酒精依賴和肌萎縮側(cè)索硬化因果關系的孟德爾隨機化分析*

徐州醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學教研室(221004)

黃林玉 王鳴岐 余星皓 曾 平△ 黃水平△

【提 要】 目的 采用孟德爾隨機化方法探索飲酒行為和肌萎縮側(cè)索硬化發(fā)病風險的因果關系。方法 利用大樣本全基因組關聯(lián)研究數(shù)據(jù)，確定與酒精依賴密切相關的遺傳位點作為工具變量，通過逆方差加權(quán)法、MR-Egger回歸法等兩樣本孟德爾隨機化方法，以比值比(OR值)作為結(jié)局指標對因果關系進行評價。結(jié)果 本研究共納入476例男性酒精依賴患者和1358例男性對照，IVW方法估計的OR值為1.12(95%可信區(qū)間：1.02-1.24，P=0.021)，MR-Egger回歸結(jié)果表明遺傳多效性不會對結(jié)果造成偏倚(截距=-0.036，P=0.755)。結(jié)論 本研究采用兩樣本孟德爾隨機化的方法，表明在男性中嚴重的酒精依賴會增加肌萎縮側(cè)索硬化的風險。

肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)，俗稱“漸凍癥”，是一種致命的退行性神經(jīng)疾病，歐洲人群年發(fā)病率約為2～3/10萬，且男性患者多于女性[1]。ALS初期臨床表現(xiàn)為肌束震顫、吞咽和講話困難；隨病程進展，運動神經(jīng)元發(fā)生不可逆的程序性凋亡進而導致全身肌肉萎縮，患者逐漸失去運動能力，最終往往因呼吸系統(tǒng)衰竭而窒息死亡；中位生存期約為3年[2-3]。目前暫無針對ALS的有效臨床診斷及治療方法；利魯唑是目前唯一一個美國食品藥品管理局批準用于治療ALS的藥物，但僅能延長患者3～6個月的生存期[4-5]。

在所有ASL病例中，約有10%的ALS顯示家族聚集性的特點，而其余90%為散發(fā)病例。ALS的致病機制和病因尚未明確，遺傳因素和環(huán)境因素都會影響ALS的發(fā)展，其中20%的病例可能與遺傳和基因缺陷有關。目前已研究發(fā)現(xiàn)30多種ALS相關致病基因[6]，主要包括SOD1[7]，TDP43和C9orf72。流行病學研究表明，吸煙、飲酒等行為因素[8-11]以及重金屬中毒[12]等環(huán)境因素都和ALS存在一定關聯(lián)。

識別ALS的病因?qū)ζ漕A防、診斷和治療至關重要。傳統(tǒng)的觀察性流行病學方法，如病例對照研究、隊列研究，可用來探索復雜疾病的病因，但往往受到反向因果關聯(lián)及潛在混雜因素(如，吸煙、飲酒和飲食等)的影響，從而影響其論證病因假設的能力。隨機對照試驗(randomized controlled trial，RCT)因其可比性好、因果關聯(lián)時序合理、有效控制偏倚的優(yōu)點，被視為檢驗因果關系的“金標準”[13]。然而，RCT難以控制樣本的代表性，需要大量的人力物力及財力，且經(jīng)常受到倫理學限制，因而實際中實施難度較大。

1986年，學者Katan[14]提出了孟德爾隨機化(Mendelian randomisation，MR)的概念，具體思想是：配子在形成過程中遵循孟德爾隨機分配定律，即親代等位基因隨機分配給子代；如果基因型決定表型，基因型可通過表型與疾病發(fā)生關聯(lián)，因此可以使用基因型作為工具變量[15](instrumental variable，IV)來推斷表型與疾病之間的因果關聯(lián)。MR是一種在觀察性研究中以IV為基礎進行因果推斷的方法，與中間表型或環(huán)境暴露有關聯(lián)的遺傳變異可以作為中間變量，來估計暴露對疾病結(jié)局的影響。由于基因是人類一出生即決定的，因此不會受到后天的環(huán)境因素、生活方式、行為因素等常見的混雜因素的影響；且符合因果判定中“先因后果”的時序性要求，可以有效避免反向因果關聯(lián)的干擾[16]。但是，MR的應用需要滿足三個前提假設[17]：(1)作為IV的遺傳變異與待研究的暴露因素密切相關；(2)IV與已知的混雜因素不存在關聯(lián)；(3)IV和疾病結(jié)局無直接關聯(lián)，即IV除了通過暴露因素以外，不可以通過其它途徑來影響疾病結(jié)局(見圖1)。近年來，大樣本的全基因組關聯(lián)研究(genome-wide association study，GWAS)的廣泛應用和公共數(shù)據(jù)的公開，使得通過MR來廣泛研究不同暴露和ALS的因果關聯(lián)成為可能[18]。

