β-防御素130在大腸桿菌中的串聯(lián)表達(dá)、純化及生物活性分析

藺艷君，董彬

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β-防御素130在大腸桿菌中的串聯(lián)表達(dá)、純化及生物活性分析

藺艷君1,2，董彬1

1 濱州學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院 山東省黃河三角洲野生植物資源開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，山東 濱州 256603 2 濱州學(xué)院 藝術(shù)學(xué)院，山東 濱州 256603

為了研究抗菌肽β-防御素130的生物學(xué)活性和實(shí)現(xiàn)大規(guī)模制備，通過改良其分子結(jié)構(gòu)，構(gòu)建表達(dá)載體pET28a-3×β-defensin130，利用大腸桿菌BL21 (DE3) 作為宿主細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)后為水溶性蛋白。對(duì)純化后抗菌肽進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、MTT實(shí)驗(yàn)和溶血性實(shí)驗(yàn)確定其生物活性。最終成功制備出25 kDa的重組蛋白，對(duì)金黃色葡萄球菌 (ATCC 25923)(45 μg/mL) 和單增李斯特菌 (ATCC 221633) (80 μg/mL) 等革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌都表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗菌活性，且其抗菌活性不受溫度、pH值和蛋白酶消化等影響，MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示其對(duì)HEK293細(xì)胞無(wú)毒性且對(duì)兔源紅細(xì)胞具有極低的溶血性。這將為新型抗菌肽的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)并推動(dòng)抗生素替代產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展。

防御素，抗菌肽，原核表達(dá)，蛋白純化，抗菌活性

抗生素濫用導(dǎo)致的耐藥性目前已成為一個(gè)嚴(yán)重的公共健康問題，近年來(lái)，“超級(jí)細(xì)菌”等事件的發(fā)生更顯示出這一問題的嚴(yán)重性。因此，尋找和開發(fā)新型高效抗生素替代品將是解決這一問題的必然選擇?？咕?(Antimicrobial peptides，AMPs) 是一類具有廣譜抗菌性，能抗真菌、病毒、寄生蟲、革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌的小分子多肽類物質(zhì)，其最受矚目的特性是不易產(chǎn)生耐藥性[1-4]。目前，已從哺乳動(dòng)物、植物、無(wú)脊椎動(dòng)物等不同物種中鑒定出2 800多個(gè)AMPs，其中大多數(shù)AMPs含有5–100個(gè)氨基酸[5]。防御素是富含半胱氨酸的一類陽(yáng)離子多肽，主要包含α、β和θ這3個(gè)亞基家族。大多數(shù)防御素包含18–50個(gè)氨基酸，在免疫系統(tǒng)抵御外來(lái)感染侵略過程中發(fā)揮著重要作用。目前，通過計(jì)算機(jī)搜尋策略鑒別出的β-防御素人源編碼基因有28個(gè)。β-防御素130于2014年發(fā)現(xiàn)[6]，在人源巨噬細(xì)胞中表達(dá)，已經(jīng)證實(shí)在巨噬細(xì)胞消除瘧原蟲抵抗瘧疾的過程中有重要作用。由于在巨噬細(xì)胞中的含量較低，提取和純化難度較大，無(wú)法進(jìn)行大規(guī)模制備，導(dǎo)致對(duì)β-防御素130的制備和功能研究報(bào)道不多。

目前，為了改善抗菌肽的抗菌功能，常利用不同來(lái)源的宿主細(xì)胞進(jìn)行蛋白的重組表達(dá)，例如大腸桿菌、畢赤酵母和萊茵衣藻等[7-9]。除此之外，將抗菌肽進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)也是提高抗菌肽活性的一種策略。Fuquan Hu實(shí)驗(yàn)室[10]成功將8個(gè)hPAB-β在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)串聯(lián)表達(dá)，我們?cè)谥暗难芯縖9]中，利用萊茵衣藻成功表達(dá)了3個(gè)拷貝的Mytichitin-A，結(jié)果均顯示串聯(lián)抗菌肽具有更好的抗菌效果和抗菌譜。

