基于UPLC-Q-TOF-MS的植物乳桿菌 P-8發(fā)酵乳代謝物輪廓分析

王越男,米智慧,李常坤,潘 琳,孫志宏,孫天松

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室,農(nóng)業(yè)部奶制品加工重點實驗室,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

發(fā)酵乳是一種營養(yǎng)豐富、對人體健康有益的功能性乳制品,主要以新鮮的牛奶為原料,經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵制成[1-2]。目前,用于酸奶生產(chǎn)的乳酸菌主要有保加利亞乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)[3-4]。長期食用發(fā)酵乳可有效抑制腸道內(nèi)有害微生物、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、輔助降血壓、降低血清膽固醇水平、提高免疫力、抑制腫瘤和緩解乳糖不耐癥等[4-7]。

代謝組學(xué)(metabolomics或metabonomics)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后興起的系統(tǒng)生物學(xué)的一個新分支,是通過考察生物體系受刺激或擾動后(如將某個特定的基因變異或環(huán)境變化后)其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時間的變化,來研究生物體系代謝途徑的一種技術(shù)[8-10]。其已被廣泛應(yīng)用于藥物科學(xué)[11-12]、食品科學(xué)和營養(yǎng)科學(xué)[13]等領(lǐng)域。目前代謝組學(xué)方法的分析技術(shù)主要有高分辨率質(zhì)子核磁共振(NMR)譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)和氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)技術(shù)[14-15]等。而LC-MS和GC-MS代謝組學(xué)技術(shù)因具有高通量和高靈敏度的特性,已經(jīng)廣泛用于乳制品中代謝物的定性和定量測定[15-17]。發(fā)酵乳是由幾百種生物分子組成的一個復(fù)雜的食品體系,主要包括蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物和許多其他小分子化合物,如氨基酸、有機酸、核酸、脂肪酸、礦物質(zhì)和風(fēng)味物質(zhì),但是目前采用單一的分析平臺無法全面地測定出發(fā)酵乳中所有的代謝物[18]。應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)能夠監(jiān)測不同發(fā)酵劑所發(fā)酵的制品在發(fā)酵和貯藏過程中代謝物的變化。Frank A. M. de Bok等[19]分析了不同混合發(fā)酵劑酸乳樣品的芳香物質(zhì)代謝圖譜,研究發(fā)現(xiàn)很多來源于關(guān)鍵風(fēng)味的質(zhì)量峰在單個菌株或其制品中沒有,而在混合菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中濃度較高,這種方法可以用來鑒定不同的風(fēng)味物質(zhì)是否來自不同的菌株或混合菌株,并作為其特有菌株的潛在生物標(biāo)記物。

益生菌LactobacillusplantarumP-8(簡稱P-8)是2005年內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室從內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗草原上牧民家庭的自然發(fā)酵酸牛乳中分離而來,具有調(diào)節(jié)血脂、抗氧化等益生作用[20]。2009年采用鳥槍法對L.plantrumP-8進行了全基因組序列分析和功能基因分析(CP005942)[21]。普通發(fā)酵乳所用菌種(保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌)對胃液的低pH和膽汁非常敏感,難以以活菌的形式到達腸道。而以乳桿菌屬和雙歧桿菌屬為主的益生菌則不同,能夠到達人體腸道并發(fā)揮調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡,改善腸道菌群,降低膽固醇等作用。本實驗在商業(yè)發(fā)酵劑YC-X11中添加益生菌L.plantarumP-8混合發(fā)酵制備發(fā)酵乳,并采用超高效液相色譜和四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time of flight-mass spectrometry,UPLC-Q-TOF-MS)結(jié)合主成份分析(PCA)分析其達發(fā)酵終點(pH4.5)的代謝物圖譜,找出其主要差異代謝物,以探究其潛在的生物標(biāo)記物,為功能性發(fā)酵乳的研發(fā)及其產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L.plantarumP-8 由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室提供;商業(yè)發(fā)酵劑YC-X11(含S.thermophilus和L.delbrueckiisubsp.Bulgaricus) 德國科漢森公司;脫脂乳粉 新西蘭恒天然有限公司;乙腈、甲酸 MS級,美國Fisher Scientific公司;氫氧化銨、亮氨酸腦啡肽 MS級,美國Sigma公司。

