無先兆偏頭痛患者血小板miRNA表達(dá)譜分析☆

潘建青 張玲玲 吳軍 孫武平 楊少敏 楊春水○☆

偏頭痛的發(fā)病機(jī)制還不十分清楚，目前主要有血管學(xué)說、神經(jīng)學(xué)說、三叉神經(jīng)血管學(xué)說等。近年來研究發(fā)現(xiàn)血小板中可表達(dá)多種miRNAs，通過與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’-UTR）互補(bǔ)結(jié)合調(diào)控血小板中一些膜蛋白受體和信號通路分子的表達(dá)，調(diào)節(jié)血小板的功能[1-2]。另外，血小板可以通過釋放膜結(jié)合微粒 （membrane-bound microparticles,MPs)的方式主動分泌miRNA，這些miRNA甚至能夠被轉(zhuǎn)運到其他細(xì)胞中發(fā)揮功能[3]。本研究收集了無先兆偏頭痛患者血小板樣本，提取血小板RNA后通過BGISEW-500 sequencing技術(shù)進(jìn)行測序，篩選差異表達(dá)miRNA，進(jìn)行了miRNA靶基因的功能分析。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2018年3月在本院神經(jīng)內(nèi)科門診治療的無先兆偏頭痛患者，所有入選患者均符合 2013年國際頭痛協(xié)會IHS發(fā)表的國際頭痛疾患偏頭痛診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。入選標(biāo)準(zhǔn)：①以頭痛為主訴，符合無先兆偏頭痛診斷標(biāo)準(zhǔn)；②首次偏頭痛發(fā)作年齡≤50歲；③病程≥1年；④近1個月以來，每個月頭痛發(fā)作次數(shù)2～6次；⑤年齡18～55歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并心血管、腦血管、肝、腎、造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾??；②精神病患者；③鎮(zhèn)痛藥物以及鎮(zhèn)靜催眠藥或酒精濫用者。

（2）統(tǒng)一分流：主要實現(xiàn)小流量匯聚，大流量拆分，同源同宿功能，同時具備簡單鏡像能力，可基于網(wǎng)絡(luò)層信息（如源IP地址、源端口號、目的IP地址、目的端口號、協(xié)議類型、、VlanID等）的規(guī)則復(fù)制流量提供給上層應(yīng)用。

納入無先兆偏頭痛患者5例，年齡性別匹配的健康對照5例。分別采集健康對照和偏頭痛患者發(fā)作期的抗凝全血10 mL。本研究經(jīng)過了倫理委員會批準(zhǔn)，患者本人簽署知情同意書。

數(shù)字化施工圖審查系統(tǒng)在具備施工圖審查業(yè)務(wù)模塊之外，增加對勘察設(shè)計行業(yè)信息采集和監(jiān)督管理板塊，有利于建設(shè)行政主管部門全面了解勘察設(shè)計產(chǎn)業(yè)狀況和從業(yè)單位人員信用情況，進(jìn)一步提升對勘察設(shè)計行業(yè)的有效監(jiān)管，規(guī)范勘察設(shè)計市場秩序。

2.2 miRNA的表達(dá)定量基于每個樣品比對上基因組的 tag數(shù)，我們使用 TPM（Trans Per Million）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。圖1A所示，每個樣品的表達(dá)量數(shù)據(jù)分布情況基本相似，表明本實驗對miRNA的定量數(shù)據(jù)可靠。如圖1B所示，通過Pearson檢驗對每個樣品比對上基因組的定量數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組與實驗組的組內(nèi)各個重復(fù)樣品的Pearson相關(guān)系數(shù)較高。

3）在內(nèi)容方面。課程內(nèi)容專業(yè)性不足，學(xué)科教育仍停留在單一學(xué)科分立的狀態(tài)，不同學(xué)科壁壘仍未打通。在創(chuàng)新性方面仍有待提高，現(xiàn)有內(nèi)容仍停留在車模、航模、船模與開源硬件、機(jī)器人等工程技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)老舊的內(nèi)容，這與當(dāng)前國家科技創(chuàng)新快速發(fā)展，經(jīng)濟(jì)布局從勞動密集型向技術(shù)密集型轉(zhuǎn)型的局勢脫離。