與傳統(tǒng)的提取分離方法相比，基因工程法是一種高效的大規(guī)模生產(chǎn)方法，大腸桿菌具有DNA操作簡(jiǎn)單、培養(yǎng)成本低、表達(dá)量高、生產(chǎn)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，有利于蛋白質(zhì)表達(dá)等優(yōu)勢(shì)。在本研究中，選用大腸桿菌作為宿主細(xì)胞，表達(dá)含有3拷貝的β-防御素130 DNA編碼序列。隨后，用Ni柱進(jìn)行親和純化，分析其抗菌活性、溶血活性、細(xì)胞毒性和穩(wěn)定性。為新型抗菌肽的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)并推動(dòng)抗生素替代產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細(xì)胞和質(zhì)粒

大腸桿菌XL1-blue、BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞、HEK293細(xì)胞和pET28a質(zhì)粒均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、DNA分子量marker和蛋白marker等均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；Ni SepharoseTM6 Fast Flow蛋白純化介質(zhì)購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare公司；NC膜購(gòu)自北京索來(lái)寶公司；His抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司。木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶購(gòu)自北京索萊寶公司。其他常規(guī)試劑均購(gòu)自北京索來(lái)寶公司。

1.1.3 儀器

超聲波細(xì)胞破碎儀 (寧波新芝，JY98-IIIDN)；恒溫?fù)u床 (天津歐諾，JNY-110B)；核酸微量測(cè)定儀 (德國(guó)Eppendorf，BioSpectrometer D30)；瓊脂糖水平電泳儀 (北京六一，DYCP-32B)；臺(tái)式高速離心機(jī) (德國(guó)Eppendorf，5424)；高速冷凍離心機(jī) (美國(guó)Thermo Fisher, Sorvall ST8R)；蛋白垂直電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)膜儀 (北京六一，DYCZ-24KF、DYCZ-40K)；凝膠成像儀 (上海勤翔，GenoSens 1860)；酶標(biāo)儀 (南京德鐵，HBS-1096A)。

1.2 方法

1.2.1pET28a-3×β-防御素130載體構(gòu)建

β-防御素130的編碼基因序列為ATGTATCG CTCTTAAAGGCGTCTGCCGTGATAAGCTCTGTAGTACTCTAGACGATACCATAGGGATATGTAATGAAGGTAAAAAGTGCTGTAGAAGGTGGTGGATTCTGGAACCCTATCCAACCCCGGTCCCAAAAGGTAAGAGCCCTGGTACCGGTGTTATTCCTGGCCA，3×β-防御素130的編碼序列為3個(gè)β-防御素130直接串聯(lián)組成，由蘇州金維智公司合成并克隆至pUC57載體上，通過RⅠ和Ⅰ兩個(gè)酶切位點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行雙酶切，獲得目的基因。對(duì)pET28a載體使用同樣的內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，回收后與目的基因連接，并采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入XL1-blue感受態(tài)細(xì)胞，隨后從平板中挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2 融合蛋白的表達(dá)與優(yōu)化

IPTG誘導(dǎo)濃度的條件優(yōu)化：挑取含有pET- 28a-3×β-defensin130載體的大腸桿菌BL21(DE3)單克隆菌落，在含卡那霉素 (120 μg/mL) 的100 mL LB培養(yǎng)基中37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng) (12 h)。將50 mL過夜培養(yǎng)物接種于1 L培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)。當(dāng)600值達(dá)到0.6時(shí)，將培養(yǎng)溫度降至16 ℃，同時(shí)加入不同濃度 (0.05– 1.2 mmol/L) 的IPTG誘導(dǎo)劑，連續(xù)培養(yǎng)16 h。隨后，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集菌體進(jìn)行超聲破碎。以未誘導(dǎo)的含pET28a(+)載體的大腸桿菌BL21 (DE3) 作為蛋白表達(dá)的載體對(duì)照，進(jìn)行SDS-PAGE分析。IPTG誘導(dǎo)時(shí)間的條件優(yōu)化：挑取含有pET-28a-3×β-防御素130載體的大腸桿菌BL21(DE3)單克隆菌落，在含卡那霉素(120 μg/mL) 的100 mL LB培養(yǎng)基中37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng) (12 h)。將50 mL過夜培養(yǎng)物接種于1 L培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)。當(dāng)600值達(dá)到0.6時(shí)，將培養(yǎng)溫度降至16 ℃，同時(shí)加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑，連續(xù)培養(yǎng)，每2 h取一次樣。隨后，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集菌體進(jìn)行超聲破碎。以未誘導(dǎo)的含pET28a(+)載體的大腸桿菌BL21 (DE3) 作為蛋白表達(dá)的載體對(duì)照，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.3 融合蛋白的親和純化

