去氫駱駝蓬堿磁固體脂質(zhì)納米粒的處方和制備工藝的優(yōu)化

木尼熱·庫爾班，唐小慧，王 梅（新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011）

駱駝蓬（Peganum hannal L．）系蒺藜科多年生草本植物，是新疆地區(qū)道地藥材，已被列入維吾爾藥衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)維吾爾分冊。去氫駱駝蓬堿（harmine，HM）是從駱駝蓬的種子中提取的主要生物堿，研究表明，HM具有抗菌、抗瘧原蟲、抗真菌、抗氧化、抗腫瘤、抗誘變等一系列藥理作用[1-6]。固體脂質(zhì)納米粒（solid lipid nanoparticles，SLN）是以生理相容的高熔點(diǎn)脂質(zhì)為骨架材料，將藥物包裹在類脂核中或吸附于納米粒表面制成固體膠粒給藥系統(tǒng)。固體脂質(zhì)納米粒能改善藥物溶解性， 提高穩(wěn)定性，具有靶向性的特點(diǎn)，進(jìn)而達(dá)到提高藥效的作用[7]。磁性固體脂質(zhì)納米粒（magnetic solid lipid nanoparticles，MSLN）做為一種靶向給藥系統(tǒng)，是將磁納米粒裝載在固體脂質(zhì)納米粒中，在外加磁場的作用下，達(dá)到主動靶向 作用；本設(shè)計同時將藥物與磁納米粒裝載在固體脂質(zhì)納米粒中，改善藥物溶解性，提高穩(wěn)定性，在外加磁場的作用下，藥物被選擇性的送到特定靶部位，使藥物緩慢釋放，減少藥物劑量，降低對周圍正常組織的損傷，提高了治療效果[8-11]。因薄膜分散法制備的脂質(zhì)納米粒粒徑小，包封率高，本研究選用薄膜分散法為制備方法，并通過星點(diǎn)設(shè)計其基質(zhì)成分及工藝條件，以進(jìn)一步提高制劑的質(zhì)量，優(yōu)化制備工藝。

1 儀器與試劑

AB135-S 分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；UV2700 紫外可見分光光度儀（北京萊佰泰科儀器有限公司）；EYELAN-1100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；Malvern Z3000 粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司）；KQ-500DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；離心機(jī)（德國賽默飛世爾科技有限公司）。

去氫駱駝蓬堿原料藥（批號：442-51-3，含量≥98%，成都瑞芬思生物科技有限公司）；大豆卵磷脂（批號：20170715，藥用級，上海藍(lán)季科技有限公司）；單硬脂酸甘油酯（批號：20160912，上海山浦化工有限公司）；硬脂酸（美國Sigma公司）；山崳酸甘油酯（批號：20170924，法國佳法賽公司）；泊洛沙姆188（批號：201 70524，山東西亞化學(xué)股份有限公司）；膽酸鈉（上海麥克林生物科技有限公司）；Brij58（阿達(dá)瑪斯試劑公司）；磁納米粒（實(shí)驗室自制）；其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 HM-MSLN的包封率與載藥量的測定方法

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密稱取1.0 mg HM于10 mL容量瓶，甲醇定容至刻度，制備100.0 μg·mL-1的儲備液。精密吸取儲備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于10.0 mL容量瓶，甲醇定容，以濃度為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.2 HM-MSLN 的包封率與載藥量測定 包封率測定：將去氫駱駝蓬堿磁固體脂質(zhì)納米粒的混懸液置于EP管中，高速離心（4 ℃，轉(zhuǎn)速15 000 r·m in-1，離心時間50 min），取上清液于10 mL容量瓶甲醇定容，在300 nm處測定游離藥物吸光度，計算游離藥物量。另取一定量的去氫駱駝蓬堿磁固體脂質(zhì)納米?；鞈乙杭舆m量甲醇破乳測定吸光度，計算總藥物量。

包封率=（投藥量 - 游離藥物）/投藥量×100%。

載藥量測定：冷凍干燥法測定磁固體脂質(zhì)納米粒的載藥量，方法為精密量取去氫駱駝蓬堿磁固體脂質(zhì)納米粒的混懸液1 mL于EP管中高速離心（4 ℃，轉(zhuǎn)速15 000 r·min-1，離心時間50 min），取下層沉淀冷凍干燥，精密稱定上一步冷凍干燥粉末1.0 mg用甲醇溶解測定吸光度，計算載藥量。

