固定化酵母菌實驗條件的探究和改進(jìn)*

殷亞妮 許東升 吉祖筠 曹安康

（南京師范大學(xué)附屬中學(xué) 江蘇南京 210003）

酵母菌固定化是學(xué)生親自體驗和實踐固定化技術(shù)的一項實驗，充滿趣味，特別是實驗成功后得到的充滿彈性的凝膠珠，更是深受學(xué)生喜愛。但學(xué)生在實驗中也遇到很多難題，例如海藻酸鈉加熱時易焦糊，凝膠珠易拖尾或形狀大小不一，發(fā)酵過程中凝膠珠易破裂等，針對這些問題進(jìn)行了實驗探究和改進(jìn)。

1 比較實驗效果，確定最適條件

1.1 海藻酸鈉濃度對凝膠珠形成和酵母菌固定化的影響 人教版教材中要求“稱取0.7 g 海藻酸鈉……加入10 mL 水……直至完全溶化，用蒸餾水定容至10 mL”，即海藻酸鈉溶液濃度為7%。為了解海藻酸鈉濃度對酵母菌固定化效果的影響，配制了3 組濃度為4%、7%和10%的海藻酸鈉溶液，分別與等體積的酵母菌液混合均勻，并用注射器將混合液滴加到0.05 mol／L 的CaCl2溶液中固定30 min，制成凝膠珠。

1.1.1 海藻酸鈉濃度對于凝膠珠形狀的影響首先，比較凝膠珠成形效果（表1），發(fā)現(xiàn)海藻酸鈉濃度越低，凝膠珠越易形成規(guī)則球形，濃度過高時，拖尾嚴(yán)重，呈蝌蚪狀。推測濃度低時，溶液黏著性低，易從注射器口處滴落，且在溶液表面張力作用下，能在下落過程中快速形成球形；而隨著濃度升高，溶液黏著性增加，無法快速從注射器口滴落，易拖尾，凝膠珠成形效果較差。

表1 海藻酸鈉濃度對凝膠珠成形的影響

稱取上述3 種凝膠珠各4 g，分別置于50 mL 10%的葡萄糖溶液中進(jìn)行酒精發(fā)酵。連續(xù)10 d，在每天同一時間觀察凝膠珠的狀態(tài)并測量發(fā)酵液中的酵母菌數(shù)量。實驗發(fā)現(xiàn)，濃度為4%和7%的海藻酸鈉溶液形成的凝膠珠形態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在整個實驗期間都未發(fā)生破裂，但10%的海藻酸鈉溶液形成的凝膠珠在發(fā)酵1 d 后有部分破裂，且頭部直徑越大的凝膠珠越容易破裂（圖1）。

圖1 不同濃度海藻酸鈉固定得到的凝膠珠

1.1.2 海藻酸鈉濃度對酵母菌固定化的影響 對比發(fā)酵液中游離的酵母菌數(shù)量（表2），發(fā)酵前期，10%海藻酸鈉組高于其他2 組，且隨培養(yǎng)時間的增加，數(shù)量不斷增加；但在發(fā)酵后期（發(fā)酵7～10 d 該組的數(shù)值無明顯變化，推測可能與該組凝膠珠在前期逐漸發(fā)生破裂有關(guān)。4%海藻酸鈉組和7%海藻酸鈉組在發(fā)酵前期數(shù)值都較低；但隨培養(yǎng)時間的延長，4%海藻酸鈉組的游離酵母菌數(shù)呈顯著上升趨勢，與前期相比，增幅為20～30 倍；而7%海藻酸鈉組的數(shù)目僅增加2～3 倍?？紤]到酵母菌在無氧條件下進(jìn)行酒精發(fā)酵產(chǎn)能較少，不利于其增殖，可以推測4%海藻酸鈉組的游離酵母菌多來自于凝膠珠，說明海藻酸鈉濃度過低時，形成的凝膠珠孔徑較大，酵母菌容易泄漏，固定效果并不理想。

表2 發(fā)酵液中游離酵母菌數(shù)（個／mL）

綜上所述，從凝膠珠成形和酵母菌固定效果等方面綜合考慮，在4%、7%、10%的3 個濃度中，7%的海藻酸鈉更適合用于固定酵母菌。

1.2 固定化時間對酵母菌固定化的影響 CaCl2溶液使凝膠珠成形的原理是，CaCl2溶液中的Ca2+與海藻酸鈉發(fā)生反應(yīng)，迅速在表面形成了交聯(lián)的海藻酸鈣聚合物［1］，充分浸泡后，Ca2+與海藻酸中的多個氧原子發(fā)生螯合作用，使海藻酸鏈間結(jié)合得更加緊密（圖2）［2］，并最終導(dǎo)致凝膠珠的形成。品質(zhì)良好的凝膠珠應(yīng)該具有一定的彈性，且能在發(fā)酵過程中很好地維持自身形態(tài)結(jié)構(gòu)。

圖2 海藻酸鈉和海藻酸鈣的結(jié)構(gòu)差異［2］

1.2.1 固定化時間對凝膠珠形態(tài)的影響 教材建議用0.05 mol／L 的CaCl2固定30 min，若改變固定化的時間，會產(chǎn)生怎樣的影響？設(shè)置5 組不同的固定化時間，分別為10 min、20 min、30 min、40 min和50 min，用游標(biāo)卡尺測量各組凝膠珠的直徑（表3），發(fā)現(xiàn)凝膠珠的直徑隨固定化時間的增加而變小，推測是因為固定化時間越長，Ca2+與海藻酸鈉反應(yīng)越充分，形成了更多不易溶于水的海藻酸鈣彼此交聯(lián)在一起，使得凝膠珠結(jié)構(gòu)更緊湊。

