細(xì)辛多糖的提取工藝優(yōu)化及細(xì)胞衰老保護(hù)作用

任 婷,宋天一,牟瑩瑩,許夢然,滿枋霖,孫 新,*

(1.北華大學(xué)藥學(xué)院,吉林吉林 132013;2.吉林省分子醫(yī)學(xué)老年重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院,吉林吉林 132013)

血管疾病如腦梗塞、心肌梗塞、冠狀動(dòng)脈鈣化的發(fā)病率及死亡率逐年攀升并趨于年輕化[1]。血管衰老是促進(jìn)心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素[2-3],與平滑肌細(xì)胞的健康密切相關(guān)[4-5]。血管平滑肌細(xì)胞是構(gòu)成血管壁組織結(jié)構(gòu)及維持血管張力的主要細(xì)胞成分[6],其血管和功能的改變是導(dǎo)致高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后再狹窄等多種心血管病的細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)[7-8]。研究血管平滑肌細(xì)胞的衰老作用對心腦血管疾病的診斷及治療具有重大意義。依托泊苷(Etoposide,Eto)是一種阻礙DNA修復(fù)的細(xì)胞周期特異性抗腫瘤藥物[9],使細(xì)胞周期阻滯于G1期發(fā)揮作用[10-11],通過DNA損傷誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。

細(xì)辛為馬兜鈴科多年生草本植物北細(xì)辛(AsarumheterotropoidesFr. Schmidt var. mandshuricum(Maxim.)Kitag.)、漢城細(xì)辛(AsarumsieboldiiMiq. var.seoulense Nakai)或華細(xì)辛(AsarumsieboldiiMiq.)的干燥根和根莖[12-13],《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品[14],有“小毒”[15],細(xì)辛主要活性成分有:多糖、甲基丁香酚、黃樟醚、馬兜鈴酸、生物堿以及一些微量元素[16-22]。細(xì)辛生物堿和醇提液對心血管系統(tǒng)具有強(qiáng)心、降壓、擴(kuò)張血管、松弛平滑肌、增強(qiáng)脂質(zhì)代謝等作用[23-25]。

本課題組長期從事多糖抗衰老活性組分篩選工作,衰老標(biāo)記物β-半乳糖苷酶檢測模型發(fā)現(xiàn)細(xì)辛多糖(Asarumpolysaccharides,ASP-1)具有抗衰老活性。現(xiàn)有文獻(xiàn)中,細(xì)辛多糖的提取為簡易的熱水提取法[26-27],未見響應(yīng)面法優(yōu)化細(xì)辛多糖提取工藝及細(xì)辛多糖對血管平滑肌細(xì)胞衰老保護(hù)作用的報(bào)道。因此,本文采用響應(yīng)面法優(yōu)化細(xì)辛多糖提取工藝,采用Eto作為衰老誘導(dǎo)物,探討ASP-1對其誘導(dǎo)的大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(Rat aortic smooth muscle cells,A10)衰老的保護(hù)作用,旨在為細(xì)辛的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

細(xì)辛根部 長白山特色植物種植基地,按照中華人民共和國藥典標(biāo)準(zhǔn)鑒定;大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(A10) 北京中原合聚經(jīng)貿(mào)有限公司;DEAE-纖維素 英國Whatman公司;Sepharose CL-6B 美國GE公司;單糖 標(biāo)準(zhǔn)品,中國食品藥品檢定研究院;DMSO 美國Sigma公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒、細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒 上海碧云天生物科技有限公司;DMEM、胎牛血清 美國Gibco公司;MTT 美國Amresco公司;其它試劑 均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)辛多糖提取的工藝流程 將干燥的細(xì)辛根粉碎稱重,80%乙醇回流脫脂24 h。選擇適當(dāng)?shù)奶崛囟?、提取時(shí)間和液料比,將殘?jiān)鼰崴?得到的粗提液濾過后在30～70 ℃、真空度-0.03～-0.09 MPa下減壓濃縮至一定體積。連續(xù)劇烈攪拌下緩慢加入4倍體積無水乙醇,4 ℃靜置過夜,3500 r/min離心沉淀多糖,依次用無水乙醇、乙醚洗脫干燥得粗多糖。將粗多糖溶于蒸餾水配制成5%的糖溶液,-80 ℃冰箱反復(fù)凍融離心去蛋白質(zhì),接著向糖溶液中加入適當(dāng)體積的鏈霉菌蛋白酶消化4～24 h,按體積比4∶1加入Sevag試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)劇烈振蕩1 h,3500 r/min離心取上清,重復(fù)至無變性蛋白質(zhì)出現(xiàn)。截留分子量3500 Da透析除去小分子物質(zhì),冷凍干燥得到細(xì)辛多糖。根據(jù)下式計(jì)算細(xì)辛多糖得率:

式中:m多糖為提取出的細(xì)辛多糖的質(zhì)量,m細(xì)辛為多糖對應(yīng)的細(xì)辛原材料的質(zhì)量。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 按照1.2.1多糖提取工藝流程,研究提取溫度、液料比、提取時(shí)間 3個(gè)因素對細(xì)辛多糖得率的影響。

1.2.2.1 提取溫度對細(xì)辛多糖得率的影響 在提取時(shí)間為2 h、液料比為30∶1 mL/g的條件下,提取溫度分別設(shè)定為60、70、80、90、100 ℃,考察不同提取溫度對細(xì)辛多糖得率的影響。

1.2.2.2 提取時(shí)間對細(xì)辛多糖得率的影響 在提取溫度為90 ℃、液料比為30∶1 mL/g的條件下,提取時(shí)間分別設(shè)定為1、1.5、2、2.5、3 h,考察不同提取時(shí)間對細(xì)辛多糖得率的影響。

1.2.2.3 液料比對細(xì)辛多糖得率的影響 在提取溫度為90 ℃、提取時(shí)間為2 h的條件下,液料比分別設(shè)定為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g,考察不同液料比對細(xì)辛多糖得率的影響。

1.2.3 Box-Behnken響應(yīng)面法(BBD-RSM)優(yōu)化多糖提取工藝 BBD-RSM評(píng)估基于單因素實(shí)驗(yàn)的提取參數(shù)組合效應(yīng)[28-30],參數(shù)變量包括提取溫度,提取時(shí)間和液料比,以多糖得率(%)作為響應(yīng)值。該設(shè)計(jì)由17個(gè)具有五個(gè)中心點(diǎn)的組合組成,以計(jì)算該方法的可重復(fù)性,方差分析中F值和p值用于檢驗(yàn)回歸系數(shù)的顯著性,通過對各項(xiàng)回歸系數(shù)進(jìn)行回歸擬合,得到二次多項(xiàng)式回歸方程,并驗(yàn)證多項(xiàng)式模型的準(zhǔn)確性,實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)置見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼

1.2.4 ASP-1的分級(jí)純化及抗氧化活性篩選 根據(jù)BBD-RSM獲得的最佳提取條件提取細(xì)辛多糖,將細(xì)辛多糖配制成5%的糖溶液,0.45 μm濾過后使用KTA explorer 100 層析系統(tǒng)分級(jí)純化多糖。DEAE-纖維素(3 cm×30 cm)用0→1 mol/L NaCl梯度洗脫,收集洗脫液,苯酚-硫酸法測定多糖含量,得到兩個(gè)主要多糖組分,分別為中性多糖ASP-1和酸性多糖ASP-2,透析后分別用Sepharose CL-6B(2.6 cm×100 cm)柱層析進(jìn)一步純化,0.15 mol/L NaCl洗脫,得到分子量均一的細(xì)辛多糖組分,仍命名為ASP-1和ASP-2,透析后凍干[31-32]。苯酚-硫酸法測定多糖含量。BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白質(zhì)含量。DPPH自由基(對1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基)清除實(shí)驗(yàn)測定體外抗氧化活性,以維生素E(VE)作為陽性對照,步驟如下:分別取25、50、100、200、400、800 μg/mL的多糖溶液和維生素E 100 μL加入96孔板中,再加入2×10-4mol·L-1的DPPH溶液(無水乙醇配制)100 μL,混勻,避光室溫靜置30 min,在517 nm波長處測定吸光度,根據(jù)下式計(jì)算清除率:

式中:A3為不同濃度多糖加DPPH測得的吸光度,A2為不同濃度多糖加水測得的吸光度,A1為水加DPPH測得的吸光度值,A0為水測得的吸光度。

1.2.5 MTT細(xì)胞活力測定 用含有10%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)液,將處于對數(shù)生長期的A10細(xì)胞(4000 cells/孔)接種于96孔板,置37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,將ASP-1分別以25、50、100、200和400 μg/mL的終濃度預(yù)處理細(xì)胞,設(shè)置空白組(只加培養(yǎng)液,不加細(xì)胞和ASP-1)、對照組(加細(xì)胞和培養(yǎng)液,不加ASP-1)和Eto模型組(加細(xì)胞和培養(yǎng)液),每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,在ASP-1預(yù)處理組和Eto模型組中加入Eto(終濃度為6 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后吸去上清液,每孔加入200 μL的H-DMEM培養(yǎng)液和20 μL的MTT溶液(終濃度為0.5 mg/mL)置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。吸去上清液,每孔加入150 μL DMSO,搖床10 min,在490 nm處測定吸光度。根據(jù)下式計(jì)算細(xì)胞存活率:

式中:A實(shí)驗(yàn)組為加藥處理組(ASP-1預(yù)處理組和Eto模型組)測得的吸光度,A對照組為不加藥物組測得的吸光度,A空白組為不加細(xì)胞和藥物組測得的吸光度。

1.2.6 衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色分析 MTT實(shí)驗(yàn)確定200 μg/mL為ASP-1保護(hù)Eto誘導(dǎo)的A10細(xì)胞衰老的最佳劑量后,用含有10%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)液,將處于對數(shù)生長期的A10細(xì)胞(30 000 cells/孔)接種到12孔板,置37 ℃、5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,ASP-1(200 μg/mL)預(yù)處理細(xì)胞6 h,接著6 μmol/L Eto誘導(dǎo)48 h,正常培養(yǎng)48 h后,根據(jù)Beyotime生物技術(shù)研究所的說明,使用細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒評(píng)估細(xì)胞衰老水平,倒置熒光顯微鏡下拍攝陽性細(xì)胞[33]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

Design Expert軟件(版本8.0.6)用于響應(yīng)面分析,GraphPad Prism 5軟件用于統(tǒng)計(jì)計(jì)算,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)三個(gè)平行,數(shù)據(jù)表示為平均值±SD,ANOVA單因素方差分析用于組間比較,p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取溫度對細(xì)辛多糖得率的影響 提取溫度對多糖得率有明顯影響。如圖1,提取溫度由60 ℃升高到100 ℃時(shí),多糖得率呈持續(xù)升高趨勢,從6.57%升高到9.31%。這與理論相符合,一定溫度范圍內(nèi),溫度升高使分子移動(dòng)速率加快,多糖的溶出速率上升[34]?？紤]到過高的溫度可能會(huì)影響多糖的穩(wěn)定性,將響應(yīng)面試驗(yàn)中溫度變量設(shè)定為90～100 ℃。

圖1 提取溫度對多糖得率的影響

2.1.2 提取時(shí)間對細(xì)辛多糖得率的影響 提取時(shí)間對多糖得率有明顯影響。如圖2,當(dāng)提取時(shí)間從1 h增加到2 h時(shí)多糖得率呈升高趨勢,提取時(shí)間為2 h時(shí),細(xì)辛多糖得率達(dá)到最大值9.61%,隨著提取時(shí)間的進(jìn)一步增加,多糖得率明顯降低。這種現(xiàn)象與其它報(bào)道一致[35],一定時(shí)間范圍內(nèi),多糖得率隨著提取時(shí)間的加長而增加,然而,提取時(shí)間過長時(shí),多糖得率呈下降趨勢,分析可能是多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生水解導(dǎo)致得率降低,將響應(yīng)面試驗(yàn)中時(shí)間變量設(shè)定為1.5～2.5 h。

圖2 提取時(shí)間對多糖得率的影響

2.1.3 液料比對細(xì)辛多糖得率的影響 不同溶劑與原料的比例(液料比)對多糖得率有明顯影響。如圖3,液料比10∶1 mL/g增加到30∶1 mL/g時(shí),得率由5.48%升高到最大值9.33%,隨著液料比的進(jìn)一步增加,多糖得率明顯降低。這是由于一定范圍內(nèi),液料比的增加有利于多糖浸出擴(kuò)散到溶劑中,而液料比過高時(shí),溶劑的增加會(huì)影響浸提體系的傳熱和傳質(zhì),不利于多糖的提取[36]。將響應(yīng)面試驗(yàn)中液料比變量設(shè)定為20∶1～40∶1 mL/g。

