欣胃顆粒及其拆方對(duì)胃癌前病變大鼠Axin、APC基因表達(dá)影響的研究 Δ

張楊，沈文娟，謝晶日，王靜濱，劉朝霞，孫濤，張冰

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院1肝脾胃科，2婦科，哈爾濱1500360

胃癌前病變（precancerous lesions of gastric carcinoma，PLGC）是從病理學(xué)角度提出的概念，指胃黏膜具有惡性轉(zhuǎn)化可能性的病理學(xué)改變，其包括慢性萎縮性胃炎并伴有腸上皮化生和異型增生的一種病理狀態(tài)。根據(jù)Correa級(jí)聯(lián)學(xué)說(shuō)，胃黏膜癌變是多階段的動(dòng)態(tài)演變過(guò)程，通常要經(jīng)歷一個(gè)相對(duì)較長(zhǎng)的PLGC階段，此階段是胃癌轉(zhuǎn)變的重要節(jié)點(diǎn)，并具有雙向轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)[1]。由于PLGC具有雙向轉(zhuǎn)變的特點(diǎn)，所以其在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵性作用。相關(guān)研究表明，胃癌的發(fā)生與不恰當(dāng)?shù)丶せ頦NT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)[2]。與西醫(yī)治療相比，中醫(yī)藥治療PLGC的優(yōu)勢(shì)突出[3-4]，且起到細(xì)胞逆轉(zhuǎn)及腺體重建的作用。本研究基于前期多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究及臨床觀察的基礎(chǔ)上[5-7]，探究欣胃顆粒及其拆方干預(yù)對(duì)PLGC大鼠WNT信號(hào)通路中軸蛋白（Axin）和結(jié)腸腺瘤樣息肉病基因（adenomatous polyposis coli，APC）表達(dá)的影響，揭示欣胃顆粒的作用機(jī)制以及拆方后各法之間的協(xié)調(diào)作用，旨在為優(yōu)化組方及胃癌的有效防治提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取Wistar健康雄性大鼠[由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：SCKK（黑）2008004]360只，體重為（200±20）g。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

欣胃顆粒：每劑由黃芪（每袋10 g）2.5袋；白術(shù)（每袋10 g）2.0袋；石斛（每袋10 g）1.5袋；沙參（每袋10 g）1.5袋；三棱（每袋10 g）1.5袋；莪術(shù)（每袋10 g）1.5袋；蛇莓（每袋10 g）1.5袋；半枝蓮（每袋15 g）2.5袋組成，均購(gòu)自江陰天江藥業(yè)有限公司。胃復(fù)春（由香茶菜、紅參、枳殼等組成）購(gòu)自杭州胡慶余堂藥業(yè)。N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG）購(gòu)自日本東京化成工業(yè)株式會(huì)；Axin、APC試劑盒均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。PCR引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3 方法

1.3.1 分組 將360只Wistar健康雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、胃復(fù)春組和中藥組，其中中藥組又分為中藥單法組[益氣法（藥用黃芪、白術(shù)）、養(yǎng)陰法（藥用石斛、沙參）、化瘀法（藥用三棱、莪術(shù)）、解毒法（藥用蛇莓、半枝蓮）4組]、中藥雙法組[益氣養(yǎng)陰法（藥用黃芪、白術(shù)、石斛、沙參）、益氣化瘀法（藥用黃芪、白術(shù)、三棱、莪術(shù)）、益氣解毒法（藥用黃芪、白術(shù)、蛇莓、半枝蓮）、養(yǎng)陰化瘀法（藥用石斛、沙參、三棱、莪術(shù)）、養(yǎng)陰解毒法（藥用石斛、沙參、蛇莓、半枝蓮）、化瘀解毒法（藥用三棱、莪術(shù)、蛇莓、半枝蓮）6組]、中藥三法組[益氣養(yǎng)陰化瘀法（藥用黃芪、白術(shù)、石斛、沙參、三棱、莪術(shù)）、益氣養(yǎng)陰解毒法（藥用黃芪、白術(shù)、石斛、沙參、蛇莓、半枝蓮）、益氣化瘀解毒法（藥用黃芪、白術(shù)、三棱、莪術(shù)、蛇莓、半枝蓮）、養(yǎng)陰化瘀解毒法（藥用石斛、沙參、三棱、莪術(shù)、蛇莓、半枝蓮）4組]、中藥四法組[益氣養(yǎng)陰化瘀解毒法（藥用黃芪、白術(shù)、石斛、沙參、三棱、莪術(shù)、蛇莓、半枝蓮）]，共計(jì)18組，每組20只。