Acquity UPLC Xevo Q-TOF超高效液相-四級桿-飛行時間質(zhì)譜儀(配備有在線脫氣系統(tǒng)、二元梯度高壓泵、自動進樣器和PDA檢測器) 美國Waters公司;Eppendorf真空濃縮儀、Eppendorf 5810 R臺式冷凍離心機 德國艾本德公司;Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵乳的制備 還原牛乳(脫脂乳粉11%)經(jīng)95 ℃、5 min巴氏殺菌后,冷卻至37 ℃,加入L.plantarumP-8和商業(yè)發(fā)酵劑YC-X11,于37 ℃恒溫培養(yǎng),其中L.plantarumP-8接種量和商業(yè)發(fā)酵劑YC-X11添加量分別為1.0×107CFU/mL和0.003%,發(fā)酵至pH4.5終止。并將上述發(fā)酵乳-80 ℃保存,備用。

1.2.2 UPLC-Q-TOF MS代謝物圖譜分析

1.2.2.1 發(fā)酵乳樣品的預(yù)處理 將-80 ℃的發(fā)酵乳樣品置于室溫下解凍,解凍后經(jīng)4500×g離心10 min,取上清液2 mL,加入乙腈溶液14 mL,漩渦振蕩2 min,經(jīng)頻率40 kHz和功率300 W超聲提取5 min后12000×g高速離心15 min,取上清液置于真空濃縮儀,運行模式為水溶性溶劑、轉(zhuǎn)速為1400 r/min、功率為150 W的室溫條件下濃縮干燥,樣品干燥后加入500 μL 40%(v/v)的乙腈溶液復(fù)溶[22]。經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后置于進樣瓶中,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 UPLC-Q-TOF-MS分析 使用ACQUITY UPLC-Q-TOF-MS(Waters,USA)對所制備的發(fā)酵乳樣品進行代謝組學(xué)分析,采用ESI源正、負離子模式掃描(ESI+/ESI-)。采用反相系統(tǒng)對預(yù)處理好的樣品進行分離,色譜柱采用亞乙基橋雜化顆粒BEH C18(1.7 μm,2.1×100 mm)色譜柱進行分離,樣品進樣量為10 μL,流速0.45 mL/min,柱箱溫度35 ℃。正離子掃描模式下,流動相A為0.1%甲酸溶液,流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液,負離子掃描模式下,流動相A為0.1%氨水溶液,流動相B為乙腈溶液,梯度洗脫程序按照正離子模式進行洗脫,梯度洗脫程序見表1。

表1 正、負離子模式下發(fā)酵乳UPLC-Q-TOF-MS流動相梯度洗脫條件

Q-TOF質(zhì)譜儀采用ESI+和ESI-掃描模式,參數(shù)設(shè)置如下:毛細管電壓2.5 kV、錐孔電壓40 V、離子源溫度100 ℃、脫溶劑氣溫度350 ℃、脫溶劑氣流量600 L/h、錐孔氣流量50 L/h。質(zhì)核比掃描范圍50～1000 m/z,為確保儀器的準(zhǔn)確性,采用濃度為2 ng/mL亮氨酸腦啡肽(m/z=556.2771[M+H]+,m/z=554.2615[M-H]-)作為質(zhì)量校正液,流速5 μL/min,Q-TOF MS數(shù)據(jù)采集模式為Centroid。

