苔干酶促褐變歸因分析

燕傲蕾,肖清臣,周 奎,王玉民

(亳州學(xué)院,安徽亳州 236800)

苔干(LactucaSativaVar.angustata)又名貢菜、響菜、山蟄菜,屬菊科(Compositae)萵苣屬(Lactuca)植物[1]。苔干口感爽脆、營養(yǎng)豐富,有健胃、利水、降壓、軟化血管等多種功效,被譽為“天然保健品、植物營養(yǎng)素”[2-3]。作為安徽省渦陽縣的地理標志產(chǎn)品,苔干通過了美國和歐盟有機食品認證,受到國內(nèi)以及日韓、歐美、港澳臺等十幾個國家和地區(qū)人民的喜愛,是安徽省重點出口的綠色有機農(nóng)產(chǎn)品之一[4],在全民養(yǎng)生時代創(chuàng)造了很高的經(jīng)濟價值。在苔干國標(GB/T 29564-2013)中,色澤是苔干分級的重要評價指標。但是,苔干在天然晾制脫水環(huán)節(jié)中,需要晴朗微風(fēng)天氣,若天氣不佳未能及時脫水,就會褐化變黑、發(fā)霉甚至腐敗變質(zhì)。此外,苔干在儲存過程中也存在褐變情況,影響了苔干的分級和商業(yè)價值。分析苔干褐化現(xiàn)象的成因并對其進行控制,對苔干產(chǎn)業(yè)意義重大。

褐變分為酶促褐變和非酶促褐變兩種[5],目前,國內(nèi)外學(xué)者多數(shù)認為酶促褐變是果蔬褐變的主要類型[6-8]。根據(jù)酚-酚酶分布學(xué)說[9],完整植物細胞中酚類物質(zhì)和酚酶儲存在不同分區(qū),在植物受到切割傷害后,底物和酶在細胞內(nèi)的儲存分區(qū)被破壞,在有氧條件下,酚類氧化成醌,醌經(jīng)過自發(fā)聚合并與蛋白質(zhì)的氨基酸殘基側(cè)鏈基團反應(yīng)形成黑褐色物質(zhì),導(dǎo)致酶促褐變的發(fā)生[10-11],可見酶促褐變需要底物、酶和活性氧三個條件。其中,酚類物質(zhì)是酶促褐變的關(guān)鍵底物[12-13];多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO;EC 1.14.18.1)是大多數(shù)果蔬酶促反應(yīng)的關(guān)鍵酶[14-16],也是現(xiàn)在果蔬酶促褐變研究的重點,目前,PPO在酶學(xué)特性和褐變機制方面已進行了大量研究,PPO基因在梨[17]、蓮藕[18]、石榴[19]、龍眼[20]等多種植物中被相繼克隆;過氧化物酶(Peroxidase,POD;EC 1.11.1.7)常與PPO存在協(xié)同作用[13],能將酚類物質(zhì)和類黃酮氧化聚合形成褐色物質(zhì)引起褐變[21-22],也是部分果蔬褐變的主要因素[23-24]。截至目前,苔干PPO純化后的酶學(xué)特性和苔干PPO活性控制的工藝條件已有所研究[25-26],但研究對象局限于PPO上,對苔干在不同時間段、不同部位的褐變情況及其主要影響因素的研究十分匱乏。

本文以“渦青一號”苔干為實驗材料,通過研究苔干在去皮加工后不同時間、不同部位褐變度，褐變底物(酚類)含量變化，褐變相關(guān)酶PPO、POD活性變化，并分析酶活性、酚類含量與褐變度的相關(guān)性,明確苔干不同時間、不同部位的褐變機理及其差異,為苔干的脫水加工和褐變控制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苔干 于18年5月上旬,在安徽省義門鎮(zhèn)苔干種植基地挖取主莖頂端最高葉片的葉尖相平齊的 “渦青一號”苔干[27],根部帶土裝入采樣袋,2 h內(nèi)乘車帶回實驗室,栽在花盆中備用;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、過氧化氫(30%)、無水乙醇 AR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;鄰苯二酚 CP，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;愈創(chuàng)木酚 美國Sigma公司;交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮(Crosslinked polyvinylpyrrolidone,PVPP)、福林酚 合肥博美試劑有限公司。

