混菌發(fā)酵納豆的工藝研究

楊 野，李佳瑩，張 曼，楊 壯，梁鵬飛，牟建樓*

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

納豆是一種傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，由納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）發(fā)酵而成[1]。其具有獨(dú)特的風(fēng)味和粘性，含有豐富的營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、氨基酸、纖維素、維生素等。它還包括多種功能成分，如納豆激酶、異黃酮、超氧化物歧化酶、磷脂、皂甙、亞油酸和亞麻酸等[2-4]，具有降血壓、抗血栓和抗腫瘤活性的作用[5-6]。到目前為止，關(guān)于納豆的研究，國外主要集中在菌株的篩選、發(fā)酵條件的優(yōu)化、納豆香氣以及納豆激酶化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性的改善方面[7-14]。國內(nèi)主要集中于對納豆的制作原料[15]、菌種培育[16-17]等方面進(jìn)行較深入的研究。而關(guān)于納豆芽孢桿菌和其他菌種聯(lián)合發(fā)酵納豆，改善納豆風(fēng)味方面的研究較少[18-21]。

與豆腐和豆?jié){等其他大豆食品相比，納豆市場相對較小。此外，納豆的香氣、味道和質(zhì)地也使它無法成為一種受歡迎的國際大豆食品[22]。納豆發(fā)酵過程由于酶和細(xì)菌的作用，大豆中的蛋白質(zhì)被分解，產(chǎn)生帶有氨腥氣味的堿性化合物，使得納豆氨腥氣味濃郁，不被我國消費(fèi)者接受。因此，本研究以市售大豆為原料，采用納豆發(fā)酵粉和乳酸菌粉混合發(fā)酵納豆，并以感官評分、揮發(fā)性鹽基氮含量和納豆激酶活力為評價指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)對納豆發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。通過乳酸菌產(chǎn)酸中和納豆發(fā)酵產(chǎn)生的堿性化合物來減弱納豆的氨腥味（氨腥味以揮發(fā)性鹽基氮含量表示），對于改善納豆風(fēng)味，并促進(jìn)納豆在我國的發(fā)展具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

黃豆：保定人人超市；納豆發(fā)酵粉和乳酸菌粉：北京川秀科技有限公司；商品納豆（燕京納豆）：保定市保百超市。

1.1.2 主要試劑

三氯乙酸（分析純）：南京邦諾生物科技有限公司；硼酸（分析純）：青島捷世康生物科技有限公司；氧化鎂（分析純）：上海聯(lián)邁生物工程有限公司；F8060福林酚（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；酪氨酸（純度≥99%）、干酪素（純度92%）：上海源葉生物科技有限公司；無水碳酸鈉（分析純）：上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司；磷酸二氫鈉和磷酸二氫鈉（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇（分析純）：南京中淳生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MBMJ-78A高壓蒸汽滅菌鍋：北京東西分析儀器科技有限公司；HH2電熱恒溫水浴鍋、Neofuge 15R高速冷凍離心機(jī)：上海力申科學(xué)儀器有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱、DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；752紫外可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 納豆發(fā)酵工藝流程及操作要點(diǎn)

挑選→清洗→室溫浸泡→高溫高壓滅菌→冷卻→接種發(fā)酵→后熟→成熟納豆

操作要點(diǎn)：選取無蟲害、無霉變、顆粒飽滿的黃豆，用清水清洗并充分浸泡，然后在121℃條件下保持20 min，冷卻至40℃，按照黃豆質(zhì)量加入0.2%的納豆發(fā)酵粉和乳酸菌粉，攪拌均勻，置于恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵24 h，發(fā)酵結(jié)束后于4℃條件下后熟24 h。

1.3.3 納豆發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

分別研究納豆芽孢桿菌和乳酸菌菌粉比例（1.0∶0、1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0、1.0∶4.0、1.0∶6.0）、發(fā)酵溫度（38 ℃、40℃、42℃、44℃、46℃）、發(fā)酵時間（18 h、21 h、24 h、27 h、30 h）對揮發(fā)性鹽基氮含量、納豆激酶酶活力和感官評價的影響。每個處理重復(fù)3次。

1.3.4 納豆發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以菌粉比例（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（C）為考察指標(biāo)，感官評分（Y1）、揮發(fā)性鹽基氮含量（Y2）和納豆激酶活力（Y3）為評價指標(biāo)，選用正交表L9（34）進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，確定納豆發(fā)酵條件的適宜組合。正交試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

農(nóng)村基層治理體系和治理制度不健全，決策、議事、協(xié)商、評估、監(jiān)督、考核程序和機(jī)制不完善，治理制度化建設(shè)滯后；基層治理制度的貫徹落實(shí)不夠，不少制度執(zhí)行難、落實(shí)差，有些制度流于形式，陷入“空轉(zhuǎn)”；制度與制度之間的銜接性、協(xié)調(diào)性和系統(tǒng)性不足，制度之間的張力加大，制度體系的集成性不強(qiáng)，難以形成有效的制度合力。

