86份酸棗種質(zhì)資源篩選和遺傳多樣性分析

李世鵬 陳葉 郭明欣 田珊 劉紅霞 趙旭升

摘要 [目的]綜合酸棗種質(zhì)資源主要農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)和遺傳多樣性分析結(jié)果，篩選優(yōu)良酸棗種質(zhì)資源。[方法]對(duì)86份酸棗種質(zhì)資源的15個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行表型鑒定，并利用9個(gè)ISSR標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析。[結(jié)果]通過對(duì)15個(gè)農(nóng)藝性狀綜合評(píng)價(jià)，從86份酸棗種質(zhì)資源中篩選出5份優(yōu)良種質(zhì)資源。9對(duì)ISSR引物共擴(kuò)增出20條多態(tài)性條帶，多態(tài)性信息量（polymorphism information content，PIC）為0.60～0.81，平均值為0.70。在遺傳系數(shù)0.57的水平上86份酸棗種質(zhì)資源被分為兩大類，其中79份種質(zhì)資源聚為A類，7份種質(zhì)資源聚為B類。[結(jié)論]該研究為酸棗種質(zhì)資源分類、鑒定和新品種選育等提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 酸棗;農(nóng)藝性狀;ISSR標(biāo)記;遺傳多樣性

中圖分類號(hào) S603文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）11-0051-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.11.017

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract [Objective] The main agronomic traits and genetic diversity analysis results were studied to screen the excellent sour jujube germplasm resources.[Method] 15 agronomic traits of 86 sour jujube germplasm resources were identified，and 9 intersimple sequence repeat （ISSR） primers were used for genetic diversity analysis.[Result] Through the comprehensive evaluation of 15 agronomic traits，5 excellent germplasm resources were selected from 86 sour jujube individuals.A total of 20 polymorphic bands were amplified by 9 ISSR primers.The polymorphism information content （PIC） ranged from 0.60 to 0.81 with an average of 0.70.Clustering analysis showed that the 86 sour jujube germplasm resources could be divided into 2 groups at the genetic similarity coefficient of 0.57，79 sour jujube individuals were grouped into class A and 7 sour jujube individuals were grouped into class B.[Conclusion] This study provides a useful basis for the classification，identification and variety selection of sour jujube germplasm resources.

Key words Sour jujube;Agronomic traits;ISSR;Genetic diversity

基金項(xiàng)目 河南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（162300410198）;河南省科技開放合作計(jì)劃項(xiàng)目（172106000049）。

作者簡介 李世鵬（1986—），男，河南開封人，講師，博士，從事棗樹遺傳育種研究。*通信作者，教授，碩士，從事林木育種研究。

收稿日期 2018-12-07

酸棗（Z.acidojujuba C.Y.Cheng et M.J.Liu）為鼠李科（Rhamnaceae）棗屬（Ziziphus Mill）植物，原產(chǎn)于我國，主要分布于我國北方各省，多生長于丘陵、山區(qū)[1-2]。 酸棗是栽培棗的原始野生種，具有耐旱、耐寒、耐堿等特點(diǎn)，是栽培棗最主要的砧木[3-5]。酸棗仁具有較高的藥用價(jià)值，味酸、性平，具有補(bǔ)肝寧心、鎮(zhèn)靜安神、斂汗、生津等功效，是一種藥食同源食品[6]。《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載酸棗能夠治療“心腹寒熱，邪結(jié)氣聚，四肢酸痛濕痹”，可以起到“安五臟，輕身延年”的作用?，F(xiàn)代藥理研究表明，酸棗仁含有皂苷、黃酮、生物堿和脂肪酸等多種活性物質(zhì)[7-12]。

酸棗類型眾多，種植資源豐富。楊雷[13]對(duì)149份酸棗種質(zhì)資源的生物學(xué)性狀和營養(yǎng)成分進(jìn)行了系統(tǒng)分析，從中篩選出10份可用于鮮食、加工用的種質(zhì)資源。孫亞強(qiáng)等[14]對(duì)60份酸棗資源的7個(gè)果實(shí)表型性狀和13個(gè)品質(zhì)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，酸棗主要農(nóng)藝性狀遺傳變異豐富能夠?yàn)闂棙溆N提供優(yōu)良的親本材料和嫁接砧木。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，人們開始利用分子標(biāo)記對(duì)酸棗的遺傳多樣性進(jìn)行研究。張春梅[15]利用雙抑制PCR技術(shù)開發(fā)了10對(duì)酸棗SSR多態(tài)性引物，并對(duì)43份酸棗材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析。張鵬飛等[16]利用7個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)16份棗品種和17份酸棗材料的遺傳多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，酸棗的遺傳多樣性高于棗，酸棗與棗之間基因交流比較頻繁。