1.3.2 模型制備 根據(jù)MNNG自由飲用，雷尼替丁標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，熱鹽水灌胃，同時(shí)配合饑飽失常的復(fù)合造模方法構(gòu)建胃癌前病變動(dòng)物模型。模型組、胃復(fù)春組和中藥各組大鼠給予100 μg/ml MNNG溶液作為飲用水自由飲用，含0.3 g/kg雷尼替丁的標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，60℃150 g/L熱鹽水每日按10 ml（/kg·d）灌胃，同時(shí)配合饑飽失常（2天飽食，1天禁食），連續(xù)16周造成大鼠PLGC病變模型?？瞻捉M大鼠正常進(jìn)食進(jìn)水。

1.3.3 藥物干預(yù)PLGC大鼠造模成功后，胃復(fù)春組、中藥各組大鼠分別給予相應(yīng)藥物干預(yù)，具體方法：每日下午給予各組大鼠按10 ml（/kg·d）相應(yīng)的藥物灌胃，胃復(fù)春組給予濃度為0.04 g/ml的胃復(fù)春制劑，中藥各組給予濃度為1.5 g/ml的對(duì)應(yīng)組方顆粒，模型組和空白組大鼠給予0.9%的生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥16周。

1.3.4 胃黏膜組織中Axin、APC基因相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè) 藥物干預(yù)結(jié)束后，所有大鼠均禁食24 h（自由飲水），然后全部烏拉坦麻醉，迅速剖腹取胃，沿胃大彎剪開(kāi)，采用預(yù)冷的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗，將胃組織平鋪于冰盤(pán)上，肉眼觀察了解胃黏膜的變化情況后，于胃竇部剪取黃豆大組織2塊，液氮處理后于-86℃超低溫保存，將胃黏膜組織按照RNeasy Mini Kit的操作步驟提取細(xì)胞總RNA，同時(shí)按照離心柱型高純總RNA快速提取試劑盒中的步驟對(duì)提取的總RNA進(jìn)行純化。將獲取的總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)獲取實(shí)驗(yàn)所需的cDNA。引物序列為：βactin上游引物：3'-CGCGAGAAATGACCCAGAT-5'，下游引物：3'-GTACGGCCAGAGGCGTACAG-5'；Axin上游引物：3'-CCACAGAAATAGTAGGCCACA-5'，下 游 引 物 ：3'-GGAGGAAGAAGAAAAGAGAGC-5'；APC上游引物：3'-GATAAGGACGATATGTCACG-5'，下 游 引 物 ：3'-TGAATGATGTTGTGGAGGGC-5'。 按 照 Takara 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，20 μl反應(yīng)體系擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s進(jìn)行變性、退火、延伸，共40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)每組獲取的Ct值，應(yīng)用2-△△Ct方法定量檢測(cè)基因的表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1胃黏膜組織中AxinmRNA、APCmRNA表達(dá)情況的比較

與空白組比較，模型組、胃復(fù)春組和中藥各組大鼠胃黏膜組織中AxinmRNA、APCmRNA的相對(duì)表達(dá)量均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，胃復(fù)春組和中藥各組大鼠胃黏膜組織中AxinmRNA、APCmRNA相對(duì)表達(dá)量均增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與胃復(fù)春相比較，中藥單法組大鼠胃黏膜組織中AxinmRNA相對(duì)表達(dá)量均降低，中藥三法組和中藥四法組大鼠胃黏膜組織中AxinmRNA相對(duì)表達(dá)量均增高，中藥單法組、中藥雙法組、中藥三法組和中藥四法組大鼠胃黏膜組織中APCmRNA的相對(duì)表達(dá)量均增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與中藥四法組比較，中藥單法組、中藥雙法組、中藥三法組大鼠胃黏膜組織中AxinmRNA、APCmRNA的相對(duì)表達(dá)量均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同組別大鼠胃黏膜組織中Axin mRNA、APC mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

表1 不同組別大鼠胃黏膜組織中Axin mRNA、APC mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

注：a與空白組比較，P＜0.05；b與模型組比較，P＜0.05；c與胃復(fù)春組比較，P＜0.05；d與益氣養(yǎng)陰化瘀解毒組比較，P＜0.05；實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠有死亡，故部分組別大鼠例數(shù)小于20例