表1 納豆發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for natto fermentation process optimization

1.3.5 測定方法

揮發(fā)性鹽基氮：揮發(fā)性鹽基氮可用來衡量納豆的氨腥氣味，揮發(fā)性鹽基氮含量越少，氨腥氣味越小。參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》進(jìn)行測定。

感官評價：選擇10位經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的感官鑒評人員，采取盲評模式，從色澤、香氣、口感和組織狀態(tài)4個方面依次對納豆進(jìn)行評分，每位評價人員獨(dú)立完成，試驗(yàn)設(shè)計(jì)者不參與評分。以豆粒金黃有光澤，幾乎無氨腥味且有淡淡清香味，入口濕潤且無苦澀味，粘液多，拉絲狀態(tài)好為最高分（滿分10分），總分為各項(xiàng)指標(biāo)得分之和。最終取10人評分的平均值。為保證評分的準(zhǔn)確性，每個試驗(yàn)水平之間需用清水漱口，且每兩個試驗(yàn)水平之間需暫停1 min，以避免味覺疲勞。納豆感官評分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表2 納豆感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standard of natto

納豆激酶活力的測定：參照GB/T 28715—2012《飼料添加劑酸性、中性蛋白酶活力的測定分光光度法》中的Folin-酚法測定納豆激酶活力。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析方法

分別采用SPSS Statistics 17.0和Origin 8.6對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌粉比例對納豆品質(zhì)的影響

菌粉比例對納豆品質(zhì)的影響見圖1。由圖1A可知，當(dāng)菌粉比例為1.0∶1.5時，納豆感官評分較高（7.6分），僅比最高分（8.0分）低5.0%。此時，豆粒呈淡黃色，幾乎沒有氨腥味，粘液豐富，拉絲狀態(tài)良好。由圖1B可知，當(dāng)菌粉比例為1.0∶1.5時，揮發(fā)性鹽基氮含量達(dá)到最低（12.826 mg/100 g），比單菌發(fā)酵所產(chǎn)生的揮發(fā)性鹽基氮含量降低約58.10%。由圖1C可知，當(dāng)菌粉比例由1.0∶1.0增加至1.0∶4.0時，納豆激酶活力均比納豆芽孢桿菌單獨(dú)發(fā)酵時高，其中，在菌粉比例為1.0∶1.5時，納豆激酶活力達(dá)到最高（393.912 U/g），是納豆芽孢桿菌單獨(dú)發(fā)酵時活力的1.47倍；當(dāng)菌粉比例為1.0∶6.0時，納豆激酶活力比單菌發(fā)酵略低。這可能是由于在某個比例范圍內(nèi)，乳酸菌對納豆激酶的表達(dá)有促進(jìn)作用。各指標(biāo)的組間差異均顯著（P＜0.05）。綜合上述結(jié)果，當(dāng)菌粉比例為1.0∶1.5時，納豆激酶活力最高，揮發(fā)性鹽基氮含量最低，感官評分也相對較高，所以菌粉比例選擇1.0∶1.5。

圖1 菌粉比例對感官評分（A）、揮發(fā)性鹽基氮含量（B）及納豆激酶活力（C）的影響Fig.1 Effect of bacteria powder ratio on sensory score(A)and volatile basic nitrogen content(B)and nattokinase activity(C)

2.2 發(fā)酵溫度對納豆品質(zhì)的影響

圖2 發(fā)酵溫度對感官評分（A）、揮發(fā)性鹽基氮含量（B）及納豆激酶活力（C）的影響Fig.2 Effects of fermentation temperature on sensory score(A),volatile basic nitrogen content(B)and nattokinase activity(C)

2.3 發(fā)酵時間對納豆品質(zhì)的影響

發(fā)酵時間對納豆品質(zhì)的影響見圖3。由圖3可知，隨著發(fā)酵時間的延長，納豆的感官評分和納豆激酶活力均呈先上升后下降的趨勢，而發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性鹽基氮含量越來越多，氨味也越來越重。當(dāng)發(fā)酵時間為24 h時，感官評分及納豆激酶活力均達(dá)到最大，分別為7.8分、379.404 U/g，揮發(fā)性鹽基氮含量相對較低，為24.036 mg/100 g。各指標(biāo)的組間差異均顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵時間過短時，納豆芽孢桿菌和乳酸菌可能剛進(jìn)入穩(wěn)定期，發(fā)酵還未到達(dá)最高點(diǎn)；發(fā)酵時間過長時，外界環(huán)境如pH、氧化還原電勢等越來越不適宜，營養(yǎng)物質(zhì)減少，菌體進(jìn)入衰亡期，菌體內(nèi)部酶促反應(yīng)速率降低。綜合上述結(jié)果，當(dāng)發(fā)酵時間為24 h時，感官評分和納豆激酶活力都最高，揮發(fā)性鹽基氮含量也相對較低。所以發(fā)酵時間選擇24 h。