FA2004N電子天平 上海菁海儀器有限公司;FS-1(YQ-3)電動組織勻漿機 常州金壇友聯(lián)儀器研究所;KQ-250B超聲波清洗機 昆山超聲儀器有限公司;UV-6000T紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;H1850R高速冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司;Infinite M1000 Pro酶標儀 瑞士Tecan公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 按照從苔干去皮到取樣的間隔時間,設(shè)置0、4、8、20、30、48 h 6個實驗組,每組3根苔干,在實驗室內(nèi)按照去苔葉、打苔腦、刨苔皮、剖苔條、脫水的傳統(tǒng)手工作業(yè)方式[28]對“渦青一號”進行處理,并在室內(nèi)窗戶邊懸掛自然脫水。實驗進行期間天氣多云,溫度14～27 ℃。對上述6個實驗組進行取樣測定,將去皮后的苔子距末梢嫩葉3 cm部分定為苔頭,距根部5 cm部分定為苔根,苔頭和苔根中間的部分為苔莖,實驗材料切碎后按“四分法”縮分至10 g左右備用[29]。

1.2.2 褐變度測定 以譚誼談等[30]的方案為基礎(chǔ)并進行調(diào)整。準確稱取3.0 g植物材料,加10 mL 4 ℃預(yù)冷的蒸餾水研磨打碎,再用5 mL 4 ℃預(yù)冷的蒸餾水沖洗研缽,4 ℃ 10000 r/min離心15 min。取上清液,以蒸餾水為空白對照,在410 nm下測定其吸光度,以410 nm處的吸光值表示褐變度。

褐變平均增速(%/h)=[(An-An-1)/(An-1(ΔT)]×100

式中:An為某一時間點的褐變度;An-1為前一時間點的褐變度;ΔT為兩個時間點的時間差,h。

1.2.3 總酚含量測定 總酚含量測定采用福林酚法[31]。準確稱取1.0 g植物材料,加10 mL 60%乙醇打碎,再用10 mL 60%乙醇沖洗,轉(zhuǎn)移到50 mL三角瓶中,在60 ℃、250 W下超聲提取40 min后過濾,再用60%乙醇定容到25 mL。取定容后的總酚提取液1 mL至試管中,依次加入蒸餾水5 mL、福林酚 1 mL,混勻后靜置5 min,再加 0.5 mol/L的Na2CO34 mL,室溫下避光反應(yīng)60 min,定容到25 mL。在750 nm波長下以蒸餾水為空白對照測其OD值,以吸光值代表總酚含量。

總酚平均增速(%/h)=[(An-An-1)/(An-1(ΔT)]×100

式中:An為某一時間點的總酚含量;An-1為前一時間點的總酚含量;ΔT為兩個時間點的時間差,h。

1.2.4 PPO、POD酶活性測定

1.2.4.1 PPO、POD粗酶液提取 酶液提取參考馮立娟等[32]的方法并進行調(diào)整,準確稱取3.0 g植物材料,加4 ℃預(yù)冷的0.05 mol/L pH7.0的PBS 9 mL、PVPP 0.1 g,用勻漿機或研缽打碎植物材料,4 ℃ 10000 r/min離心15 min,上清液即為POD和PPO粗酶液,4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2 PPO活性測定 PPO活性測定采用鄰苯二酚法[31]。在預(yù)實驗中利用紫外-可見分光光度計和酶標儀對苔干酶粗提液中PPO的檢測波長、時長、pH、溫度、加酶量和底物濃度進行了梯度設(shè)置和篩選,最終確定實驗方案如下:取PPO酶粗提液0.3 mL,加2 mL pH7.2的 PBS和1 mL 0.05 mol/L的鄰苯二酚,室溫下混合后立即在410 nm 波長下測其OD值變化情況,每隔20 s測定一次,共測定1 min。以每分鐘內(nèi)吸光值變化0.01定義為1 U。

PPO活性平均增速(%/h)=[(An-An-1)/(An-1(ΔT)]×100

式中:An為某一時間點的PPO活性;An-1為前一時間點的PPO活性;ΔT為兩個時間點的時間差,h。

1.2.4.3 POD活性測定 配制POD反應(yīng)液:每50 mL 0.05 mol/L pH7.0的PBS加愈創(chuàng)木酚28 μL,60 ℃加熱攪拌至愈創(chuàng)木酚完全溶解,冷卻后加入30%的H2O2溶液19 μL,混勻,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[33]。經(jīng)預(yù)實驗篩選,最終確定實驗方案如下:取POD酶粗提液0.3 mL,加pH7.0的POD反應(yīng)液3 mL,室溫混合后立即在470 nm 波長下測其OD值變化情況,每隔30 s測定一次,共測定2 min。以每分鐘內(nèi)吸光值變化0.01定義為1 U。