載藥量=包封于納米粒中的藥物量/磁納米?？傎|(zhì)量×100%。

2.1.3 超速離心法和超濾離心法回收率試驗[12]精密稱取卵磷脂20.0 mg，硬脂酸60.0 mg于茄形瓶中加10 mL 乙醇超聲溶解即為油相；精密稱取泊洛沙姆20.0 mg，磁納米粒1.0 mg于燒杯中加20 mL超純水超聲溶解作為水相。將置于茄形瓶中的油相，以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮（50 ℃，0.05 MPa）蒸干后得到油膜，將1.0 mg·mL-1泊洛沙姆水溶液加入茄形瓶中超聲波清洗器超聲40 min（100 W），既得空白MSLN混懸液。

超速離心：取0.5 mL 空白磁固體脂質(zhì)納米粒于EP管中，從100.0 μg·mL-1HM對照品儲備液中分別取0.4、0.6、0.8 mL于上述含有0.5 mL空白脂質(zhì)納米粒中高速離心（4 ℃，轉(zhuǎn)速15 000 r·min-1，離心時間50 min），取上清液于10 mL容量瓶甲醇定容至刻度，300 nm測定吸光度，計算加樣回收率。

超濾離心：取0.5 mL空白磁固體脂質(zhì)納米粒于超濾離心管（截留量為10 kDa），從100.0 μg·mL-1HM對照品儲備液中分別取0.4、0.6、0.8 mL于上述含有0.5 mL空白磁固體脂質(zhì)納米粒中高速離心（4 ℃，轉(zhuǎn)速15 000 r·min-1，離心時間50 min），取下清液于10 mL容量瓶甲醇定容至刻度，300 nm測定吸光度，計算加樣回收率。

2.2 制備方法的篩選和處方及工藝優(yōu)化

2.2.1 制備方法篩選 采用薄膜超聲分散法、乳化溶劑揮發(fā)法、乳化超聲分散法、乳化低溫固化法進(jìn)行去氫駱駝蓬堿磁固體脂質(zhì)納米粒制備方法的篩選。

2.2.2 單因素考察 考察脂質(zhì)材料、脂質(zhì)材料與卵磷脂比、水相表面活性劑種類及質(zhì)量濃度、脂質(zhì)材料質(zhì)量濃度、去氫駱駝蓬堿用量、超聲時間、超聲功率對包封率的影響。

2.2.3 星點(diǎn)設(shè)計優(yōu)化[13-14]根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇對結(jié)果影響較顯著的3 個因素作為考察對象，即單硬脂酸甘油酯用量（X1），脂質(zhì)材料與卵磷脂之比（X2），油相水相之比（X3），因素取值范圍分別是X1為40 ～ 100 mg，X2為0.3 ～ 3；X3為0.3 ～ 2，以包封率（Y1）、載藥量（Y2）、粒徑（Y3）作為因變量（效應(yīng)值），采用星點(diǎn)響應(yīng)面法優(yōu)化處方。采用三因素五水平星點(diǎn)設(shè)計，實(shí)驗設(shè)計見表1。

表1 星點(diǎn)設(shè)計因素水平Tab 1 Factor level of star point design

3 結(jié)果

3.1 載藥量和包封率測定方法的確定

所得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為：Y = 19.216 X - 1.685 5（r ＞ 0.999）。結(jié)果表明去氫駱駝蓬堿在2 ～ 12 μg·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。超速離心法回收率試驗得到低、中、高濃度（2、6、8 μg·mL-1）的加樣回收率為100.4%、98.9%、98.5%，RSD 均小于2.0%。超濾離心法的加樣回收率為85.6%、91.2%、90.08%，RSD不符合要求。因此超速離心法精密度、準(zhǔn)確性良好，表明該方法可用于載藥量及包封率的測定。