1.2.2.3 數(shù)據(jù)處理及代謝物的鑒定 UPLC-Q-TOF MS獲得的原始數(shù)據(jù)使用MassLynx與Progenesis QI軟件進行色譜峰提取,輸出矩陣數(shù)據(jù)集。并利用了Progenesis QI與Metaboanalyst軟件進行了差異性檢驗(t檢驗)與差異倍數(shù)檢驗(Fold Change)與變量投影重要性指標(biāo)(VIP≥1)以確定組間顯著差異代謝物。

篩選出的顯著性代謝差異物根據(jù)其質(zhì)荷比、保留時間(Retention time)和二級碎片信息通過Progenesis QI軟件在HMDB(http://www.hmdb.ca/),ECMDB(http://ecmdb.ca/),YMDB(http://www. ymdb.ca/)與KEGG(http://www.kegg.jp/),Chemspider(http://www.chemspider. com/)等數(shù)據(jù)庫進行檢索完確定其結(jié)構(gòu),其中理論質(zhì)量數(shù)與實際測得的質(zhì)量數(shù)的質(zhì)量誤差閾值設(shè)置為10 ppm。篩選得到的差異代謝物進一步進行碎片信息的比對以及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵乳UPLC-Q-TOF色譜圖分析

本研究采用了UPLC-Q-TOF MS技術(shù)分析不同發(fā)酵乳達發(fā)酵終點時代謝物變化。圖1、圖2分別顯示脫脂乳、發(fā)酵乳在相同色譜和質(zhì)譜ESI+和ESI-條件掃描模式下的基峰圖(Base peak intensity chromatograms,BPI chromato-grams)。

圖1 樣品BPI圖(正離子模式)

圖2 發(fā)酵乳BPI圖(負離子模式)

從圖1、2可知,在相同色譜條件下,樣品間色譜峰的數(shù)量和色譜峰離子強度存在一定的差異。

2.2 發(fā)酵乳的主成分分析結(jié)果

將脫脂乳和發(fā)酵乳樣品的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入MassLynx軟件(V4.1,Waters USA)軟件進行了PCA分析,結(jié)果見圖3。

圖3 正、負離子模式下發(fā)酵乳與脫脂乳的PCA得分圖

由PCA得分圖可見,復(fù)配發(fā)酵乳和脫脂乳兩組樣品組間能夠完全區(qū)分,正離子模式下主成分1和主成分2的貢獻率分別為62.2%和22.9%,負離子模式下主成分1和主成分2的貢獻率分別為61.7%和27.2%,對樣品的累計貢獻率均大于85%,具有較好的代表性。

2.3 發(fā)酵乳的代謝差異物鑒定和分析

本研究應(yīng)用MassLynx軟件(V4.1,Waters USA)進行代謝物鑒定。在正離子和負離子模式下分別檢測到6096個和471個代謝物,根據(jù)VIP值≥1、差異倍數(shù)≥2和p<0.05的篩選原則,共鑒定得到152個差異代謝物(正離子87個和負離子65個)。隨后,通過相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫對其結(jié)構(gòu)進行了鑒定,結(jié)果見表2。

由表2可知,發(fā)酵乳與脫脂乳兩組樣品中的差異代謝物主要為有機酸(16種)、多肽(20種)、游離氨基酸(12種)和核酸代謝物(8種)等。與脫脂乳相比,發(fā)酵乳中16種有機酸變化顯著,琥珀酸(succinic acid)、檸檬酸(citrate acid)和順烏頭酸(homo-cis-aconitate)都是三羧酸循環(huán)中的重要節(jié)點化合物。而葡糖胺-6-磷酸(glucosamine-6-phosphate)則在糖酵解中發(fā)揮重要作用,糖酵解作為乳酸菌的一種最重要的提供能量的方式,為乳酸菌的生長和繁殖提供大量能量。乙酰胞壁酸(Acetylmuramic acid)細菌是細胞壁的重要組成成分,在構(gòu)建細胞壁中發(fā)揮著重要作用。這主要和發(fā)酵劑的糖酵解、檸檬酸循環(huán)和丙酮酸代謝等因素有關(guān),這與以前的研究報道一致[23-26]。

