劉敏敏,周迎春
(1天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院,天津301800;2南方醫(yī)科大學(xué))
早期心肌細(xì)胞肥大是心臟負(fù)荷增加時(shí)的主要代償機(jī)制之一,隨著心臟負(fù)荷增加,可發(fā)展至心衰。阻斷胞外信號(hào)通路介導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大效應(yīng),對(duì)防治心力衰竭和心臟事件具有重要意義[1,2]。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是體內(nèi)重要的內(nèi)分泌因素,不僅調(diào)節(jié)著心血管系統(tǒng)的生理功能,在心肌肥厚和心力衰竭過(guò)程中也發(fā)揮重要作用[3,4]。AngⅡ?qū)π募〖?xì)胞的作用主要是通過(guò)血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1R)介導(dǎo)的,AT1R活化后可激活細(xì)胞膜的磷脂酶系統(tǒng),生成三磷酸肌醇和二?;视?,后兩者使胞內(nèi)Ca2+濃度升高及蛋白激酶C(PKC)活化?;罨腜KC可轉(zhuǎn)位入核,調(diào)節(jié)核內(nèi)的基因表達(dá),促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大[5]。AT1R-PKC作為介導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的經(jīng)典通路,備受關(guān)注。藥理研究顯示,黃酮類化合物具有抗心腦血管病、抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用,臨床可用于治療冠心病、心律失常、高血壓、腦栓塞、肝炎、肝硬化、肝癌等多種疾病[6]。已有研究證實(shí),榅桲總黃酮、水杉總黃酮、蕎麥花總黃酮具有抗大鼠心肌肥厚的作用[7~9]。中藥番石榴葉中含有β-谷甾醇、槲皮素、番石榴苷、無(wú)色矢車菊素、番石榴酸等成分,黃酮類化合物為其主要成分,目前關(guān)于番石榴葉總黃酮對(duì)抗心肌肥大的作用尚未見報(bào)道。2015年1~10月,我們采用AngⅡ誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞肥大,觀察番石榴葉總黃酮對(duì)心肌細(xì)胞肥大的抑制作用,并探討其作用機(jī)制。
1.1 材料 SPF級(jí)Wistar乳鼠,出生1~3 d,購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。番石榴葉總黃酮(純度55.22%)由本課題組前期提取并保存,使用時(shí)加入DMSO溶解,用DMEM稀釋。AngⅡ購(gòu)自Sigma公司,胎牛血清(FBS)購(gòu)自杭州四季青,DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司,胰蛋白酶購(gòu)自AMRESCO公司。主要儀器為CO2培養(yǎng)箱、L420臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)、倒置相差顯微鏡。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 乳鼠心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 取乳鼠心臟,清洗后剪成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊。加入胰蛋白酶消化,棄上清液,獲得心肌細(xì)胞。加入0.01%胰蛋白酶吹打混勻,制成細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/孔,置于37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)24 h。更換含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24~48 h,每24 h換液1次。加入含0.1% FBS的DMEM進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng)48 h。
1.2.2 番石榴葉總黃酮最佳作用濃度的確定 采用MTT法。將心肌細(xì)胞按2×104/孔接種于96孔板中,37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。更換含1%血清的DMEM培養(yǎng)液,37 ℃繼續(xù)孵育24 h,使細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)靜止期。棄上清,加入含15%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液和50、100、150、200、250 μg/mL番石榴葉總黃酮培養(yǎng)24 h。于藥物刺激結(jié)束前4 h,每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL。吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液,每孔加入150 μL DMSO,振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(OD)值。結(jié)果顯示,在50~200 μg/mL劑量范圍內(nèi),細(xì)胞增殖能力逐漸增強(qiáng),以200 μg/mL時(shí)最強(qiáng),250 μg/mL時(shí)細(xì)胞增殖能力開始下降。150、200、250 μg/mL組間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。故本實(shí)驗(yàn)選取50、100、150 μg/mL作為番石榴葉總黃酮的低、中、高劑量組。