3.2 制備方法的篩選

取4種方法制得的HM-MSLN混懸液，按照前述方法測定包封率、粒徑，實(shí)驗結(jié)果見表2。結(jié)果表明，采用乳化溶劑揮發(fā)法、薄膜超聲分散法制備的去氫駱駝蓬堿磁固體脂質(zhì)納米粒的包封率均在90%以上，而乳化低溫固化法、微乳超聲分散法的包封率分別為88.72%、73.52%；從粒徑結(jié)果看，薄膜超聲分散法所得混懸液的粒徑最小。結(jié)合包封率和粒徑兩個因素綜合考慮，乳化溶劑揮發(fā)法包封率最高，但有溶劑殘留導(dǎo)致固體脂質(zhì)納米粒的包封藥物降解，不適合工業(yè)化大生產(chǎn)等問題，所以最終選擇薄膜超聲分散法為HM-MSLN的制備方法。

表2 不同制備方法的HM-MSLN測定結(jié)果. n = 3Tab 2 Results of different preparation methods of HM-MSLN. n = 3

3.3 單因素考察

3.3.1 固體脂質(zhì)材料選擇 分別選用脂質(zhì)材料為單硬脂酸甘油酯、硬脂酸、山崳酸用量均為60.0 mg，卵磷脂20.0 mg，泊洛沙姆188用量為20.0 mg，磁納米粒1.0 mg，去氫駱駝蓬堿5.0 mg按“2.1.3”項下方法制備磁性脂質(zhì)納米粒，對其包封率進(jìn)行考察。上述不同脂質(zhì)材料用量的磁脂質(zhì)納米?；鞈乙喊础?.1.2”項下方法測定包封率。結(jié)果表明，以山崳酸甘油酯和單硬脂酸甘油酯為固體脂質(zhì)納米?？尚纬砂饴氏鄬^高，穩(wěn)定性較好的MSLN。但山崳酸甘油酯和硬脂酸為脂質(zhì)材料制備的磁固體脂質(zhì)納米粒有沉淀產(chǎn)生，不穩(wěn)定。以單硬脂酸甘油酯為脂質(zhì)材料制備的固體脂質(zhì)納米粒的包封率較高，無沉淀，穩(wěn)定性較好，因此脂質(zhì)材料選擇單硬脂酸甘油酯。

3.3.2 脂質(zhì)材料用量的選擇 單硬脂酸含量分別選用40.0、50.0、60.0、80.0、100.0 mg，泊洛沙姆188 20.0 mg，卵磷脂20.0 mg，磁納米粒1.0 mg，去氫駱駝蓬堿5.0 mg，按“2.1.3”項下方法制備磁性脂質(zhì)納米粒，按“2.1.2”項下方法對其包封 率進(jìn)行考察。單硬脂酸甘油酯用量為80 mg和100 mg磁脂質(zhì)納米粒有沉淀，而單硬脂酸甘油酯用量40 mg制備的磁脂質(zhì)納米粒均勻、穩(wěn)定且包封率最高。

3.3.3 表面活性劑的選擇 表面 活性劑分別為Brij58、膽酸鈉、泊洛沙姆188，用量均為20.0 mg，硬脂酸60.0 mg，卵磷脂20.0 mg，去氫駱駝蓬堿5.0 mg，磁納米粒1.0 mg，按“2.1.3”項下方法制備磁性脂質(zhì)納米粒，按“2.1.2”項下方法對其包封率進(jìn)行考察。結(jié)果表明，Brij58制備的磁脂質(zhì)納米粒放置后有沉淀，而膽酸鈉和泊洛沙姆188均無沉淀，穩(wěn)定性較好，但泊洛沙姆188制備的磁脂質(zhì)納米粒包封率更高，因此最佳表面活性劑選擇泊洛沙姆188。

3.3.4 泊洛沙姆188用量 精密稱取泊洛沙姆188用量為5.0、10.0、20.0、30.0 mg，單硬脂酸甘油酯60.0 mg，卵磷脂20.0 mg，去氫駱駝蓬堿5.0 mg，磁納米粒1.0 mg，按“2.1.3”項下方法制備磁性脂質(zhì)納米粒，按“2.1.2”項下方法對其包封率進(jìn)行考察。因20.0 mg和30.0 mg泊洛沙姆制備的磁性脂質(zhì)納米粒的包封率并沒差別，故選擇泊洛沙姆用量為20.0 mg。