圖3 液料比對多糖得率的影響

2.2 BBD-RSM優(yōu)化細(xì)辛多糖提取工藝

細(xì)辛多糖提取工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2,ANOVA方差分析結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸模型顯著性檢驗(yàn)及方差分析

數(shù)據(jù)經(jīng)回歸擬合后,得到回歸方程為:Y多糖得率(%)=8.58+0.58A+0.90B+0.45C-1.21AB-0.27AC+1.19BC+0.41A2-2.29B2。

選擇范圍內(nèi),提取溫度、提取時(shí)間、料液比對多糖得率均有顯著性影響(p<0.05)。各因素的F值大小依次為F(B)>F(A)>F(C),提取時(shí)間(B)對細(xì)辛多糖得率影響最大。各因素間交互作用對多糖得率亦有顯著性影響(p<0.05),其交互作用的等高線圖4和響應(yīng)曲面圖5,證實(shí)了ANOVA方差分析結(jié)果。

圖4 2D等高線圖

圖5 三維響應(yīng)曲面圖

本文通過繪制殘差與預(yù)測響應(yīng)的關(guān)系,通過構(gòu)建獨(dú)立變量(p<0.0001)的正態(tài)概率圖研究正態(tài)假設(shè)。如圖6所示,殘差正態(tài)概率分布圖接近一條直線,模型預(yù)測值與實(shí)際值近乎一條直線,模型預(yù)測值與殘差差異大,因此,本文得出的多項(xiàng)式模型是有效的,并且存在理想的最佳點(diǎn)。優(yōu)化試驗(yàn)得到的細(xì)辛多糖最佳提取條件為提取溫度90 ℃,提取時(shí)間2.37 h,液料比40∶1 mL/g,在此條件下,模型預(yù)測最大多糖得率為10.32%。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該模型的可靠性,根據(jù)模型最佳提取條件進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),細(xì)辛多糖得率實(shí)際值為10.20%±0.22%,與理論預(yù)測值10.32%相近,相對誤差(1.18%)小于5%。因此,該模型能準(zhǔn)確反映細(xì)辛多糖提取過程中各因素的交互作用,可用于優(yōu)化細(xì)辛多糖的提取工藝。

圖6 殘差正態(tài)概率圖,預(yù)測值與實(shí)際值和殘差與預(yù)測值的比較

2.3 ASP-1的分級(jí)純化及活性篩選

如圖7A,細(xì)辛多糖經(jīng)DEAE-纖維素陰離子交換柱分離得到兩個(gè)多糖組分,分別為中性多糖ASP-1和酸性多糖ASP-2,使用Sepharose CL-6B柱層析進(jìn)一步純化,得到分子量均一的多糖組分,透析并凍干,仍命名為ASP-1和ASP-2。DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)用于評(píng)價(jià)兩種多糖組分的抗氧化能力,結(jié)果如圖8,組分ASP-1抗氧化活性較強(qiáng),ASP-1用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的活性檢測。ASP-1理化性質(zhì)分析見表4。ASP-1的總糖含量為96.9%,葡萄糖含量為58.35%,蛋白質(zhì)含量為0.11%,糖含量較高。

圖7 DEAE-纖維素(A)和瓊脂糖CL-6B(B,C)對細(xì)辛多糖進(jìn)行分級(jí)純化

圖8 ASP-1和ASP-2對DPPH自由基的清除能力

表4 ASP-1的理化性質(zhì)

2.4 ASP-1對A10細(xì)胞衰老的保護(hù)作用

細(xì)胞衰老是指細(xì)胞生理功能的衰減,包括增殖能力下降,活力減弱。采用MTT法測定不同濃度ASP-1的細(xì)胞衰老保護(hù)功能,結(jié)果表明,ASP-1預(yù)處理對Eto誘導(dǎo)的A10細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用,在25～200 μg/mL濃度范圍內(nèi),ASP-1對Eto誘導(dǎo)的A10細(xì)胞損傷有劑量依賴性保護(hù)作用,表現(xiàn)強(qiáng)的增殖活性,在濃度為200 μg/mL時(shí),保護(hù)作用最強(qiáng),400 μg/mL時(shí)保護(hù)作用下降(圖9),此現(xiàn)象是由于細(xì)辛多糖劑量過大產(chǎn)生毒性。