表2 發(fā)酵乳與脫脂乳的差異代謝物

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

發(fā)酵乳中共有12種游離氨基酸含量顯著增加,包括L-高絲氨酸(L-Homoserine)、L-半胱氨酸(L-Cysteine)、亮氨酸(L-Leucine)、鳥氨酸(Ornithine)、賴氨酸(L-Lysine)、精氨酸(Arginine)、瓜氨酸(Citrulline)、酪氨酸(Tyrosine)、纈氨酸(Valine)、蛋氨酸(L-methionine)和肌氨酸(Sarcosine),氨基酸不僅能給發(fā)酵乳帶來更多的營養(yǎng)物質(zhì),還可以作為發(fā)酵乳中發(fā)酵菌株的營養(yǎng)物質(zhì),促進菌株的生長繁殖,游離氨基酸越多越能更快地促進菌株生長繁殖。Khalid N M等[27]通過SDS-PAGE方法測定L.plantarum水解牛乳蛋白,發(fā)現(xiàn)L.plantarum主要降解牛乳中的β-酪蛋白,產(chǎn)生游離氨基酸和短肽。在本次研究中采用代謝組學(xué)技術(shù)所鑒定的亮氨酸、蛋氨酸和酪氨酸等氨基酸與其他發(fā)酵乳制品代謝產(chǎn)物的鑒定結(jié)果是一致的[28-29]。Pan等[30]采用代謝組學(xué)的分析方法研究了布里亞特傳統(tǒng)乳制品和商業(yè)乳制品的代謝產(chǎn)物,結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者的主要差異代謝物為短肽和氨基酸。

與脫脂乳相比,發(fā)酵乳中有20種多肽類物質(zhì)顯著變化,其中有6種多肽Thr-Val[31]、Asn-Pro[32]、Val-Asn[31]、Asn-Thr[31]、Asn-Leu[31]、Trp-Ala[31]和Try-Ser[33]屬于二肽基肽酶IV抑制劑,在體內(nèi)最終能夠起到降低血糖的效果,具有拮抗2型糖尿病的潛力。另有相關(guān)研究報道,當(dāng)肽類物質(zhì)的肽鏈羧基端為色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、脯氨酸和異亮氨酸時,則具有良好的降血壓功能[34]。由此可說明差異代謝物中的2種多肽Trp-Ala[32]和His-Gly[35]具備ACE抑制活性,具有在體內(nèi)降血壓的潛力。Leu-Val是一種在體內(nèi)有葡萄糖攝取功能的刺激肽,可促進組織或器官對葡萄糖的吸收和利用[36]。

L.plantarumP-8和商業(yè)發(fā)酵劑復(fù)配發(fā)酵可產(chǎn)生大量風(fēng)味物質(zhì),包括己酸(Hexanoic acid)、檸檬酸,琥珀酸(Succinic acid)、乙酸己酯(Hexyl acetate)、己醛(Hexanal)、丁酸丁酯(Butyl butyrate)、棕櫚酸(Palmitic acid)、月桂酸(Lauric acid)等。發(fā)酵乳中風(fēng)味物質(zhì)主要有羰基化合物、酸類化合物、醇類化合物和酯類化合物等。酯類化合物是發(fā)酵乳中的重要揮發(fā)性化合物,主要通過脂肪酸水解和微生物代謝產(chǎn)生,其中一些分子質(zhì)量較低的酯(乙酸甲酯、乙酸乙酯等)對發(fā)酵乳的風(fēng)味影響較大。Imhof等[37]在發(fā)酵乳中發(fā)現(xiàn)微量的乙酸乙酯;而Guler等[38]在發(fā)酵乳貯藏30 d后檢測到乙酸乙酯,且隨著貯藏時間的延長,乙酸乙酯的濃度呈上升趨勢。大多數(shù)酯類化合物具有水果和花香味,能降低脂肪酸和胺帶來的苦味。乳酸菌發(fā)酵牛乳中的乳糖等碳水化合物生成乳酸和一些有機酸,如丙酮酸、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、草酸、琥珀酸等。這些有機酸是發(fā)酵乳中重要呈味物質(zhì),其相對含量較高,能賦予其獨特的口感和風(fēng)味[4,39]。

