真核起始因子4A1在胃癌中的表達(dá)及其在胃癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移中的作用

肖眾福，胡寬

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 1． 麻醉科 2． 普通外科，湖南 長沙 410008）

胃癌（gastric carcinoma）是胃黏膜上皮的惡性腫瘤，是世界上最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年約有100多萬人被診斷為胃癌，2018年全球因胃癌死亡78.3萬人。我國屬于胃癌高發(fā)地區(qū)，在因癌癥死亡患者人數(shù)中位于第2位[1-2]。尋找新型的抗腫瘤藥物，有望讓更多的胃癌患者獲益。失控的翻譯進(jìn)程會(huì)引起多種不良后果，包括引發(fā)癌癥、維持癌癥表型、支持血管生成和調(diào)節(jié)藥物反應(yīng)[3-4]，控制癌細(xì)胞內(nèi)失控的翻譯可能是開發(fā)新型抗腫瘤藥物的關(guān)鍵點(diǎn)[5]。真核生物細(xì)胞內(nèi)真核起始因子（eukaryotic initiation factor，eIF）包括eIF2和eIF4F，其中，eIF4F傾向于調(diào)節(jié)帽子依賴的mRNA的翻譯，因此，eIF4F活性的變化只會(huì)影響一部分mRNA翻譯，造成翻譯不成比例的選擇性改變。事實(shí)證明，多種致癌基因的翻譯依賴eIF4F，因此阻斷eIF4F活性可作為開發(fā)新型抗腫瘤藥物的一個(gè)潛在靶點(diǎn)[3-4,6]。

hippuristanol是一種天然提取物，能阻礙eIF4F內(nèi)的eIF4A1與RNA的結(jié)合，進(jìn)而抑制eIF4A1的解旋酶活性，阻礙其參與翻譯起始過程[7-8]。 研究[9-10]證實(shí)，hippuristanol可抵抗淋巴細(xì)胞性白血病，原發(fā)性滲出性淋巴瘤，成人T細(xì)胞白血病。本文將在胃癌細(xì)胞株AGS、MGC-803上，以eIF4A抑制劑hippuristanol為研究對象，探討抑制eIF4A1對胃癌細(xì)胞株的增殖、侵襲及遷移的影響，為胃癌化療藥物的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本

收集并篩選胃癌組織和相應(yīng)的正常組織（距離癌組織≥5 cm）116對，標(biāo)本來自2014年6月—2016年12月在中南大學(xué)湘雅醫(yī)院接受手術(shù)治療并經(jīng)術(shù)后病理診斷確診的胃癌患者，其中男87例，女29例；年齡31～76歲，中位年齡58歲。所有患者術(shù)前未接受放化療等輔助治療。經(jīng)10%中性福爾馬林固定，脫水，包埋，切片。本研究獲得中南大學(xué)湘雅醫(yī)院倫理委員會(huì)審批批準(zhǔn)并且獲得患者知情同意。

1.2 細(xì)胞及主要試劑

胃癌細(xì)胞株AGS、MGC-803，RPMI-1640，F(xiàn)BS，雙抗（盤尼西林+鏈霉素），hippuristanol（日本琉球大學(xué)Junichi Tanaka教授饋贈(zèng)），DMSO（Sigma），eIF4A1抗體（兔源，CST），HRP標(biāo)記羊抗兔二抗，MTT，RT-PCR試劑盒（TaKaRa）等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組化將胃癌及相應(yīng)的正常對照的石蠟切片脫蠟和水化；將切片放入裝有沸騰的抗原修復(fù)液的燒杯中，保鮮膜封閉燒杯口，將燒杯沸水浴15 min 后取出自然冷卻至室溫，完成抗原修復(fù)，PBS清洗3遍后，用3%過氧化氫浸泡10 min；5%馬血清室溫封閉30 min。吸棄封閉液，加入一抗，于4 ℃孵育過夜；吸棄一抗，PBS清洗3次后，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育30 min；PBS清洗3遍后加入ABC混合液，室溫孵育30 min；PBS清洗3遍后進(jìn)行DAB顯色，顯微鏡下觀察，適當(dāng)情況下終止與底物反應(yīng)，蘇木青復(fù)染，透明，封片。免疫組化評分方法：是染色強(qiáng)度與染色區(qū)域的乘積，在本文中，胞漿中顯示棕色信號的現(xiàn)象定義為eIF4A1陽性反應(yīng)。染色強(qiáng)度的分?jǐn)?shù)定義：陰性為0分，弱陽性為1分，中等陽性為2分，強(qiáng)陽性為3分；染色區(qū)域的分?jǐn)?shù)定義：＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。評分結(jié)果為0～7分認(rèn)為是低表達(dá)，8～12分認(rèn)為是高表達(dá)。