POD活性平均增速的計算同PPO。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗設(shè)三個重復(fù),實驗所得數(shù)據(jù)使用Excel 2007計算平均值、標準偏差并用Origin 8.0制圖,用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)差異顯著性分析(p<0.05代表有顯著差異;p<0.01代表有極顯著差異)和相關(guān)性分析(*表示顯著相關(guān),p<0.05;**表示極顯著相關(guān),p<0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 苔干不同部位褐變度的變化

從圖1可以看出,苔干去皮后苔頭、苔莖和苔根的褐變度均隨時間增加而上升。其中去皮8 h內(nèi)苔頭、苔莖和苔根的褐變程度維持在較低的水平;在8～30 h苔莖和苔根的褐變度均顯著提高,在8、20、30 h均存在顯著差異(p<0.05);在20～30 h苔頭褐變度顯著提高(p<0.05),30～48 h時間段,苔頭的褐變度仍顯著增高(p<0.05),增幅高達73.10%,苔莖和苔根的褐變度則趨于穩(wěn)定,分別升高7.40%和2.37%。30 h后苔頭的褐變度明顯高于苔莖和苔根,可能與苔頭較細,創(chuàng)傷部位相對較大有關(guān)。從不同時間段苔干各部位褐變的平均增速可以看出(表1):去皮初期苔頭、苔莖、苔根分別在0～4、0～8、4～8 h內(nèi)表現(xiàn)出較高的褐變增速,但在8～20 h階段,苔頭、苔莖和苔根的褐變增速均達到最高水平,之后隨著時間的增加不斷下降,8～20 h是苔干整體褐變控制的關(guān)鍵時間段。

圖1 苔干各部位褐變情況

表1 苔干各部位在各時間段褐變度的平均增速

2.2 苔干不同部位總酚含量的變化

酚類物質(zhì)在果蔬生長發(fā)育過程中合成,在果蔬中含量較為豐富,其種類和含量對褐變影響重大[34-35],機械傷害等逆境脅迫也能刺激酚類的合成[36]。從圖2可以看出,隨著時間的增加,苔干各部位的總酚含量均表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢,且在20 h處達到最大值。其中,在0～8 h時,苔莖總酚含量上升最快(表2),在0、4、8 h時均存在顯著差異(p<0.05),苔干各部位的總酚含量增速表現(xiàn)為苔莖>苔頭>苔根;在8～20 h時,苔干各部位總酚含量均顯著升高(p<0.05),其中,苔頭的總酚含量上升最快,增速表現(xiàn)為苔頭>苔莖>苔根;20 h后,苔頭、苔莖、苔根中總酚含量均有所下降,其中,苔頭和苔根的總酚含量下降較明顯,在30 h時的總酚含量與20 h時存在顯著差別(p<0.05),苔頭的下降幅度則較小,在30、48 h時的總酚含量與20 h時無顯著差異(p>0.05)。可見苔干去皮后,儲存在細胞中的酚類被釋放,導(dǎo)致苔干各部位總酚含量快速上升。同時,在有氧和酶的條件下,酚類底物被氧化成醌類,導(dǎo)致后期苔干各部位中總酚含量的下降。

圖2 苔干各部位總酚含量

表2 苔干各部位在各時間段的總酚含量平均增速

2.3 苔干不同部位褐變相關(guān)酶活性的變化

2.3.1 苔干不同部位PPO酶活性的變化 PPO是植物體內(nèi)廣泛存在的一種含銅氧化酶。眾多研究證實PPO是大多數(shù)果蔬酶促褐變的關(guān)鍵酶,鴨梨[37]、紫薯[38]等多種果蔬的褐變程度均與PPO活性正相關(guān)。從圖3可以看出,苔干各部位PPO的活性均隨著時間的增加而上升。去皮8 h內(nèi),苔頭、苔莖和苔根的PPO活性變化不大。8 h后,苔頭、苔莖和苔根的PPO活性均顯著上升,在8、20、30、48 h之間均存在顯著差異(p<0.05),其中,苔頭PPO活性增長最快,苔莖次之,苔根最低。從苔干各部位PPO活性增速上來看(表3):4 h后,苔頭、苔莖和苔根的PPO活性增速不斷上升,在8～20 h時間段達到峰值;20 h后,苔頭、苔莖和苔根的PPO活性平均增速均有所降低,但在8 h后,PPO活性平均增速均表現(xiàn)為苔頭>苔莖>苔根。