ISSR（intersimple sequence repeat）簡單序列重復(fù)技術(shù)是一種基于微衛(wèi)星序列的分子標(biāo)記，以16～25 bp的重復(fù)序列作為引物擴(kuò)增相鄰反向重復(fù)序列之間的區(qū)域[17]。ISSR具有操作簡便、無需預(yù)知基因組序列、引物多態(tài)性高等特點(diǎn)，是研究遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化生物學(xué)的一種快速、簡單且廉價(jià)的方法[18]。棗基因組包含高密度簡單序列重復(fù)序列[19]，因此非常適合使用ISSR標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析。筆者對(duì)收集的86份酸棗種質(zhì)資源的單果重、可食率、果實(shí)風(fēng)味等15個(gè)主要果實(shí)性狀進(jìn)行分析，并利用ISSR標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在為酸棗種質(zhì)資源創(chuàng)新、新品種選育和分子標(biāo)記輔助育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 86份酸棗種質(zhì)資源收集于新疆、河南、山西等地區(qū)，于2016年嫁接到洛陽師范學(xué)院棗樹種質(zhì)資源圃。供試材料編號(hào)為US01～86。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 果實(shí)性狀調(diào)查。

2017年9月下旬至10月上旬收集各供試材料脆熟期棗果用于表型性狀調(diào)查。調(diào)查果實(shí)性狀包括單果重、果實(shí)縱徑、果實(shí)橫徑、果形指數(shù)、單核重、果核縱徑、果核橫徑、果核指數(shù)和可食率9個(gè)果實(shí)品質(zhì)性狀;果肉質(zhì)地、粗細(xì)、風(fēng)味、汁液和異味5個(gè)感官性狀。各性狀調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)參照《棗種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[20]。

1.2.2 DNA提取與檢測。

2017年5月中旬采集各供試材料的幼嫩葉片1～2 g，采用CTAB法[21]提取基因組總DNA。用NanoDrop2000檢測DNA質(zhì)量，并稀釋至50 ng/μL。

1.2.3 ISSR引物合成與分析。

根據(jù)British Columbia大學(xué)公布的100條ISSR引物，由華大基因公司合成。PCR反應(yīng)體系（10 μL）：2.0 μL基因組DNA，0.4 μL引物（10 μmol/L），0.8 μL dNTP （2.5 mmol/L），1.0 μL 10×Buffer，0.2 μL Taq DNA Polymerase （Solarbio公司）和 5.6 μL ddH2O。ISSR擴(kuò)增在Applied Biosystems公司2720 Thermal Cycler型PCR儀上進(jìn)行。ISSR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性 3 min，然后94 ℃變性30 s，50/55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min， 35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，在凝膠成像分析儀（BIORADGEIDOCXR+）下拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的相對(duì)位置，對(duì)多態(tài)性條帶進(jìn)行記錄，分別以“1”和“0”表示同一位置條帶的有無，建立原始數(shù)據(jù)，用NTSYSpc 2.10e軟件進(jìn)行聚類分析[22]。

ISSR位點(diǎn)的多態(tài)性信息量（polymorphism information content，PIC）按如下計(jì)算公式進(jìn)行計(jì)算： PIC=1-Pi2，式中，Pi 表示第i個(gè)等位位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸棗資源果實(shí)品質(zhì)性狀分析

對(duì)收集的86份酸棗資源的單果重、果實(shí)縱徑、果實(shí)橫徑、果形指數(shù)、單核重、果核縱徑、果核橫徑、果核指數(shù)和可食率9個(gè)重要果實(shí)性狀進(jìn)行分析（圖1）。結(jié)果表明，單果重變異系數(shù)最高，為42.09%，變異范圍為0.99～11.37 g;單核重變異系數(shù)次之，為27.66%，變異范圍為0.19～0.87 g?？墒陈实淖儺愊禂?shù)最小，為491%，變異范圍為69.95%～95.00%。其他果實(shí)品質(zhì)性狀的變異系數(shù)在10.81%～19.10%（表1）。

47卷11期李世鵬等 86份酸棗種質(zhì)資源篩選和遺傳多樣性分析

通過分析果肉質(zhì)地、粗細(xì)、風(fēng)味、汁液和異味5個(gè)感官性狀對(duì)上述種質(zhì)資源進(jìn)行口感綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，果肉質(zhì)地以致密為主，其中較致密和致密型所占比例分別為43.0%和24.4%。果肉粗細(xì)以中等為主，所占比例為62.8%。果肉汁液以中等或偏少為主，汁液較多的種質(zhì)僅占3.5%。果實(shí)風(fēng)味以酸、酸甜為主，風(fēng)味較好的甜酸型占19.8%，未發(fā)現(xiàn)甜型的酸棗材料。少部分酸棗（20.9%）存在苦味或青草味等異味（表2）。