1.2.1 分離血小板 采用天津灝洋華科生物科技有限公司試劑盒，具體步驟如下：在15 mL離心管加入8 mL血小板分離液，在分離液上層加入4ml抗凝全血，300 g離心15 min。取最上面的血小板血漿層到新的15 mL離心管，加入同體積的樣本稀釋液，混勻后500 g離心20 min。向沉淀中加入10 mL清洗液，混勻后450 g離心15 min，棄上清后加入160 μL MACS緩沖液（德國美天旎），充分混懸。

1.2.2 磁珠法純化血小板 在血小板混懸液中加入40 μL CD45 MicroBeaD 磁珠 （德國美天旎），20℃孵育15 min，加入2 mL MACS緩沖液，混勻后300 g離心 10 min，去上清，加入 500 μL MACS 緩沖液重懸。將 Midi MACS分離磁鐵安裝到 MACS多用支架上，并將 LD柱（德國美天旎Miltenyi）放到磁體中，在分選柱下放一支無菌的 15 mL離心管。用 4°C不含氣體的 MACS緩沖液沖洗分選柱3次，每次 3 mL。棄洗脫液，在分選柱下方放置一支干凈的無菌離心管。將500 μL血小板重懸液加入LD柱，用2 mL MACS緩沖液洗脫，收集洗脫液。300 g離心10 min，棄上清得到純化的血小板。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法使用比對軟件AASRA[5]將clean reads比對到參考基組和其他miRNA數(shù)據(jù)庫，miRDeep2[6]進(jìn)行新的 miRNA預(yù)測，TPM[7]標(biāo)準(zhǔn)化miRNA的表達(dá)水平，DEGseq，MA-plot計算差異表達(dá)。ClusterProfiler[8]（統(tǒng)計檢驗方法為Hypergeometric Test）進(jìn)行miRNA的靶基因功能分析，可視化使用ggplot2[9]。

首先是藥品智能化物流管理系統(tǒng)。藥品供應(yīng)是醫(yī)療保障的重要部分，醫(yī)院采用了先進(jìn)的藥品智能化物流管理系統(tǒng)，實現(xiàn)了藥品采購計劃生成智能化、采購計劃網(wǎng)上傳輸、藥庫庫位智能化管理、藥庫主動補(bǔ)貨、藥房藥品智能發(fā)放、藥品追溯等功能。有效提高了藥品供應(yīng)效率，減少了人為因素。

1.2.3 Trizol提取總RNA將血小板沉淀中加入1mL Trizol（美國 Invitrogen），吹打充分混勻，20°C裂解10 min。加入200 μL體積的氯仿，混勻，20°C靜置 15 min。4°C 12000 g離心 15 min，吸取上層水相至另一離心管中，加入等體積異丙醇，充分混勻，4°C 靜置 15 min，12000 g 離心 10 min，棄上清。加入1 mL75%乙醇懸浮沉淀，4°C 8000g離心5 min，棄上清。室溫干燥 5 min。加入 30 μL DEPC處理水溶解10 min。測量RNA濃度。將RNA保存于-80°C。

2 結(jié)果

2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)后將clean tag與已知的 miRNA 數(shù)據(jù)庫（miRBase、Rfam、siRNA、piRNA、snoRNA等）進(jìn)行比對。每個樣品的比對Percentage均大于93%，表明說明sRNA文庫的構(gòu)建是合格的，所獲得的數(shù)據(jù)能滿足進(jìn)一步分析的要求。

ICP-MS法同時測定林下西洋參和園地栽培西洋參中14種微量元素的含量 ……………………………… 林紅強(qiáng)等（16）：2203

1.2 方法

圖1 各樣品表達(dá)定量的TPM值分布和Pearson相關(guān)系數(shù)熱圖

2.4 miRNA靶基因預(yù)測和GO顯著性富集分析使用TargetScan與miRanda軟件預(yù)測miRNA的靶基因，然后對兩個軟件的預(yù)測結(jié)果進(jìn)行布爾運算，選取兩者的交集2479800個靶基因作為本實驗的預(yù)測結(jié)果。使用ClusterProfiler對差異小RNA的靶基因進(jìn)行GO顯著性富集分析，并展示了生物過程，細(xì)胞組成，分子功能的前20個最顯著的GO Term。圖4展示了富集最顯著的20個GO term與富集到GO term上的差異基因個數(shù)分布情況。