圖1 多個工具變量孟德爾隨機化的圖模型*實線表示存在關聯(lián)，虛線表示不存在關聯(lián)

作為一個常見的生活行為暴露，飲酒與ALS的關系引起了廣泛關注。先前一項大型瑞典國家隊列研究的結(jié)果表明[11]，患有酒精使用障礙的人群和未患有酒精使用障礙的對照組相比，ALS的發(fā)病風險明顯降低，標化發(fā)病率為0.54[95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)：0.45～0.63，P=7.04×10-14]。有兩項基于人群的病例對照研究表明，高酒精攝入和ALS風險降低有關，優(yōu)勢比(odds ratio，OR)分別為0.91(95%CI：0.84～0.99，P=0.03)[19]和0.52(95%CI：0.40～0.75，P=4.54×10-5)[10]。一項包括5個觀察性研究的關于酒精消耗與ALS的meta分析表明[20]，飲酒可降低患ALS風險(OR=0.57，95%CI：0.51～0.64，P=2.88×10-22)。這些觀察性研究的結(jié)果暗示酒精對ALS可能具有潛在的神經(jīng)保護作用。然而，也有研究表明飲酒可能增加ALS的潛在發(fā)病風險。例如，有兩項關于日本人群和新西蘭人群的病例對照研究報告飲酒和ALS發(fā)病風險的OR值分別為1.10(95%CI：0.70～1.50，P=0.62)[21]和1.10(95%CI：0.50～2.50，P=0.82)[22]，但這種關聯(lián)在調(diào)整吸煙的混雜后不存在統(tǒng)計學意義。此外，最近的一項meta分析[23]證實飲酒和ALS風險之間不存在關聯(lián)。從上可見，目前尚不清楚飲酒與ALS之間是否存在因果關系。因此，本文嘗試通過MR來探索飲酒與ALS的關系，并估計其效應大小。

研究設計及方法

1.研究設計

本研究采用兩樣本MR[24]作為估計酒精依賴和ALS發(fā)病風險因果關系的方法。兩樣本MR研究是以最早的一階段MR研究為基礎發(fā)展形成的。所謂兩樣本，即在一個樣本獲得GWAS與酒精依賴(暴露因素)的關聯(lián)數(shù)據(jù)，確定與酒精依賴密切相關的遺傳變異；通過另一個樣本獲得GWAS與ALS(疾病結(jié)局)的關聯(lián)數(shù)據(jù)，再結(jié)合與酒精依賴相關聯(lián)的遺傳變異，進而確定可以作為工具變量的遺傳變異(即與酒精依賴和ALS均密切相關的遺傳變異)。兩樣本MR要求兩樣本相互獨立，來自同一人群，具有相似的性別、年齡以及種族特征。任何一種遺傳變異類型都可以作為IV，本研究選擇單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)位點作為工具變量類型。

2.數(shù)據(jù)來源

以2009年發(fā)表在Archives of General Psychiatry上的一項關于酒精依賴的GWAS作為酒精依賴遺傳變異的數(shù)據(jù)庫[25]。該項研究共包括476個男性病例和1358個男性對照，所有個體均為德國人，以美國精神障礙診斷統(tǒng)計手冊(DSM-IV)的標準來定義酒精依賴，符合嚴重酒精依賴且發(fā)病年齡早于28歲者納入病例組；數(shù)據(jù)庫中共包括524396個SNPs，其中有8個SNPs和酒精依賴密切相關(P<1×10-5)。需要說明的是，通常當SNP的P<5×10-8的臨界值時才具有全基因組意義；但若以P<5×10-8作為篩選標準，在該數(shù)據(jù)庫中僅有3個SNP符合，且彼此之間存在連鎖不平衡。有研究表明，在對風險因素的每個遺傳變異進行線性回歸后，若P<1×10-5，則MR分析存在弱工具變量偏倚的可能性很小(即不違反MR應用的第一項假設)[26]，故而本研究采用P<1×10-5作為臨界標準并確定了8個和酒精依賴密切相關的SNP，提取需要的數(shù)據(jù)信息，包括每個SNP的rs編號、主要和次要等位基因，以及等位基因頻率、β系數(shù)、P值和標準誤。