上述結(jié)果表明，酸棗種質(zhì)資源遺傳變異豐富，綜合上述9個(gè)果實(shí)品質(zhì)性狀和5個(gè)口感性狀，從中篩選出5份大果型、可食率高、口感好的優(yōu)良種質(zhì)資源（表3）。

2.2 酸棗種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

為了進(jìn)一步研究酸棗種質(zhì)資源的遺傳多樣性，利用ISSR標(biāo)記對(duì)86份酸棗種質(zhì)資源的遺傳變異和親緣關(guān)系進(jìn)行研究。利用12份酸棗種質(zhì)資源對(duì)100個(gè)ISSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，從中篩選出25個(gè)能擴(kuò)增出多態(tài)性條帶的引物（圖2）。根據(jù)擴(kuò)增效果，從中選出9個(gè)多態(tài)性和重復(fù)性好的引物用于86份酸棗種質(zhì)資源的分析（表4）。9個(gè)引物在86份種質(zhì)中共擴(kuò)增出29條帶，其中多態(tài)性條帶為20條，占總條帶數(shù)的69%。每個(gè)引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)為2～5條，平均條帶數(shù)為3.2條。每個(gè)引物具有多態(tài)性條帶2～3條，平均多態(tài)性條帶數(shù)為2.2條。各引物PIC值為060～0.81，平均值為0.70。

基于9對(duì)ISSR引物的擴(kuò)增結(jié)果，對(duì)86份酸棗種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析。由圖3可知，86份種質(zhì)資源在遺傳系數(shù)0.57的水平上被分為兩大類。A類包括79份種質(zhì)資源，B類包括剩余的7份種質(zhì)資源。A類種質(zhì)資源在遺傳系數(shù)0.62的水平上進(jìn)一步被分為4個(gè)亞類：A-1包括37份種質(zhì)資源，A-2包括38份種質(zhì)資源，A-3和A-4分別包括3份和1份種質(zhì)資源。B類種質(zhì)資源在遺傳系數(shù)0.59的水平上被進(jìn)一步分為2個(gè)亞類，B-1和B-2分別包括5份和2份種質(zhì)資源。5份優(yōu)良種質(zhì)資源中US60屬于A-1亞類，US40、US51和US86屬于A-2亞類，US73屬于B-1亞類，遺傳系數(shù)在0.56～0.80。

Note：M.D2000 plus DNA Ladder

3 結(jié)論與討論

酸棗多為灌木或小喬木，抗逆性極強(qiáng)，且酸棗仁具有較高的藥用價(jià)值[24]。武媛林[25]對(duì)62份酸棗種質(zhì)資源的果實(shí)性狀、營養(yǎng)成分及其種仁的生物學(xué)性狀、藥用成分含量等進(jìn)行了系統(tǒng)分析，將酸棗分為適合于鮮食、藥用、鮮食藥用兼用3種類型。王僧虎等[26]從邢臺(tái)山區(qū)的野生酸棗資源中選育出一個(gè)優(yōu)良加工制汁、藥用酸棗新品種邢州1號(hào)。邢州1號(hào)質(zhì)地致密、較脆、汁液適中、味酸甜，平均單果重3.0 g，可食率81.2%。王春桐[27]從山東濟(jì)南南部山區(qū)野生酸棗資源中篩選出一個(gè)極早熟鮮食新品種‘脆酸棗。該品種肉質(zhì)致密、脆、汁液多、酸甜適口，單果重6.1 g，可食率87%。張建英等[28]從野生酸棗中篩選到2個(gè)優(yōu)良酸棗鮮食品種：‘藍(lán)貓1號(hào)和‘藍(lán)貓2號(hào)。2個(gè)品種單果重為4.86和4.78 g，可食率均為89%。上述研究篩選到的酸棗品種與棗樹主要栽培種相比果實(shí)較小、可食率較低[25-28]。該研究從86份酸棗種質(zhì)資源中篩選出5份優(yōu)良鮮食酸棗種質(zhì)資源。其中，US86單果重達(dá)11.17 g，可食率為95%，這說明酸棗優(yōu)良品種選育仍有較大的潛力。

酸棗分布廣泛、表型變異豐富，目前酸棗新品種的選育主要依靠形態(tài)學(xué)鑒定。利用分子標(biāo)記構(gòu)建酸棗種質(zhì)資源的指紋圖譜有助于酸棗種質(zhì)資源的鑒定。根據(jù)25個(gè)ISSR引物的擴(kuò)增結(jié)果，選擇PIC值最高的4個(gè)引物JISSR11、JISSR25、JISSR43和JISSR47可以鑒定出63份酸棗種質(zhì)資源。這些特異性條帶可以作為酸棗種質(zhì)資源鑒定和新品種選育的分子依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 曲澤洲，王永惠.中國果樹志：棗卷 [M].北京：中國林業(yè)出版社，1993.