作為發(fā)酵乳中增加的另外一種重要代謝物,γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyrate,GABA)的含量在發(fā)酵乳中顯著(348.63倍)高于脫脂乳。GABA是很多發(fā)酵食品中的重要功能成分之一。Tatsuro Hagi等[40]利用代謝組學(xué)的方法分析發(fā)酵乳制品的代謝產(chǎn)物,研究發(fā)現(xiàn),與對照組牛乳相比較,發(fā)酵乳制品中GABA的含量顯著增加(1216倍),且富含GABA的發(fā)酵乳中,ACE抑制肽的含量較高。Lee等[41]研究集中益生菌在發(fā)酵過程中GABA含量的變化,發(fā)現(xiàn)L.plantarumK154的培養(yǎng)基中GABA的含量顯著高于其它菌株,并且在培養(yǎng)基中有大量的具有生物活性的多肽。本研究中,在商業(yè)發(fā)酵劑中添加一定數(shù)量的益生菌L.plantarumP-8進行發(fā)酵,GABA含量顯著增加，這一研究結(jié)果可能為其在神經(jīng)系統(tǒng)障礙領(lǐng)域的開發(fā)提供依據(jù)。

L-肉毒堿在發(fā)酵乳中的含量顯著升高(p<0.05)。這與許多研究文獻中肉毒堿和脂質(zhì)代謝密切相關(guān)[42-43]。它促進了長鏈脂肪酰輔酶A轉(zhuǎn)運細胞質(zhì)進入線粒體。但是,到目前為止,L-肉毒堿在細菌內(nèi)的代謝和功能仍不清楚。它可以作為細菌的滲透保護劑,如可以促進大腸桿菌生長[22]。Boucher等[1]采用UPLC-MS和GC-MS代謝組學(xué)的分析技術(shù)研究干酪的代謝圖譜,共鑒定45個代謝物,其中包括12種氨基酸、25種芳香物質(zhì)、4種維生素、尿酸、肌酸和肉毒堿?？梢姶x組學(xué)作為一種解決復(fù)雜機制中差異分析的技術(shù)方法,在食品領(lǐng)域受到越來越多研究者的青睞。

3 結(jié)論

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合PCA的分析方法對脫脂乳、L.plantarumP-8與商業(yè)發(fā)酵劑YC-X11發(fā)酵乳進行了代謝圖譜分析。結(jié)果表明,采用UPLC-Q-TOF-MS代謝組學(xué)技術(shù)在正離子和負離子模式下分別檢測到6096個和471個代謝物,根據(jù)篩選原則,共鑒定得到152個差異代謝物(正離子87個和負離子65個)。L.plantarumP-8和商業(yè)發(fā)酵劑混合發(fā)酵產(chǎn)生琥珀酸、檸檬酸、L-高絲氨酸、L-半胱氨酸、亮氨酸、賴氨酸、精氨酸、酪氨酸、Thr-Val、Asn-Pro、Val-Asn、Asn-Thr、Asn-Leu、Trp-Ala、乙酸己酯、己醛、丁酸丁酯、L-肉毒堿和γ-氨基丁酸等有機酸、氨基酸、多肽和風(fēng)味物質(zhì),為功能性乳制品的開發(fā)及應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。因此代謝組學(xué)技術(shù)是理想的鑒定和區(qū)分發(fā)酵乳制品中差異代謝物的有效手段。