組別空白組（n=19）模型組（n=16）胃復(fù)春組（n=20）中藥單法組益氣組（n=20）養(yǎng)陰組（n=20）化瘀組（n=20）解毒組（n=20）中藥雙法組益氣養(yǎng)陰組（n=19）益氣化瘀組（n=19）益氣解毒組（n=18）養(yǎng)陰化瘀組（n=19）養(yǎng)陰解毒組（n=18）化瘀解毒組（n=18）中藥三法組益氣養(yǎng)陰化瘀組（n=16）益氣養(yǎng)陰解毒組（n=18）益氣化瘀解毒組（n=18）養(yǎng)陰化瘀解毒組（n=18）中藥四法組益氣養(yǎng)陰化瘀解毒組（n=18）Axin mRNA 468.87±9.57 103.03±6.32a 277.86±15.27a b APC mRNA 1.06±0.07 0.09±0.01a 0.13±0.02a b 213.95±16.84a b c d 211.26±17.88a b c d 208.67±30.34a b c d 206.12±21.43a b c d 0.26±0.02a b c d 0.25±0.03a b c d 0.26±0.03a b c d 0.26±0.04a b c d 247.60±4.39a b d 230.49±31.62a b d 260.73±28.06a b d 246.53±23.40a b d 268.55±21.35a b d 261.39±24.40a b d 0.32±0.01a b c d 0.33±0.03a b c d 0.34±0.0a b c d 0.34±0.04a b c d 0.34±0.03a b c d 0.35±0.03a b c d 315.05±13.00a b c d 332.70±7.27a b c d 306.96±12.27a b c d 347.48±25.77a b c d 0.46±0.05a b c d 0.46±0.04a b c d 0.49±0.02a b c d 0.46±0.02a b c d 457.10±9.44a b c 0.94±0.04a b c

3 討論

胃癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。國(guó)家癌癥中心報(bào)告顯示，2015年中國(guó)胃癌發(fā)病率居惡性腫瘤第2位，較2013年明顯升高，病死率居惡性腫瘤第2位[8]。PLGC是正常黏膜向胃癌惡性轉(zhuǎn)化的一個(gè)重要階段，且具有雙向轉(zhuǎn)變的特點(diǎn)。因此，PLGC大鼠模型的成功建立與探索PLGC的發(fā)病機(jī)制、進(jìn)展過(guò)程及尋找行之有效的預(yù)防和治療方法意義重大。WNT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化及凋亡等過(guò)程，細(xì)胞發(fā)育、形態(tài)改變以及相鄰細(xì)胞之間的相互作用均與WNT信號(hào)通路密不可分。相關(guān)研究表明，WNT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路失衡、異?；罨俏赴┌l(fā)生的重要影響因素[8-12]，信號(hào)蛋白、跨膜受體、胞質(zhì)蛋白和核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子等是WNT信號(hào)通路的異?；罨蜃印６鳤xin和APC蛋白是WNT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要組成因子，其活性異常與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。WNT信號(hào)通路發(fā)生缺陷時(shí)可導(dǎo)致發(fā)育缺陷，而癌基因、抑癌基因或WNT信號(hào)通路成分的突變使該通路不恰當(dāng)?shù)丶せ疃鴮?dǎo)致消化道腫瘤發(fā)生，而在此過(guò)程中，Axin、APC蛋白呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)。

PLGC主要?dú)w屬中醫(yī)學(xué)“痞滿”范疇，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，中醫(yī)藥治療PLGC的療效顯著，并且可以達(dá)到細(xì)胞逆轉(zhuǎn)和腺體重建的作用[13-15]。本研究旨在對(duì)PLGC大鼠進(jìn)行干預(yù)治療，研究欣胃顆粒及其拆方后“益氣”“養(yǎng)陰”“化瘀”“解毒”各法及其組合對(duì)WNT信號(hào)通路關(guān)鍵因子AxinmRNA和APCmRNA表達(dá)的影響，有望優(yōu)化藥物組方，選擇可靠、有效的切入點(diǎn)，對(duì)腸上皮化生、異型增生等PLGC進(jìn)行阻斷和干預(yù)治療。本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠胃黏膜組織中AxinmRNA和APCmRNA相對(duì)表達(dá)量均降低（P＜0.05）；但中藥干預(yù)后，胃復(fù)春組和中藥各組大鼠胃黏膜組織中AxinmRNA和APCmRNA相對(duì)表達(dá)量均升高（P＜0.05），而且其調(diào)控改善效果由低到高依次為中藥單法組、中藥雙法組、中藥三法組、中藥四法組，表明中藥各法間可能存在協(xié)同作用，而中藥益氣養(yǎng)陰化瘀解毒四法組的調(diào)控作用最佳。

綜上所述，PLGC的基本病理機(jī)制多為本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜，中藥益氣養(yǎng)陰化瘀解毒法可顯著改善PLGC的狀態(tài)，對(duì)WNT信號(hào)通路上的Axin和APC因子的表達(dá)具有顯著調(diào)節(jié)作用，此作用靶點(diǎn)可作為中藥益氣養(yǎng)陰化瘀解毒法防治PLGC的機(jī)制之一，這也可為將來(lái)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供思路和研究基礎(chǔ)。