1.3.2 胃癌組織RNA提取將臨床收集的胃癌及相應(yīng)的正常對照組織速凍于液氮中，用研缽進(jìn)行研磨，研磨至粉末狀，加入1 mL TRIzol裂解充分，室溫放置5 min，加入200 μL氯仿，劇烈渦旋 10 s，冰上放置10 min，4℃，12 000 r/min，離心10 min，小心吸取上清至新的無RNA酶的EP管中，加入等體積的異丙醇，-20 ℃沉淀1 h，4 ℃， 12 000 r/min，離心10 min，小心棄上清，加入75%乙醇，4 ℃，7 600 r/min，離心5 min，小心棄上清，瞬時(shí)離心10 s，吸棄痕液，室溫風(fēng)干5～10 min，加入適量的DEPC水溶解RNA。

1.3.3 RT-PCR提取好的RNA進(jìn)行濃度測定，各取1 μg RNA參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（ThermoFisher Scientific，貨號18080200）說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將cDNA進(jìn)行一定的稀釋，作為RT-PCR的模板，參照熒光定量PCR試劑盒（SYBR染料法）（ThermoFisher Scientific，貨號11746100）說明書進(jìn)行RT-PCR。mRNA相對表達(dá)水平的定量采用比較Ct法來計(jì)算相對定量，內(nèi)參選擇GAPDH，胃癌組織及相應(yīng)的正常對照組織中eIF4A1 mRNA的相對表達(dá)水平為eIF4A1與GAPDH的2-△△Ct比值。

1.3.4 Western blot將臨床收集的胃癌及相應(yīng)的正常對照組織速凍于液氮中，用研缽進(jìn)行研磨，研磨至粉末狀，加入適量的Western-blot裂解液，冰上裂解30 min，加入上樣緩沖液，沸水浴10 min，冰上放置10 min，上樣進(jìn)行SDS-PAGE分離。低壓濕轉(zhuǎn)（12 V，13 h），加入10%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗，室溫孵育4 h，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h，加入顯色液進(jìn)行顯影、定影。

1.3.5 MTT檢測胃癌細(xì)胞株活性分別用胰酶消化對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞株AGS、MGC-803，細(xì)胞計(jì)數(shù)，制備濃度為2×103個(gè)/100 μL的細(xì)胞懸液，按每孔100 μL的量接種96孔板，于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。小心吸棄培養(yǎng)上清，換成新鮮的含不同濃度hippuristanol（0.125、0.25、0.5、1、2 μmol/L）或DMSO（添加體積與 2 μmol/L hippuristanol對應(yīng)的添加量相同）的培養(yǎng)基，于處理后不同時(shí)間點(diǎn)（12、24 h），MTT分析hippuristanol對胃癌細(xì)胞株的增殖情況。

1.3.6 Transwell實(shí)驗(yàn)分別用胰酶消化對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞株AGS、MGC-803，細(xì)胞計(jì)數(shù)，稀釋成濃度為2.5×104個(gè)/100 μL的細(xì)胞懸液，取200 μL細(xì)胞懸液接種于Transwell上室（12 μm），每種細(xì)胞系設(shè)置2組（DMSO組和hippuristanol組），DMSO組的Transwell下室添加500 μL含DMSO的培養(yǎng)基，hippuristanol組的Transwell下室添加500 μL含0.125 μMhippuristanol的培養(yǎng)基，于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12 h，吸棄培養(yǎng)上清，細(xì)胞用0.1%的結(jié)晶紫染色，對Transwell下室的細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.7 劃痕實(shí)驗(yàn)用marker筆在6孔板背面均勻劃5條橫線，間隔1 cm，分別將胃癌細(xì)胞株AGS、MGC-803按1×105個(gè)/孔接種在背面已劃線的6孔板中，于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞長成單層后，用滅菌的槍頭垂直于背面的橫線劃痕，PBS洗去劃落的細(xì)胞，換成含DMSO或者h(yuǎn)ippuristanol（0.125 μmol/L）的無血清培基，于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，于0、12 h拍照并測量劃痕寬度，計(jì)算遷移率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用雙樣本等方差t檢驗(yàn)進(jìn)行處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 eIF4A1在胃癌及正常組織中的表達(dá)