圖3 發(fā)酵時間對感官評分（A）、揮發(fā)性鹽基氮含量（B）及納豆激酶活力（C）的影響Fig.3 Effects of fermentation time on sensory score(A),volatile basic nitrogen content(B)and nattokinase activity(C)

2.4 納豆發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

選用正交試驗(yàn)表L9（34）研究菌粉比例（A）、發(fā)酵溫度（B）和發(fā)酵時間（C）對納豆品質(zhì)的影響。正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表3，方差分析見表4～6。

表3 納豆發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for natto fermentation process optimization

由表3極差分析可知，考察因素對3個評價指標(biāo)的影響主次順序均為A＞C＞B，即菌粉比例＞發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度。以感官評分為評價指標(biāo)時，最優(yōu)組合條件為A2B3C2，即菌粉比例1.0∶1.5、發(fā)酵溫度44℃、發(fā)酵時間24 h；以揮發(fā)性鹽基氮含量為評價指標(biāo)時，最優(yōu)組合條件為A1B2C3，即菌粉比例1.0∶1.0、發(fā)酵溫度42℃、發(fā)酵時間27 h；以納豆激酶活力為評價指標(biāo)時，最優(yōu)組合條件為A2B3C3，即菌粉比例1.0∶1.5、發(fā)酵溫度44℃、發(fā)酵時間27 h。

由表4方差分析可知，菌粉比例和發(fā)酵時間對感官評分影響均顯著（P＜0.05），發(fā)酵溫度對納豆感官評分影響不顯著（P＞0.05）；由于C2與C3無差異（P＞0.05）。因此，以納豆感官評分為評價指標(biāo)，最優(yōu)組合條件可調(diào)整為A2ByCz（y=1，2，3；z=2，3）。

表4 以感官評分為評價指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis using sensory score as evaluation index

表5 以揮發(fā)性鹽基氮含量為評價指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis using volatile basic nitrogen content as evaluation index

由表5方差分析可知，菌粉比例和發(fā)酵時間對揮發(fā)性鹽基氮含量的影響均顯著（P＜0.05），發(fā)酵溫度影響不顯著（P＞0.05）；由于A1與A2無差異，C1與C3無差異（P＞0.05）。因此，以納豆揮發(fā)性鹽基氮含量為評價指標(biāo)時，最優(yōu)組合條件可調(diào)為整AxByCz（x=1，2；y=1，2，3；z=1，3）。

表6 以納豆激酶活力為評價指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 6 Variance analysis using nattokinase activity as evaluation index

由表6方差分析可知，菌粉比例、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對納豆激酶活力影響均不顯著（P＞0.05）。因此，以納豆激酶活力為評價指標(biāo)時，最優(yōu)組合條件可調(diào)整為AxByCz（x=1，2，3；y=1，2，3；z=1，2，3）。

綜合考慮納豆感官評分、揮發(fā)性鹽基氮含量、納豆激酶活力以及生產(chǎn)成本，本研究確定較適宜的混菌發(fā)酵納豆組合條件為A2B1C3，即菌粉比例1.0∶1.5，發(fā)酵溫度40℃，發(fā)酵時間27 h。該組合沒有在正交試驗(yàn)的9個組合中出現(xiàn)，因此，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明，在此條件下發(fā)酵得到納豆，其感官評分9.0分，揮發(fā)性鹽基氮含量為11.022 mg/100 g，納豆激酶活力為438.90 U/g，此時，納豆色澤鮮亮，氨臭味明顯降低，拉絲狀態(tài)好。

2.5 對比試驗(yàn)結(jié)果

為檢測試驗(yàn)效果，從感官評分、揮發(fā)性鹽基氮含量及納豆激酶活力3個方面，將混菌發(fā)酵納豆與商品納豆進(jìn)行了對比，結(jié)果見表7。

表7 混菌發(fā)酵納豆與商品納豆的比較Table 7 Comparison between natto fermented with mixed startersand commercially available natto

由表7可知，混菌發(fā)酵納豆的感官評分比市售納豆高13.92%，揮發(fā)性鹽基氮含量低28.20%，納豆激酶活力高34.03%。結(jié)果表明，混菌發(fā)酵納豆品質(zhì)明顯優(yōu)于市售納豆。

3 結(jié)論

通過單因素及正交試驗(yàn)得出，混菌發(fā)酵納豆的最優(yōu)工藝為：菌粉比例（乳酸菌∶納豆芽孢桿菌）1.0∶1.5，發(fā)酵溫度40℃，發(fā)酵時間27 h。在此優(yōu)化條件下，納豆感官評分為9.0分，揮發(fā)性鹽基氮含量為11.022 mg/100 g，納豆激酶活力為438.90 U/g。此時，納豆色澤光亮，氨臭味明顯降低，拉絲狀態(tài)好，納豆品質(zhì)明顯優(yōu)于市售納豆。本試驗(yàn)在保證納豆仍有良好保健功能的基礎(chǔ)上改善了納豆的風(fēng)味，為納豆在我國的消費(fèi)起到了積極的推動作用。