關于ALS的基因型數(shù)據(jù)來自于2017年對ALS的一項GWAS分析[27]，包括12577例ALS患者和23475例健康對照，所有個體均為歐洲血統(tǒng)。數(shù)據(jù)庫中包括7740344個與ALS有關的遺傳變異。在ALS基因型數(shù)據(jù)庫中篩選和酒精依賴密切相關的8個SNP，最終確定了7個和酒精依賴、ALS均存在關聯(lián)的具有全基因組意義(P<1×10-5)的SNPs作為工具變量。但是，有3個SNPs兩兩之間存在明顯的連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)，分別是rs7590720、rs1344694及rs705648(rs1344694-rs7590720：r2=0.739；rs1344694-rs705648：r2=0.568；rs7590720-rs705648：r2=0.776)。為避免LD對因果估計結(jié)果造成偏倚及過度估計，本研究依次納入3個SNP的其中之一進行MR分析，即每次分析有5個SNP作為遺傳工具變量。本文所有的統(tǒng)計分析均在R軟件3.4.4版本中進行。

3.兩樣本MR方法

(1)Wald比值和逆方差加權(quán)法估計效應

IVW模型(inverse-variance weighting，IVW)是一種加權(quán)線性回歸模型，所謂逆方差加權(quán)，是聚集兩個或多個隨機變量的方差總和并使之最小化的一種方法，且每個隨機變量與它的方差成反比：

(2)敏感性分析

Egger′s檢驗常用來定量評價meta分析中發(fā)表偏倚的大小，用回歸方程的截距來表示[28]。在MR分析中，采用多個SNP作為工具變量，這樣就難以避免遺傳多效性對因果估計產(chǎn)生影響，使用MR-egger回歸可以評價遺傳多效性帶來的偏倚，MR-Egger回歸直線的截距說明了定向多效性的大小[29]。若回歸方程的截距接近于0，則認為遺傳多效性影響較小。使用MR-Egger回歸的前提是要滿足InSIDE假設，即遺傳變異-暴露因素和遺傳變異-疾病結(jié)局之間的影響是相互獨立的[30]。采用meta分析中“l(fā)eave-one-out”的敏感性分析方法，每次分析剔除一個SNP，將其作為測試集，剩余的SNP作為訓練集。若研究中使用非特異性SNP作為IV，即同時與目標暴露因素和其他暴露因素均存在關聯(lián)的SNP，可能會對因果估計效應產(chǎn)生影響，而敏感性分析可以評價非特異性SNP對因果關聯(lián)估計結(jié)果的影響大小。

結(jié) 果

1.工具變量SNP信息

表1列出了用于MR分析的7個遺傳工具變量的相關信息，包括染色體位置、效應等位基因及其頻率、與酒精依賴關聯(lián)的β系數(shù)及其標準誤、與ALS的關聯(lián)β系數(shù)及其標準誤。每個SNP的Wald比值及其95%置信區(qū)間的森林圖見圖2。圖2展示了既往飲酒與ALS關系的觀察性研究結(jié)果，Ji 2016表示瑞典人群隊列研究結(jié)果[11]；Meng 2016表示一項關于歐洲人群meta分析的結(jié)果[20]；Huisman 2015表示一項荷蘭人群的病例對照研究結(jié)果[19]。

圖2 工具變量SNP及三項既往關于飲酒與ALS關系的研究結(jié)的OR值及其95%CI森林圖

*IVW effect1、MR-Egger effect1表示：rs1344694納入研究；IVW effect2、MR-Egger effect2表示：rs7590720納入研究；IVW effect3、MR-Egger effect3表示：rs705648納入研究

表1 工具變量SNP信息列表

*：Chr：染色體；BP：堿基對位置；EA：效應SNP的等位基因；MAF：效應SNP的等位基因頻率；AD：酒精依賴；SE：標準誤；ALS：肌萎縮側(cè)索硬化。

2.IVW法結(jié)果

將rs1344694、rs7590720、rs705648OR分別納入研究，OR值分別為1.10(95%CI：1.00～1.22，P=0.062)、1.11(95%CI：1.01～1.22，P=0.027)、1.12(95%CI：1.02～1.24，P=0.021)，表明酒精依賴會提高ALS的發(fā)病風險約為10%。