圖3 苔干各部位PPO活性

表3 苔干各部位在各時間段的PPO活性平均增速

2.3.2 苔干不同部位POD酶活性的變化 POD是一種廣泛存在于真核生物細胞中的鐵卟啉金屬有機催化劑,與PPO同時存在時,能提高彼此活性,表現(xiàn)出協(xié)同作用。在西瓜汁[39]、百合[40]的褐化研究中,POD是其褐變的主要影響因素。在酶學(xué)性質(zhì)方面,POD耐熱性較好,在大多數(shù)果蔬中活性較強,因此常做為高溫滅酶過程中衡量熱處理效果的指標,也是目前酶促褐變研究的重點。從圖4可以看出,苔干各部位POD的活性同樣隨時間增加而上升,但在20 h內(nèi),苔頭、苔莖和苔根的POD活性變化不大;20 h后,苔頭、苔莖和苔根的POD活性顯著上升,在20、30、48 h時POD活性均存在顯著差異(p<0.05)。從苔干各部位POD活性增速(表4)可以看出:20～30 h是苔干各部位POD活性增長最快的時期,整體上顯著高于其它時段(p<0.05),且增長速度為苔頭>苔莖>苔根。

圖4 苔干各部位POD活性

表4 苔干各部位在各時間段的POD活性平均增速

2.4 苔干不同部位褐變度與總酚和酶活性的相關(guān)性分析

苔干不同部位(苔頭、苔莖和苔根)以及各時間節(jié)點苔干的褐變度與總酚含量、PPO活性和POD活性的相關(guān)分析結(jié)果見表5、表6。從表5可以看出:在苔干各部位的褐變過程中,PPO、POD活性與苔頭、苔莖和苔根褐變度均極顯著相關(guān)(p<0.05),可見與酚類底物相比,PPO、POD活性對苔干褐變影響更大。

表5 苔干各部位褐變度與總酚、PPO活性和POD活性的相關(guān)性分析

從表6可以看出:苔干在去皮4 h內(nèi),褐變度與總酚含量顯著相關(guān)(p<0.05);在4～20 h中,影響苔干褐變度的因素較為復(fù)雜,總酚含量、PPO活性均未與褐變度存在顯著相關(guān)性(p>0.05);30 h時,苔干褐變度與總酚含量PPO、POD活性均顯著相關(guān)(p<0.05),30 h后,總酚含量、PPO、POD活性均與苔干褐變度極顯著相關(guān)(p<0.01)。造成這種現(xiàn)象的原因可能是:酚類物質(zhì)在正常情況下儲存在液泡里,機械損害導(dǎo)致酚類的釋放,影響早期褐變程度。隨著時間的推移,酚類物質(zhì)不斷在酶的作用下轉(zhuǎn)化形成醌類,醌類進行非酶反應(yīng),進一步氧化聚合形成黑褐色的物質(zhì),導(dǎo)致總酚含量下降,底物總酚也逐漸成為苔干進一步褐化的限制因素。

表6 各時間點苔干褐變度與總酚、PPO活性和POD活性的相關(guān)性分析

3 結(jié)論與討論

苔頭、苔莖和苔根在苔干去皮前期的褐化情況相差不大,但30 h后,與苔莖和苔根相比,苔頭中總酚含量較高，PPO、POD活性增速更高,使苔頭褐化度大幅度高于苔莖和苔根。因此在苔干褐變控制中,要特別注意苔頭的褐變控制,以免影響苔干的品相和質(zhì)量。PPO、POD活性與苔干各部位的褐變度均極顯著相關(guān)(p<0.01),尤其是苔干加工后期,PPO、POD活性與苔干褐變度極顯著相關(guān)(p<0.01),體現(xiàn)出PPO、POD活性在苔干酶促褐變中的重要影響。同時,PPO、POD活性的提升情況具有差異性,PPO和POD活性增速最快的時間段分別在8～20 h和20～30 h,因此在對苔干進行滅酶處理時,應(yīng)盡量在去皮8 h內(nèi)對PPO進行滅活,降低PPO活性和PPO、POD酶的協(xié)同作用,以達到減輕苔干褐變的目的;而溫度耐受性較高的POD,其滅活時間可適當放寬,在苔干去皮20 h內(nèi)進行即可。苔干中的PPO、POD酶可分溫度、分時間段進行控制,以達到更好的褐變控制效果。