3.3.5 去氫駱駝蓬堿用量 去氫駱駝蓬堿用量分別為5.0、10.0、20.0、30.0、40.0 mg，單硬脂酸甘油酯60.0 mg，卵磷脂20.0 mg，磁納米粒1.0 mg，泊洛沙姆20.0 mg，按“2.1.3”項下方法制備磁性脂質(zhì)納米粒，按“2.1.2”項下方法對其包封率進(jìn)行考察。當(dāng)去氫駱駝蓬堿的用量為30.0 mg和40.0 mg時，磁性脂質(zhì)納米粒有絮狀物出現(xiàn)，10.0 mg和5.0 mg時包封率較為接近，所以選擇去氫駱駝蓬堿用量為5.0 mg。

3.3.6 單硬脂酸甘油酯與卵磷脂的比例 單硬脂酸甘油酯與磷脂的比例以20∶60、30∶60、40∶60、60∶60、60∶40、60∶30、60∶20，卵磷脂20.0 mg，磁納米粒1.0 mg，泊洛沙姆20.0 mg，按“2.1.3”項下方法制備磁性脂質(zhì)納米粒，按“2.1.2”項下方法對其包封率進(jìn)行考察。星點(diǎn)設(shè)計階段選擇的藥脂比為0.3 ～ 3。

3.3.7 油相與水相比例 有機(jī)相與水相的比例（v∶v）以30∶20、20∶20、20∶10、30∶10、20∶30、10∶30、10∶20，卵磷脂20.0 mg，磁納米粒1.0 mg，泊洛沙姆20.0 mg按“2.1.3”項下方法制備磁性脂質(zhì)納米粒，按“2.1.2”項下方法對其包封率進(jìn)行考察。星點(diǎn)設(shè)計階段選擇的藥脂比為0.3 ～ 2。

3.3.8 超聲時間 制備HM-MSLN最后一步，分別采用超聲10、40、60 min進(jìn)行處理，去氫駱駝蓬堿用量為5.0 mg，單硬脂酸甘油酯60.0 mg，卵磷脂20.0 mg，磁納米粒1. 0 mg，泊洛沙姆20.0 mg按“2.1.3”項下方法制備磁性脂質(zhì)納米粒，按“2.1.2”項下方法對其包封率進(jìn)行考察。由結(jié) 果可知超聲時間對包封率并沒有太大的影響，為了縮短制備時間，選擇超聲時間為10 min。

3.3.9 超聲溫度 超聲時間10 min（冰浴/室溫），去氫駱駝蓬堿用量5.0 mg，單硬脂酸甘油酯60.0 mg，卵磷脂20.0 mg，磁納米粒1.0 mg，泊洛沙姆20.0 mg 按“2.1.3”項下方法制備磁性脂質(zhì)納米粒，按“2.1.2”項下方法對其包封率進(jìn)行考察。由結(jié)果可知超聲溫度對包封率并沒有顯著的影響，故超聲溫度選擇室溫。

3.3.10 超聲功率 超聲時間10 min，超聲溫度為室溫，超聲功率分別為40、60、100 W，去氫駱駝蓬堿用量5.0 mg，單硬脂酸甘油酯60.0 mg，卵磷脂20.0 mg，磁納米粒1.0 mg，泊洛沙姆20.0 mg按“2.1.3”項下方法制備磁性脂質(zhì)納米粒，按“2.1.2”項下方法對其包封率進(jìn)行考察。由結(jié)果可知超聲功率為60 W時包封率最高，故選擇超聲功率為60 W。

3.4 星點(diǎn)設(shè)計優(yōu)化試驗

3.4.1 星點(diǎn)設(shè)計試驗結(jié)果 根據(jù)三因素五水平（表）制備不同處方的去氫駱駝蓬堿磁固體脂質(zhì)納米粒，測定粒徑及載藥量，實(shí)驗結(jié)果見表3。

表3 星點(diǎn)設(shè)計試驗結(jié)果Tab 3 Results of star point design test

3.4.2 模型擬合 采用Design-Expert 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及效應(yīng)面處方優(yōu)化，分別以包封率（Y1）、載藥量（Y2）和粒徑（Y3）為因變量，以單硬脂酸甘油酯質(zhì)量（X1）、單硬脂酸甘油酯與卵磷脂質(zhì)量比（X2）、油水相之比（X3）為自變量進(jìn)行模型擬合，結(jié)果表明各因變量與自變量以二項式方程擬合時相關(guān)系數(shù)（R）最大，Y1、Y2、Y3二項式擬合方程分別為Y1=+96.1-0.74