3.敏感性分析結(jié)果

將rs1344694、rs7590720、rs705648分別納入研究，MR-Egger回歸的OR值分別為1.17(95%CI：0.47～2.93，P=0.739)、1.16(95%CI：0.54～2.48，P=0.706)、1.30(95%CI：0.53～3.16，P=0.573)，截距分別為-0.016(95%CI：0.12～0.25，P=0.897)、-0.011(95%CI：0.10～0.21，P=0.918)、-0.036(95%CI：0.12～0.26，P=0.755)，截距都很小，接近于0，且P值均大于0.05，說明遺傳多效性不會對因果效應造成偏倚。

敏感性分析結(jié)果見表2、表3及表4，結(jié)果表明，每次MR分析中，即使將和酒精依賴關聯(lián)最為密切的上述3個SNP依次移除研究，OR仍為1.11(95%CI：1.01～1.21，P=0.02)，說明不存在會對因果估計結(jié)果產(chǎn)生影響的非特異性SNP。

表2 rs1344694納入研究的敏感性分析

表3 rs7590720納入研究的敏感性分析

表4 rs705648納入研究的敏感性分析

討 論

本研究借助大規(guī)模GWAS，利用MR研究了酒精依賴和ALS的關系，結(jié)果表明男性酒精依賴和ALS之間存在因果關聯(lián)，嚴重的酒精依賴會提高ALS的發(fā)病風險。據(jù)我們所知，本研究是首次對酒精依賴和ALS進行因果關系估計的MR評價。MR研究進行因果推斷的優(yōu)點在于遺傳變異是長期而穩(wěn)定的暴露因素，且可以直接測量，不受社會環(huán)境、生活方式等混雜因素的干擾。和RCT相比，MR可以嚴格控制樣本代表性并將其隨機分配到各個觀察組。本研究采用的兩樣本MR研究，基于現(xiàn)有的公開GWAS數(shù)據(jù)，樣本量較大，可以獲得更大的把握度，經(jīng)濟且高效。

先前的觀察性研究[10-11,19-20]顯示酒精可能具有潛在的神經(jīng)保護作用而本研究暗示了飲酒對ALS的潛在風險，其機制可能與膠質(zhì)纖維酸性蛋白以及酒精的神經(jīng)毒性有關。有學者進行了動物實驗，在一項大鼠實驗中，酒精組和對照組相比，星形膠質(zhì)細胞中的GFAP密度降低[31]。而在ALS的發(fā)展過程中，一個明顯特征就是反應性星形膠質(zhì)細胞中的膠質(zhì)纖維酸性蛋白的表達增加[32]。但是，神經(jīng)毒性物質(zhì)谷氨酸堆積在神經(jīng)細胞之間對ALS有很大影響，過量的谷氨酸能直接破壞運動神經(jīng)細胞。已有研究表明，長期大量飲酒可介導谷氨酸離子型受體N-methy1-D-aspartat(NMDA受體)，造成細胞間隙谷氨酸鹽的大量堆積，導致細胞遲發(fā)型損傷[33]，這一結(jié)論也支持了本研究的結(jié)果。

本研究也具有一定的局限性，首先，兩樣本MR分析使用的是GWAS的匯總數(shù)據(jù)，目前還無法檢測暴露因素和疾病結(jié)局之間的非線性關系，也無法進行女性亞組(或男女總體人群)分析；例如，通常男性與女性在飲酒行為方面存在較大差異且ALS的發(fā)病存在性別差異，進行不同性別的MR分析可獲得更加具體的效應關系。本研究對嚴重的酒精依賴與ALS之間的因果關系進行估計，但是，由于缺少分組數(shù)據(jù)，無法探索輕度或中度酒精依賴是否與ALS也存在因果關聯(lián)，也無法研究不同飲酒種類(例如，紅酒、烈酒或啤酒)是否與ALS也存在因果關聯(lián)。其次，兩樣本MR假定兩個樣本來自相同的人群且沒有重疊。若兩樣本來自不同的人群，估計的因果效應大小可能存在偏倚。在本研究中，確保兩樣本人群均為歐洲血統(tǒng)的個體，以減少種族偏倚的影響。此外，兩樣本MR分析無法對發(fā)病機制進行解釋，因此還需要進一步探索飲酒對ALS致病機制。

總之，本研究采用兩樣本孟德爾隨機化的方法，對酒精依賴和肌萎縮側(cè)索硬化進行因果關系推斷，認為男性中嚴重的酒精依賴會導致ALS患病風險增加。