圖9 ASP-1對Eto誘導(dǎo)的A10細(xì)胞損傷的作用

衰老細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)上伴有體積增大,并且SA-β-gal表達(dá)水平增加,SA-β-gal是首個(gè)用于特異識(shí)別衰老細(xì)胞的分子標(biāo)記物[37]。通過觀察細(xì)胞形態(tài)變化以及SA-β-gal染色評(píng)價(jià)ASP-1對Eto誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的保護(hù)作用,如圖10所示,對照組細(xì)胞(Con)形狀小呈規(guī)則紡錘形,邊緣清晰。相反,Eto處理后,細(xì)胞形態(tài)增大變扁平,細(xì)胞數(shù)量明顯減少,符合衰老細(xì)胞的特征,相對于Eto模型組,200 μg/mL ASP-1處理組(ASP-1+Eto)細(xì)胞變小,衰老狀態(tài)減輕。衰老細(xì)胞數(shù)量的減少表明細(xì)胞衰老狀態(tài)的減輕,如圖11所示,藍(lán)染的細(xì)胞表示衰老細(xì)胞,對照組細(xì)胞(Con)無衰老陽性細(xì)胞,Eto模型組藍(lán)染細(xì)胞較多,表達(dá)高的SA-β-gal活性水平,200 μg/mLASP-1處理組(ASP-1+Eto)SA-β-gal藍(lán)染細(xì)胞明顯減少,表達(dá)低的SA-β-gal活性水平。SA-β-gal可能來源于溶酶體β-半乳糖苷酶,細(xì)胞發(fā)生衰老時(shí)溶酶體破裂在釋放水解酶的同時(shí)釋放SA-β-gal[38],Eto誘導(dǎo)細(xì)胞損傷使溶酶體生物合成增加,細(xì)辛多糖通過抑制溶酶體的生物合成起到衰老保護(hù)作用。

圖10 不同處理組細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

圖11 ASP-1對Eto處理的A10細(xì)胞中SA-β-gal活性的影響

3 結(jié)論

本文通過響應(yīng)面法優(yōu)化細(xì)辛多糖提取工藝,提取溫度、提取時(shí)間和液料比三個(gè)因素及其交互作用對細(xì)辛多糖得率均有不同程度的影響,模型預(yù)測得到細(xì)辛多糖最佳提取條件為:提取溫度90 ℃,提取時(shí)間2.37 h,液料比40∶1 mL/g,多糖得率為10.20%。

血管平滑肌細(xì)胞的衰老與動(dòng)脈粥樣硬化等血管疾病密切相關(guān)[39-40]。衰老細(xì)胞一方面表現(xiàn)為細(xì)胞增殖阻滯,MTT實(shí)驗(yàn)證明Eto誘導(dǎo)A10細(xì)胞發(fā)生增殖阻滯,ASP-1處理組細(xì)胞顯示強(qiáng)的增殖活性,具有劑量依賴性保護(hù)作用;另一方面,衰老細(xì)胞的基因和蛋白表達(dá)譜發(fā)生改變[41]。衰老細(xì)胞通常體積變大,衰老β-半乳糖苷酶活性水平上調(diào),通過形態(tài)學(xué)觀察及SA-β-gal染色結(jié)果表明:ASP-1可明顯抑制Eto誘導(dǎo)的A10細(xì)胞衰老形態(tài)變化,降低Eto誘導(dǎo)的SA-β-gal活性水平增加。綜上:ASP-1預(yù)處理對Eto誘導(dǎo)的大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞衰老具有保護(hù)作用,A10細(xì)胞衰老程度的降低有利于其保持正常的細(xì)胞功能和維持血管穩(wěn)態(tài),進(jìn)而減輕血管疾病的發(fā)生發(fā)展。

Eto通過DNA損傷效應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞衰老,DNA損傷累積可能會(huì)導(dǎo)致端粒功能障礙,有文獻(xiàn)證明端粒重復(fù)序列結(jié)合因子2(TRF2)是血管平滑肌細(xì)胞衰老的主要調(diào)節(jié)因子[42]。因此,接著將從TRF2及衰老信號(hào)通路p53-p21、p16-pRb方向探討ASP-1發(fā)揮衰老保護(hù)作用的機(jī)制,并解析ASP-1的結(jié)構(gòu)。深入研究細(xì)辛多糖對血管細(xì)胞衰老的作用機(jī)制,發(fā)掘中藥細(xì)辛對血管衰老的確切防治作用,將有利于細(xì)辛資源的綜合利用。