收集116例病理確診的胃癌標(biāo)本，免疫組化結(jié)果顯示，大部分患者（98例）癌組織中eIF4A1的表達(dá)水平明顯高于相應(yīng)的癌旁正常組織eIF4A1的表達(dá)，癌組織的eIF4A1免疫組化積分明顯高于癌旁正常組織[（8.34±3.21）vs.（0.65±1.65），P=0.00]（圖1A）。隨機(jī)選擇其中4對的標(biāo)本，通過Western blot及RT-PCR技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證eIF4A1在胃癌組織中高表達(dá)，結(jié)果與免疫組化結(jié)果相一致（圖1B-C）。

圖1 eIF4A1在胃癌及癌旁正常組織中的表達(dá)Figure 1 Expressions of eIF4A1 in gastric cancer and adjacent normal tissues analysis; C:RT-PCR results

2.2 hippuristanol對胃癌細(xì)胞及正常胃黏膜細(xì)胞增殖的影響

不同濃度hippuristanol處理胃癌細(xì)胞株AGS、MGC-803，不同時(shí)間點(diǎn)MTT法分析細(xì)胞的存活率，結(jié)果顯示hippuristanol抑制胃癌細(xì)胞株的增殖呈濃度依賴及時(shí)間依賴關(guān)系；此外，為了研究hippuristanol對正常細(xì)胞的影響，本研究用不同濃度hippuristanol處理人胃黏膜上皮細(xì)胞（GES-1）24 h，結(jié)果顯示，hippuristanol的濃度低于0.5 μmol/L時(shí)，對GES-1細(xì)胞的抑制效果不明顯（圖2）。綜合以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.125 μmol/L的hippuristanol處理3種細(xì)胞（AGS、MGC-803及GES-1） 24 h，細(xì)胞存活率均高于50%，故后續(xù)的研究中hippuristanol的處理濃度為0.125 μM，處理時(shí)間 為24 h。

圖2 hippuristanol對胃癌細(xì)胞及正常胃黏膜細(xì)胞增殖的影響Figure 2 Influences of hippuristanol on proliferative abilities in gastric cells and normal gastric mucosa cells

2.3 hippuristanol對胃癌細(xì)株侵襲的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.125 μmol/L的hippuristanol處理24 h，胃癌細(xì)胞株AGS、MGC-803的侵襲能力明顯減弱（均P＜0.05）（圖3）。

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞襲能力Figure 3 Invasion ability of the cells determined by Transwell assay

2.4 hippuristanol對胃癌細(xì)胞株遷移能力的影響

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力Figure 4 Migration ability of the cells determined by scratch assay

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.125 μmol/L的hippuristanol處理24 h，胃癌細(xì)胞株AGS、MGC-803的遷移能力被明顯抑制（均P＜0.05）（圖4）。

3 討 論

目前早期胃癌可以通過內(nèi)鏡或者手術(shù)切除，但對于局限性進(jìn)展期胃癌來說，通過手術(shù)治療輔以化療的綜合治療方案仍是臨床的一線治療方案，術(shù)后化療的成敗是直接影響患者的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及生存預(yù)后的關(guān)鍵因素，成為制約胃癌治療療效的瓶頸。胃癌常用的化療藥是5-氟尿嘧啶，奧沙利鉑，絲裂霉素，阿霉素等，易出現(xiàn)耐藥。因此，發(fā)現(xiàn)新的抗腫瘤靶點(diǎn)，有助于開發(fā)新型抗腫瘤藥物，提高胃癌的化療效果。