將1 L誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體重新懸浮于20 mL的裂解緩沖液中 (50 mmol/L Hepes，0.5 mol/L NaCl，5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L PMSF，10%甘油，20 mmol/L咪唑，4 mmol/L β-巰基乙醇， 1 mg/mL溶菌酶，pH 7.4)，冰上孵育20 min，超聲破碎后4 ℃、12 000 r/min離心10 min，吸出上清液，加入預(yù)先使用裂解液平衡好的Ni-NTA蛋白純化柱在4 ℃下結(jié)合6 h，結(jié)合完畢后流出結(jié)合液，用3倍柱體積的裂解液漂洗3遍，最后用含500 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，然后進(jìn)行透析除去咪唑，最后超濾管離心濃縮獲得目的蛋白，使用Brandford法測(cè)定蛋白濃度。

1.2.4 SDS-PAGE和Western blotting分析

將定量的蛋白樣品與2×SDS-PAGE上樣緩沖液以1∶1的比例混合，煮沸10 min。在15%的SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行分離，每孔上樣20 μg蛋白，電泳條件為150 V、1.5 h，進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色或電轉(zhuǎn)移至0.45 μm的硝酸纖維素膜進(jìn)行免疫印跡分析。使用5%脫脂奶粉封閉印跡膜1 h，然后用抗His抗體 (1∶2 000) 孵育1 h。將印跡膜用TBST洗滌3次，加入含HRP偶聯(lián)的山羊抗兔二抗 (1∶5 000) 的封閉液再孵育1 h。使用TBST洗滌3次之后，使用ECL顯色液進(jìn)行顯影，掃膜儀拍照[11]。

1.2.5 最小抑菌濃度測(cè)定

以PBS作為對(duì)照組，使用PBS稀釋3×β-防御素130 (10–120 μg/mL)，96孔板每孔加入20 μL稀釋液。受試細(xì)菌培養(yǎng)至濃度為2×105–7×105CFU/mL，每孔100 μL菌懸液加入96孔板。然后37 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h，最后使用酶標(biāo)儀測(cè)定600。所有試驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)進(jìn)行3次[12]。

1.2.6 抑菌圈測(cè)定

首先，從平板中挑取受試菌落于含有5 mL LB培養(yǎng)基的15 mL試管，在37 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)。當(dāng)濃度達(dá)到2×105CFU/mL時(shí)，取500 μL的細(xì)胞液涂布在LB平板上。使用8 mm打孔器打孔，將純化的3×β-防御素130分別在4 ℃、25 ℃、37 ℃、65 ℃、90 ℃下孵育1 h，然后加入孔中，孵育12–24 h，觀察平板抑菌圈大小。測(cè)定pH值耐受實(shí)驗(yàn)時(shí)，將純化的3×β-防御素130干粉分別使用pH值為2、4、6、8、10的溶液進(jìn)行溶解，加入平板孔中，孵育12–24 h，觀察平板抑菌圈大小。測(cè)定蛋白酶耐受實(shí)驗(yàn)時(shí)將純化的3×β-防御素130分別用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶在37 ℃下處理1 h，隨后加入平板孔中，孵育12–24 h，觀察平板抑菌圈大小。所有試驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)進(jìn)行3次[13]。

