。針對(duì)此病機(jī)，本課題組自擬化濁解毒方治療UC。方中佩蘭“辛平能散結(jié)滯，芬芳能除穢惡”（《本草經(jīng)疏》），乃祛濁要藥，與藿香合用共奏化濁辟穢之功。鳳尾草、飛揚(yáng)草清熱利濕解毒，亦有收斂止痢之效。四藥合用化濁解毒，直擊病源。茵陳蒿、澤瀉利濕清熱，化濁解毒。現(xiàn)代藥理研究表明，茵陳可參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，同時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等有不同程度的抑制作用。佛手、厚樸理氣寬中，“調(diào)氣則后重自除”。地榆苦寒，涼血止血、療瘡解毒，兒茶活血化瘀、收斂生肌，胡黃連清熱涼血燥濕，仙鶴草收斂止血解毒，四藥合用“行血?jiǎng)t便膿自愈”。石榴皮、烏梅澀腸止瀉，蒼術(shù)健脾止痢，白芍行氣和血，緩急止痛。諸藥合用，化濁解毒，調(diào)氣和血，諸癥向愈。

本研究結(jié)果顯示：經(jīng)化濁解毒方治療后，UC大鼠體質(zhì)量、便血、糞便性狀等一般情況均得到顯著改善，鏡下結(jié)腸黏膜恢復(fù)良好，血清中IL-1β、IL-8含量及結(jié)腸黏膜NF-κB mRNA表達(dá)水平顯著降低。提示化濁解毒方可能是通過(guò)改善NF-κBmRNA表達(dá)，抑制相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，達(dá)到修復(fù)受損腸黏膜、治療UC的目的。