1.2.3 細(xì)胞分組與處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期心肌細(xì)胞,分為模型組和番石榴葉總黃酮低、中、高劑量組。模型組加入AngⅡ 0.1 μmol/L培養(yǎng)24 h誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大,番石榴葉總黃酮低、中、高劑量組先分別加入番石榴葉總黃酮50、100、150 μg/mL預(yù)處理24 h,然后加入AngⅡ 0.1 μmol/L培養(yǎng)24 h。另設(shè)正常對(duì)照組,加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)48 h。
1.2.4 細(xì)胞面積測(cè)算 采用免疫熒光染色法。收集各組細(xì)胞,吸棄培養(yǎng)液,加入4%多聚甲醛固定,PBS洗滌。加入封閉液封閉60 min,Actin抗體溶于1% BSA-PBS中(1∶500),搖床上緩慢搖動(dòng)孵育2 h;羊抗小鼠IgG-FITC加入(1∶300),室溫側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育1 h以特異性識(shí)別Actin抗體,熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài),應(yīng)用Image-Pro Plus5.0軟件計(jì)算細(xì)胞面積。
1.2.5 細(xì)胞總蛋白含量檢測(cè) 收集各組細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解液制成細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)每孔心肌細(xì)胞數(shù)。沉淀細(xì)胞后加入150 μL NP-40溶劑細(xì)胞膜,離心取上清,用Bradford法測(cè)定細(xì)胞總蛋白含量,以BSA 0.5 mg/mL為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算各孔總蛋白含量。
1.2.6 細(xì)胞中AT1R、PKC蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。加入細(xì)胞裂解液提取心肌細(xì)胞中的蛋白,離心取上清液,BCA法測(cè)定蛋白濃度。加入上樣緩沖液,10% SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,脫脂奶粉封閉90 min,加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜,1×TBS液洗滌3次,加入二抗,37 ℃孵育,1×TBS液洗滌3次。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色,KODAK Image Station 4000MM圖像系統(tǒng)曝光,分析讀取條帶灰度值,計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
2.1 各組細(xì)胞面積比較 正常對(duì)照組、模型組和番石榴葉總黃酮低、中、高劑量組心肌細(xì)胞面積分別為(742.06±236.56)、(9 195.23±2 498.76)、(4 473.91±1 081.372)、(2 649.37±300.64)、(2 107.43±106.09)μm2。與正常對(duì)照組比較,模型組心肌細(xì)胞面積增加(P<0.01);與模型組比較,番石榴葉總黃酮各劑量組心肌細(xì)胞面積縮小,其中高劑量組小于中、低劑量組(P均<0.01)。
2.2 各組細(xì)胞總蛋白含量比較 正常對(duì)照組、模型組和番石榴葉總黃酮低、中、高劑量組心肌細(xì)胞總蛋白含量分別為(344.31±35.46)、(677.93±36.69)、(598.51±19.38)、(521.30±24.59)、(486.39±32.12)pg/孔。與正常對(duì)照組比較,模型組心肌細(xì)胞總蛋白含量升高(P<0.05);與模型組比較,番石榴葉總黃酮各劑量組心肌細(xì)胞總蛋白含量減少,其中高劑量組少于中、低劑量組(P均<0.05)。
2.3 各組細(xì)胞AT1R、PKC蛋白表達(dá)水平比較 與正常對(duì)照組比較,模型組AT1R、PKC蛋白表達(dá)升高(P均<0.01);與模型組相比,番石榴葉總黃酮各劑量組AT1R、PKC蛋白表達(dá)降低,其中高劑量組低于中、低劑量組(P均<0.01)。
表1 各組心肌細(xì)胞AT1R、PKC蛋白表達(dá)水平比較