[2] 張春梅.酸棗SSR引物開發(fā)及遺傳多樣性研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013.

[3] 劉孟軍，汪民.中國棗種質(zhì)資源[M].北京：中國林業(yè)出版社，2009.

[4] ISLAM M B，SIMMONS M P.A thorny dilemma：Testing alternative intrageneric classifications within Ziziphus （Rhamnaceae）[J].Systematic botany，2006，31（4）：826-842.

[5] ZHANG C M，HUANG J，YIN X，et al.Genetic diversity and population structure of sour jujube，Ziziphus acidojujuba[J].Tree genetics & genomes，2015，11（1）：809.

[6] 南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典：下冊(cè)[S].2版.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006：3577-3579.

[7] 張雪，丁長河，李和平.酸棗仁的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2009，30（3）：348-350.

[8] 張明春，解軍波，李婷，等.復(fù)合酶法提取酸棗仁黃酮研究[J].食品科學(xué)，2008，29（9）：174-177.

[9] 王衛(wèi)記，羅建光，孔令義.HPLC-ESI-MSn分析酸棗仁有效部位的化學(xué)成分[J].中國中藥雜志，2009，34（21）：2768-2772.

[10] 趙連紅，喬衛(wèi)，許嵐.酸棗仁中生物堿抗驚厥作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].天津藥學(xué)，2007，19（1）：4-5.

[11] 耿欣，李廷利.酸棗仁主要化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2016，44（5）：84-86.

[12] 閆艷，杜晨暉，李小菊，等.HPLC-DAD-ELSD法同時(shí)測定酸棗仁中斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和B的含量[J].藥物分析雜志，2011，31（1）：30-33.

[13] 楊雷.酸棗種質(zhì)資源果實(shí)營養(yǎng)成份分析及種質(zhì)評(píng)價(jià)[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[14] 孫亞強(qiáng)，吳翠云，王德，等.酸棗種質(zhì)資源果實(shí)若干性狀的多元統(tǒng)計(jì)分析[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，27（12）：29-32.

[15] 張春梅.酸棗SSR引物開發(fā)及遺傳多樣性研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013.

[16] 張鵬飛，尉東峰，劉亞令，等.棗與酸棗的SSR遺傳多樣性研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2015，30（2）：150-155.

[17] ZIETKIEWICZ E，RAFALSKI A，LABUDA D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics， 1994，20（2）：176-183.

[18] REDDY M P，SARLA N，SIDDIQ E A.Inter simple sequence repeat （ISSR） polymorphism and its application in plant breeding[J].Euphytica，2002，128（1）：9-17.

[19] LIU M J，ZHAO J，CAI Q L，et al.The complex jujube genome provides insights into fruit tree biology[J].Nature communications，2014，5：1-14.

[20] 李登科.棗種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006.

[21] LIAN C L，WADUD M A，GENG Q F，et al.An improved technique for isolating codominant compound microsatellite markers[J].Journal of plant research，2006，119（4）：415-417.

[22] ROHLF F J.NTSYSpc：Numerical taxonomy system.Ver.2.1[M].New York：Applied Biostatistics Inc.，1998.

[23] BOTSTEIN D，WHITE R L，SKOLNICK M，et al.Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J].American journal of human genetics，1980，32（3）：314-331.

[24] 曹景權(quán)，許向一.野生酸棗的類型與利用[J].河北果樹，2011（1）：49-50.

[25] 武媛林.酸棗種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)及選優(yōu)[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[26] 王僧虎，石曉云.酸棗優(yōu)良新品種邢州1號(hào)的選育[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（20）：4545-4548.

[27] 王春桐.酸棗極早熟新品種脆酸棗的選育[J].中國果業(yè)信息，2008（1）：55.

[28] 張建英，毛向紅，張瑩瑩，等.酸棗新品種‘藍(lán)貓1號(hào)和‘藍(lán)貓2號(hào)的選育[J].果樹學(xué)報(bào)，2017，34（6）：775-777.