1.2.7 MTT法

HEK293細(xì)胞作為候選細(xì)胞系，將不同濃度的3×β-防御素130 (0、20、40、60、80、100、120、140、160 μg/mL) 與HEK293細(xì)胞在96孔板中孵育72 h，然后向每孔中加入20 μL甲基噻唑四唑(MTT，5 mg/mL)，在37 ℃下再孵育4 h。在該板上加入二甲基亞砜 (DMSO)，以溶解藍(lán)紫色的甲瓚晶體。最后，用酶標(biāo)儀測(cè)量570 nm的吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)公式計(jì)算細(xì)胞存活率(%)=3×β-防御素130 處理的吸光度/對(duì)照細(xì)胞的吸光度×100%。所有試驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)進(jìn)行3次。

1.2.8 溶血性試驗(yàn)

將新西蘭白兔全血樣品置于含K2EDTA的離心管中，1 000 r/min離心5 min，除去血漿。用1×PBS洗滌3次，調(diào)整紅細(xì)胞濃度為4%。將90 μL的紅細(xì)胞與10 μL的3×β-防御素130混合，37 ℃再孵育30 min，1 500 r/min離心10 min，測(cè)定上清液在540 nm處的吸光值。分別用1×PBS和1%的Triton X-100作為0%和100%溶血對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET28a-3×β-防御素130載體的構(gòu)建

β-防御素130由171 bp的核苷酸序列編碼，串聯(lián)重復(fù)序列由3個(gè)拷貝的編碼序列組成，將合成的3×β-防御素130編碼序列分別插入到pET28a(+)載體中，RⅠ和Ⅰ位點(diǎn)分別位于5′端和3′端。圖1是N-末端含有6×His標(biāo)簽的pET28a-3×β-defensin130載體示意圖。

2.2 3×β-防御素130的表達(dá)與優(yōu)化

IPTG誘導(dǎo)劑優(yōu)化結(jié)果如圖2A所示，在誘導(dǎo)細(xì)胞中按預(yù)期表達(dá)了25 kDa蛋白，根據(jù)條帶灰度，不同濃度的IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)水平?jīng)]有差異(圖2A)。為了優(yōu)化誘導(dǎo)時(shí)間，自IPTG加入到0.5 mmol/L的最終濃度后，每2 h收集培養(yǎng)細(xì)胞。將8 h 誘導(dǎo)細(xì)胞的表達(dá)水平設(shè)為100%時(shí)，10、12、14、16 h內(nèi)3×β-防御素130的表達(dá)量分別為330%、328%、327%和332% (圖2B)。以上結(jié)果表明，在16 ℃條件下表達(dá)3×β-防御素130的最佳培養(yǎng)條件是0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)12 h。

圖1 載體元件示意圖

圖2 3×β-防御素130的表達(dá)及培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.3 3×β-防御素130的純化及Western blotting分析

為了確定重組蛋白的水溶性，我們用最佳培養(yǎng)條件培養(yǎng)細(xì)胞。如圖3A所示，重組3×β-防御素130在大腸桿菌中以可溶性形式表達(dá)，Western blotting證實(shí)了3×β-防御素130的特異性 (圖3B)。親和純化后的蛋白使用SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色以及Western blotting分析，得到25 kDa 3×β-防御素130 (圖3C–D)。

2.4 3×β-防御素130抗菌譜的測(cè)定

用最小抑菌濃度法測(cè)定3×β-防御素130的抗菌譜，結(jié)果見表1。重組3×β-防御素130對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌均有抑菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌濃度最低 (ATCC 25923) 為45 μg/mL，對(duì)枯草芽孢桿菌 (AHU 1035) 和單增李斯特菌 (ATCC 21633) 的最小抑菌濃度分別為50 μg/mL和80 μg/mL。對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌O157 (ATCC 35150)、腸炎桿菌 (ATCC 10467) 和綠膿桿菌 (ATCC 27853) 的最小抑菌濃度分別為60、55、50 μg/mL。