3.4.3 響應(yīng)面分析 （1）對包封率的影響：單硬脂酸甘油酯的量，單硬脂酸甘油酯與卵磷脂之比對包封率都有顯著的影響。隨著脂 質(zhì)含量增加，包封率呈現(xiàn)出逐漸增大至一個最大值，然后開始有下降的趨勢。

（2）對載藥量的影響：單硬脂酸甘油酯量，單硬脂酸甘油酯與卵磷脂之比，油水相之比對載藥量有較顯著的影響。隨著脂質(zhì)含量增加，載藥量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。隨著單硬脂酸甘油酯與卵磷脂之比的增大，載藥量呈現(xiàn)增大的趨勢。

（3）對粒徑的影響：單硬脂酸甘油酯量，單硬脂酸甘油酯與卵磷脂之比，油水相之比對粒徑有較顯著的影響。隨著脂質(zhì)含量增加，粒徑呈現(xiàn)先增大后變小的趨勢。當(dāng)脂質(zhì)含量恒定時，藥物粒徑隨油水相之比增大呈增大趨勢。

3.4.4 優(yōu)化與驗證 以包封率、載藥量最大為目的，用擬合方程預(yù)測最優(yōu)條件。根據(jù)得到的最優(yōu)處方X1（單硬脂酸甘油酯：85），X2（單硬脂酸甘油酯與卵磷脂比例：2.3），X3（油相水相比例：0.97），按照薄膜分散法制備HM-MSLN ，測定藥物包封率和載藥量，與預(yù)測值進(jìn)行對比分析。由表4 可見，按照擬合得到的最優(yōu)處方制備得到HM-MSLN的包封率和載藥量，粒徑接近，表明模型的擬合較好。

表4 最優(yōu)處方的預(yù)測值與實(shí)測值Tab 4 Predicted and measured values of the optimal prescription

3.4.5 表征 室溫下，取適量納米粒懸浮液滴于覆蓋碳膜的銅網(wǎng)上，2%磷鎢酸復(fù)染，室溫下干燥，投射電子顯微鏡觀察納米結(jié)晶形態(tài)，結(jié)果見圖1，可知納米粒呈圓形，分布均勻。用超純水按適當(dāng)比例稀釋，激光粒度儀測定其粒徑，測得平均粒徑為162.7 nm，PDI為0.195。

4 討論

圖1 投射電鏡圖（×15 000）Fig 1 Transmission electron microscope image (×15 000)

本實(shí)驗對4種HM-MSLN制備方法進(jìn)行篩選，其中乳化低溫固化法與微乳超聲分散法的包封率低于乳化溶劑揮發(fā)法以及薄膜分散超聲法，薄膜超聲分散法與乳化溶劑揮發(fā)法包封率相近，但由于乳化溶劑揮發(fā)法容易導(dǎo)致有機(jī)溶劑殘留情況，而薄膜超聲分散法簡單容易制備，所得固體脂質(zhì)納米粒穩(wěn)定性較好，粒徑較小，因此選擇薄膜超聲分散法為HM-MSLN的制備方法。山崳酸甘油酯制備磁固體脂質(zhì)納米粒較其他脂質(zhì)材料制備的磁固體脂質(zhì)納米粒穩(wěn)定性差，容易沉淀。制備過程中山崳酸甘油酯在乙醇中加熱溶解（70 ℃），在50 ℃旋蒸溫度下有析出現(xiàn)象，而且加熱溶解過程中會使油相中的乙醇揮發(fā)，可能會對包封率有影響，所以選擇穩(wěn)定性好無沉淀的單硬脂酸甘油酯為脂質(zhì)材料。本實(shí)驗通過三因素五水平制備HMMSLN，所得實(shí)際制備結(jié)果與預(yù)測結(jié)果吻合性好，偏差小，因此本法所確定的制備HM-MSLN的最佳配比有一定的可行性，在今后的實(shí)驗中可進(jìn)一步探索HMMSLN的冷凍干燥制備工藝，旨為HM-MSLN確定可行的制劑種類提供理論參考。