1.2.4 RNA樣本檢測 RNA樣品委托華大基因由BGISEQ-500測序技術(shù)進(jìn)行測序。

圖2 偏頭痛組和對照組對比的火山噴發(fā)圖

圖3 偏頭痛組和對照組對比部分差異表達(dá)miRNA熱圖

2.3 篩選差異表達(dá)miRNA通過比較樣品之間的表達(dá)量，篩選差異表達(dá)miRNA，為后續(xù)分析提供基礎(chǔ)，使用DEGseq對差異miRNA進(jìn)行篩選。如圖2，所示我們總共篩選到821個差異表達(dá)的miRNA，圖3展示了前50個最顯著的差異表達(dá)miRNA的表達(dá)情況。

圖4 偏頭痛組和對照組對比差異表達(dá)miRNA靶基因的基因本體論功能分析(p值矯正方法為“Benjamini”)(A)生物過程；(B)細(xì)胞組成；(C)分子功能

利用ClusterProfiler對差異小RNA的靶基因進(jìn)行KEGG pathway富集分析。如圖5富集到的通路主要是軸突導(dǎo)向（Axon guidance）。

3 討論

偏頭痛的發(fā)病機(jī)制還不明確，很多研究發(fā)現(xiàn)，偏頭痛與血小板功能的關(guān)系密切[10]。本研究比較了偏頭痛患者和正常對照的血小板小RNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)了821個差異表達(dá)的小RNA，通過TargetScan與miRNA軟件預(yù)測miRNA的靶基因，對靶基因進(jìn)行GO顯著性富集分析，發(fā)現(xiàn)影響到的靶基因主要涉及到軸突發(fā)育、突觸可塑性、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)、基因組修飾等相關(guān)功能反應(yīng)。KEGG pathway富集分析到的通路主要是軸突導(dǎo)向等通路。

血小板microRNA與偏頭痛相關(guān)性的研究還未見文獻(xiàn)報道，目前有幾個研究涉及了循環(huán)microRNA與偏頭痛的關(guān)系：CHENG等[11]研究了偏頭痛患者4個內(nèi)皮功能相關(guān)的循環(huán)血microRNA(miR-155,miR-126,miR-21，Let-7g)， 發(fā)現(xiàn) miR-155,miR-126和let-7g的表達(dá)上調(diào)，這些microRNA在有先兆偏頭痛患者的表達(dá)水平相比無先兆偏頭痛患者顯著更高。ANDERSEN等[12]分析了24個偏頭痛患者和健康對照的血清microRNA表達(dá)譜（包含 372個 microRNA），發(fā)現(xiàn) 32個 microRNA表達(dá)有差異，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)在偏頭痛發(fā)作期miR-34a-5p和 miR-382-5p表達(dá)明顯上調(diào)，而且miR-382-5p在發(fā)作期和間歇期均上調(diào)。TAFURI等[13]分析了15個女性無先兆偏頭痛患者和健康對照的10個循環(huán)microRNA的表達(dá)情況（miR-22,miR-26a,miR-26b,miR-27b,miR-29b,let-7b,miR-181a,miR-221,miR-30b,and miR-30e），發(fā)現(xiàn)偏頭痛患者血液循環(huán)中miR-27b明顯上調(diào)，miR-181a,let-7b和miR-22表達(dá)明顯下調(diào)，而在單個核細(xì)胞中miR-22和let-7b表達(dá)下調(diào)。

圖5 偏頭痛組和對照組對比差異表達(dá)miRNA靶基因的KEGG信號通路富集分析(P值矯正方法為“Benjamini”)

以上幾個研究顯示 miR-155-5p，Let-7g，miR-22-3p在循環(huán)中的表達(dá)有差異性，本研究發(fā)現(xiàn)上述microRNA在無先兆偏頭痛患者血小板中的表達(dá)也有差異性，提示這3個microRNA可能與偏頭痛的發(fā)生關(guān)系密切。

本研究發(fā)現(xiàn)無先兆偏頭痛患者具有特定的血小板miRNA表達(dá)譜，具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。