注:與正常對(duì)照組比較,*P<0.01;與模型組比較,#P<0.01;與番石榴葉總黃酮高劑量組比較,△P<0.01。
心肌細(xì)胞肥大是以蛋白質(zhì)合成增多為主要特征的生長(zhǎng)異常,是心肌肥厚的主要病理學(xué)改變,也是引起心功能異常的重要原因。番石榴葉是我國(guó)傳統(tǒng)中藥,是桃金娘科植物番石榴的干燥葉及帶葉嫩莖。其性平、味甘澀,具有收斂止瀉、消炎止血的功效。番石榴葉中含有的黃酮類化合物具有抗心腦血管病、抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用。本研究結(jié)果顯示,向乳鼠心肌細(xì)胞加入AngⅡ后,心肌細(xì)胞面積、心肌細(xì)胞總蛋白含量顯著升高;而經(jīng)番石榴葉總黃酮預(yù)處理后再加入AngⅡ,心肌細(xì)胞面積、心肌細(xì)胞總蛋白含量明顯降低。表明番石榴葉總黃酮能夠抑制AngⅡ?qū)е碌募?xì)胞體積增大、蛋白合成增加。
AngⅡ在心肌細(xì)胞肥大的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。AngⅡ是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAAS)中最重要的活性成分,具有直接促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大的效應(yīng)以及生長(zhǎng)因子樣作用,可以在不增加血管阻力和心臟后負(fù)荷的情況下直接刺激心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成增加,導(dǎo)致心肌肥厚。AngⅡ?qū)π募〖?xì)胞的作用主要通過(guò)AT1R介導(dǎo)。AT1R是一種7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR),AT1R的過(guò)度激活可導(dǎo)致心肌肥大及纖維化,在心肌重構(gòu)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。激活的AT1R使心肌細(xì)胞G蛋白活化并與磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C發(fā)生偶聯(lián),引起心肌細(xì)胞膜外Ca2+跨膜內(nèi)流和胞質(zhì)內(nèi)Ca2+貯存池釋放增加,并誘導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK1/2、JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子、鈣調(diào)節(jié)蛋白依賴性激酶Ⅱ和PKC等相關(guān)蛋白激酶的激活,繼而誘導(dǎo)c-FOS、c-JUN等即刻早期反應(yīng)基因的表達(dá)以及相關(guān)蛋白質(zhì)合成的增加,最終造成心肌損傷[10,11]。
PKC是肥大信號(hào)傳遞中一個(gè)限速的分子開關(guān),是肥大信號(hào)傳遞的共同通路之一[12~14]。PKC是鈣/磷依賴的蛋白激酶,可催化各種蛋白質(zhì)底物上的絲氨酸或蘇氨酸殘基使其磷酸化,進(jìn)而控制細(xì)胞增殖;PKC自身也可以進(jìn)入細(xì)胞核,是核蛋白磷酸化的重要激酶[15,16]。PKC存在于心臟組織中的所有細(xì)胞內(nèi),包括肌細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和神經(jīng)元。正常情況下,PKC幾乎均以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中,當(dāng)受到外界刺激時(shí),PKC以Ca2+依賴的形式從細(xì)胞質(zhì)中移位到細(xì)胞膜上,此過(guò)程稱之為轉(zhuǎn)位。PKC向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位是其激活的標(biāo)志[17]。PKC不僅可以轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上,而且可以直接進(jìn)入細(xì)胞核,在細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄[18]。AT1R-PKC作為介導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的經(jīng)典通路,備受關(guān)注。
本研究結(jié)果顯示,向乳鼠心肌細(xì)胞加入AngⅡ后,心肌細(xì)胞中AT1R、PKC蛋白的表達(dá)顯著升高,而經(jīng)番石榴葉總黃酮預(yù)處理后再加入AngⅡ,AT1R、PKC蛋白的表達(dá)明顯降低。表明番石榴葉總黃酮能夠抑制由AngⅡ引起的心肌細(xì)胞AT1R、PKC表達(dá)激活。由此推測(cè),抑制AT1R-PKC通路的表達(dá)可能是番石榴葉總黃酮抑制心肌細(xì)胞肥大的重要機(jī)制之一。
綜上所述,番石榴葉總黃酮預(yù)處理能夠抑制AngⅡ?qū)е碌男募〖?xì)胞肥大,其機(jī)制與抑制AT1R-PKC通路激活有關(guān)。因此,番石榴葉總黃酮可能成為抗心肌細(xì)胞肥大的新藥物,明確其藥理學(xué)作用可為臨床治療心肌肥厚及改善左心室重構(gòu)提供新的治療策略。