失控的翻譯進(jìn)程會(huì)引起多種不良后果，包括引發(fā)癌癥、維持癌癥表型、支持血管生成和調(diào)節(jié)藥物反應(yīng)[3-4]，如真核生物翻譯起始因子eIF4F的功能異常與癌癥的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)，因此，控制癌細(xì)胞內(nèi)失控的翻譯可能是開發(fā)新型抗腫瘤藥物的關(guān)鍵點(diǎn)。eIF4F是由eIF4A、eIF4E、eIF4G共同形成的復(fù)合體，負(fù)責(zé)招募核糖體到mRNA，形成預(yù)起始復(fù)合體，其中，eIF4A作為一種RNA解旋酶，重塑鄰近mRNA帽子附近的二級結(jié)構(gòu)[11-13]，促進(jìn)帽子依賴的mRNA的翻譯。哺乳動(dòng)物體內(nèi)eIF4A有2種蛋白，分別為eIF4A1和eIF4A2[14]，兩者的序列相似度接近90%，但是功能卻各異，eIF4A1的生物學(xué)功能更強(qiáng)，所以，通常說eIF4A的活性是指eIF4A1的活性[15-16]。多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，eIF4A1與癌癥的惡性表型相關(guān)：在ER-的乳腺癌中eIF4A1的過表達(dá)，引起翻譯圖譜發(fā)生改變，與乳腺癌的惡性表型相關(guān)，且預(yù)后不良[17]；成人T細(xì)胞白血病中，eIF4A在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平顯著高于正常的外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)[17]。抑制eIF4A1的活性，顯著下調(diào)一些致癌基因的表達(dá)，包括MYC、cyclin D1、Bcl-x及MUC1[17-19]。

近年來，多種靶向eIF4A的小分子抑制劑被鑒定，包括silvestrol[20]、rocaglates[21]、hippuristanol[22]等。hippuristanol是一種天然提取物，能夠選擇性靶向eIF4A1[22]，使eIF4A1處于緊密型的構(gòu)象，不利于其與mRNA的結(jié)合，抑制eIF4A1的解旋酶活性，進(jìn)而阻礙eIF4A1進(jìn)入翻譯起始過程[7]。hippuristanol作為單一的藥劑已顯示出抗腫瘤的前景，hippuristanol能夠抵抗成人T細(xì)胞白血病[23]；此外，在原發(fā)性滲出性淋巴瘤模型上，hippuristanol通過誘導(dǎo)翻譯休止，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。

國內(nèi)學(xué)者韋尉元及謝東毅等[24-25]通過體外研究發(fā)現(xiàn)，eIF4A抑制劑silvestrol不影響胃癌細(xì)胞株SGC-7901的增殖但抑制其侵襲和遷移能力，沉默eIF4A，會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移[25]。本文的研究結(jié)果顯示，hippuristanol抑制胃癌細(xì)胞株的增殖呈時(shí)間依賴和濃度依賴，且會(huì)抑制胃癌細(xì)胞株的侵襲及遷移。這2種eIF4A抑制劑對胃癌細(xì)胞的增殖表現(xiàn)出不同的結(jié)果，可能歸因于這2種抑制劑的來源不同，hippuristanol是一種來自海洋生物的提取物，silvestrol是一種來自植物的提取物。hippuristanol盡管對胃癌細(xì)胞有一定的抑制作用，但其對人胃黏膜上皮細(xì)胞的增殖的抑制作用不顯著，這也證實(shí)了eIF4A被抑制，只會(huì)影響一部分mRNA翻譯，造成翻譯不成比例的選擇性改變。

本研究發(fā)現(xiàn)，與正常胃黏膜相比，胃癌組織中eIF4A1的表達(dá)顯著上調(diào)，預(yù)示eIF4A1可能有助于胃癌的進(jìn)展。hippuristanol在血液性腫瘤中表現(xiàn)出較好的抗腫瘤效果，本研究選擇胃癌作為研究對象，探討hippuristanol對實(shí)體瘤的效果，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，hippuristanol顯著抑制胃癌細(xì)胞株的增殖，且呈時(shí)間依賴和濃度依賴關(guān)系，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)hippuristanol抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移，下一步筆者將在胃癌異種移植瘤模型（patientderived tumor xenograft，PDX）上進(jìn)一步驗(yàn)證hippuristanol對胃癌的抑制作用，同時(shí)，將探討聯(lián)合使用hippuristanol與奧沙利鉑等抗腫瘤藥物對腫瘤的協(xié)同致死作用。期以為胃癌藥物的開發(fā)及化療增敏提供理論基礎(chǔ)。