圖3 3×β-防御素130的純化及Western blotting分析

表1 純化后的重組3×β-防御素130抗菌譜

2.5 3×β-防御素130對(duì)溫度、pH值和蛋白酶消化的耐受性

選用金黃色葡萄球菌 (ATCC 25923) (40 μg/mL) 對(duì)3×β-防御素130進(jìn)行抑菌耐受活性分析。3×β-防御素130經(jīng)不同溫度(4 ℃、25 ℃、37 ℃、65 ℃、90 ℃) 處理后，抑菌活性無(wú)明顯變化 (圖4A)。如圖4B所示，pH值并未影響3×β-防御素130的生物活性，經(jīng)不同pH值 (2、4、6、8、10) 處理的3×β-防御素130，其抑菌效果沒有差異。為了分析蛋白酶對(duì)3×β-防御素130生物活性的影響，采用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶處理3×β-防御素130。結(jié)果表明，3×β-防御素130對(duì)蛋白酶消化具有一定耐受性，其抑菌作用不受影響 (圖4C)。

圖4 3×β-防御素130對(duì)溫度、pH值和蛋白酶消化的耐受性分析

2.6 3×β-防御素130的細(xì)胞毒性及溶血性

與對(duì)照組相比，重組3×β-防御素130并未改變HEK293細(xì)胞的存活率，表明3×β-防御素130在20–120 μg/mL濃度下沒有細(xì)胞毒性 (圖5A)。此外，純化的3×β-防御素130加入0–120 μg/mL重組3×β-防御素130后，對(duì)兔紅細(xì)胞無(wú)溶血性 (圖5B)。當(dāng)?shù)鞍诐舛确謩e為160 μg/mL和200 μg/mL時(shí)，溶血活性分別小于0.8%和1.6%，表明3×β-防御素130幾乎不具有溶血性。

3 討論

將3×β-防御素130構(gòu)建至表達(dá)載體pET28a上，其中T7作為啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，T7-Ter作為終止子終止轉(zhuǎn)錄。結(jié)果表明，3×β-防御素130在中的分子量為25 kDa。從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中提取β-防御素130是一種高成本、低效率的生產(chǎn)方法。鑒于其制備效率低下，我們采用原核生物大腸桿菌作為細(xì)胞工廠用于大規(guī)模生產(chǎn)重組β-防御素130。重組3×β-防御素130在大腸桿菌中成功表達(dá)且為可溶性蛋白，并且我們優(yōu)化了IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間等培養(yǎng)條件。許多利用大腸桿菌重組表達(dá)的抗菌肽，如雜合AL32-P113[14]和HG31-P-113[15]，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，均成功表達(dá)并且提高了產(chǎn)量和抗菌活性。這些結(jié)果表明大腸桿菌可能是制備3×β-防御素130的合適宿主。大腸桿菌的遺傳背景清楚、生長(zhǎng)速度快、培養(yǎng)成本低，蛋白表達(dá)效率同畢赤酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞相比可以高出好幾倍，同時(shí)所獲得大多數(shù)蛋白的活性較高，穩(wěn)定性也較好。從大腸桿菌表達(dá)的3×β-防御素130抗菌活性測(cè)試中可以看出，其對(duì)革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性和穩(wěn)定性。這些進(jìn)一步證明抗菌肽的串聯(lián)表達(dá)也是提高抗菌肽活性的一種有效策略。

為了進(jìn)一步探討3×β-防御素130在不同環(huán)境條件下的應(yīng)用，對(duì)3×β-防御素130進(jìn)行了極端pH變化、熱處理和蛋白酶消化試驗(yàn)。結(jié)果表明，在pH變化和熱處理的不同培養(yǎng)條件下，3×β-防御素130的抗菌活性不受影響。此外，本實(shí)驗(yàn)研究了3×β-防御素130對(duì)木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶的抗性。結(jié)果表明，3×β-防御素130具有作為商業(yè)抗生素替代品和食品防腐劑的潛力。溶血試驗(yàn)表明，當(dāng)濃度低于120 μg/mL時(shí)，3×β-防御素130對(duì)兔紅細(xì)胞無(wú)溶血活性，當(dāng)濃度分別為160 μg/mL和200 μg/mL時(shí)，3×β-防御素130對(duì)兔紅細(xì)胞的溶血活性分別小于0.8%和1.6%，表明3×β-防御素130對(duì)兔紅細(xì)胞無(wú)溶血活性。相比之下，當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?00 μg/mL時(shí)[14]，有報(bào)道的混合肽L31-P113和AL32-P113的溶血活性超過1.8%。當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?28 μg/mL時(shí)[16]，LH28的溶血性為35%。這些結(jié)果表明，與其他抗菌肽相比，3×β-防御素130具有較低的溶血活性。此外，大腸桿菌表達(dá)的3×β-防御素130對(duì)HEK293細(xì)胞沒有毒性，因此3×β-防御素130是一種安全的抗生素替代品。

在本實(shí)驗(yàn)中，使用6×His作為蛋白標(biāo)簽進(jìn)行抗菌肽的重組表達(dá)，分子量較小，對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和功能影響不大，便于純化，是目前應(yīng)用最多的標(biāo)簽，且已有大量抗菌肽以6×His作為標(biāo)簽在大腸桿菌和畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)且不影響生物活性。另外，利用大腸桿菌進(jìn)行蛋白表達(dá)有可能因蛋白錯(cuò)誤折疊導(dǎo)致以水不溶的包涵體形式存在于細(xì)胞中，越來(lái)越多的融合標(biāo)簽被開發(fā)應(yīng)用于蛋白的促溶，如MBP和GST標(biāo)簽等。本實(shí)驗(yàn)中的串聯(lián)抗菌肽未出現(xiàn)包涵體，可能是由于抗菌肽結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單容易折疊形成水溶性蛋白。

綜上所述，β-防御素130在大腸桿菌中作為一種可溶性蛋白成功表達(dá)，并對(duì)常見的革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌具有較強(qiáng)的抗菌活性，且其抗菌活性不受溫度、pH值和蛋白酶消化的影響。此外，大腸桿菌中表達(dá)的3×β-防御素130對(duì)HEK293細(xì)胞沒有顯示毒性，并且顯示出相對(duì)低的溶血活性。

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Tandem expression, purification and biological activity of recombinant multimeric β-defensin130 in

Yanjun Lin1,2, and Bin Dong1

1 Shandong Provincial Engineering and Technology Research Center for Wild Plant Resources Development and Application of Yellow River Delta, College of Biological and Environmental Engineering, Binzhou University, Binzhou 256603, Shandong, China 2 College of Art and Design, Binzhou University, Binzhou 256603, Shandong, China

To improve and broaden the antimicrobial activity of β-defensin130, 3 copies of β-defensin130 encoding sequences were synthesized and cloned into pET28a (+) expression vector, and expressed inBL21 (DE3) as a 25 kDa soluble protein. The affinity purified 3×β-defensin 130 displayed antimicrobial activity against not onlyGram-positive strains including(ATCC 25923) (45 μg/mL) and(ATCC 221633) (80 μg/mL) but also Gram-negative strains. Furthermore, the antimicrobial activity of β-defensin130 was not affected by temperature, pH and proteinase digestion. In addition,-derived 3×β-defensin130 was not toxic to HEK 293 cells and showed a relatively low hemolytic activity against rabbit erythrocytes. Our study proves 3×β-defensin130 expressed inis stable, non-cytotoxic and low-hemolytic active with great potential as alternative antibiotics.

defensin, antimicrobial peptide, prokaryotic expression, protein purification, antimicrobial activity

November 28, 2018;

April 18, 2019

Natural Science Foundation of Shandong Province (No. ZR2018PC010), the Doctor Foundation of Binzhou University (No. 2018Y09), Natural Science Program of Binzhou University (No. BZXYG1811).

Bin Dong. Tel: +86-543-3190042; E-mail:dongbin@bzu.edu.cn

山東省自然科學(xué)基金 (No. ZR2018PC010)，濱州學(xué)院博士科研啟動(dòng)費(fèi)項(xiàng)目 (No. 2018Y09)，濱州學(xué)院科研項(xiàng)目 (No. BZXYG1811)資助。

10.13345/j.cjb.180492

藺艷君, 董彬. β-防御素130在大腸桿菌中的串聯(lián)表達(dá)、純化及生物活性分析. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(6): 1088–1096.

Lin YJ, Dong B. Tandem expression, purification and biological activity of recombinant multimeric β-defensin130 in. Chin J Biotech, 2019, 35(6): 1088–1096.

(本文責(zé)編 郝麗芳)