表3 固定化時間與凝膠珠直徑的關(guān)系

1.2.2 固定化時間對酵母菌固定效果的影響為了解固定化時間對酵母菌固定效果的影響，稱取上述5 組凝膠珠各4 g，分別在50 mL 10%的葡萄糖溶液中發(fā)酵，連續(xù)10 d，每天同一時間觀察凝膠珠狀態(tài)。發(fā)現(xiàn)固定10 min 的凝膠珠從發(fā)酵第1 天起有40%的凝膠珠破裂（圖3）；發(fā)酵3 d后有少量凝膠珠沉于發(fā)酵液底部，并隨發(fā)酵時間的延長，破裂及下沉凝膠珠比例不斷增加；發(fā)酵7 d 后，所有凝膠珠都沉底，另外4 組的凝膠珠則無破裂和沉底現(xiàn)象。可見，固定化時間過短（10 min），凝膠珠結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易在發(fā)酵中破裂，并在一定程度上增加酵母菌的泄漏。

圖3 固定10 min 的凝膠珠發(fā)酵中大量破裂

同時，每天同一時間測量發(fā)酵液中的酵母菌數(shù)量，發(fā)現(xiàn)固定化時間越長的凝膠珠，其發(fā)酵液中酵母菌數(shù)量越少，但幾組的酵母菌數(shù)量差異并不大，最多相差2～3 倍。

結(jié)合海藻酸鈉濃度的實驗，可得出結(jié)論：海藻酸鈉濃度是影響包埋孔徑，防止酵母菌泄漏流失的主要因素；合適的固定化時間則是凝膠珠結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的保證；固定化時間在20～50 min 時，無顯著差異，考慮時間成本，建議大家在使用0.05 mol／L 的CaCl2溶液固定凝膠珠時，時間以20～30 min 為宜。

2 改進(jìn)實驗操作 提高實驗效率

2.1 改變海藻酸鈉的加熱方式 常溫下，海藻酸鈉不易溶解，需要加熱，人教版教材中建議用“酒精燈進(jìn)行加熱，邊加熱邊攪拌......且加熱時要用小火，或者間斷加熱，反復(fù)幾次，直到溶化為止”。但實際操作中，酒精燈火焰大小無法控制，只能采用間隔加熱的方式，時不時用試管夾將小燒杯從火焰正上方平行移走，學(xué)生無法靈活掌握加熱時間，很容易出現(xiàn)海藻酸鈉焦糊并黏著在燒杯底部的情況。因此，改用恒溫水浴鍋進(jìn)行加熱，當(dāng)水溫為60℃時，20 mL 規(guī)定濃度的海藻酸鈉徹底溶化只需3～5 min，且不會焦糊。與酒精燈加熱相比，水浴加熱易于控制熱量大小，海藻酸鈉溶液的水分揮發(fā)也相對較少，能保持其濃度［3-4］。

2.2 有效縮短固定化時間 能否在保證固定效果的前提下適當(dāng)縮短固定化時間？考慮到凝膠珠結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與海藻酸鈣的形成有關(guān)，嘗試通過增加CaCl2溶液的濃度縮短固定化時間，設(shè)置了3組實驗，分別為0.05 mol／L CaCl2固定化30 min，0.1 mol／L CaCl2固定化15 min，及0.2 mol／L CaCl2固定化7.5 min。得到凝膠珠后分別加入葡萄糖溶液進(jìn)行發(fā)酵，在10 d 的發(fā)酵過程中，3 組凝膠珠都未出現(xiàn)破裂和下沉現(xiàn)象，甚至在實驗結(jié)束1 個月后，3 組凝膠珠的形態(tài)依然保持完好，無明顯差別，故可通過提高CaCl2濃度縮短固定化時間節(jié)約課時。

2.3 設(shè)計并制作固定化酵母菌簡易裝置 制作凝膠珠時，教材要求“以恒定的速度緩慢地將注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中”，此外，實驗中發(fā)現(xiàn)注射器的高度和角度也會影響凝膠珠的形狀。學(xué)生初次操作，很難保證滴定速度的“恒定”和“緩慢”，導(dǎo)致凝膠珠大小不一，內(nèi)部氣泡過多等。針對這些問題，利用常用的學(xué)習(xí)工具和實驗工具制作簡易的酵母菌固定化裝置（圖4）。該裝置搭建和操作方式如下：

圖4 酵母菌固定化簡易裝置

1）用注射器吸取已經(jīng)混合好的海藻酸鈉與酵母菌溶液，吸取時要避免注射管中產(chǎn)生氣泡，然后將注射器滴注口的混合溶液擦拭干凈備用。

2）用試管夾夾持注射器，并將其垂直固定在距離CaCl2溶液一定高度的位置，觀察注射器的活塞軸在重力下移動情況。

3）將小件重物（例如小砝碼、橡皮塊等）壓在注射器的活塞柄上，觀察活塞軸移動情況，可通過調(diào)換重物，改變壓力大小，使活塞軸緩慢、勻速向下移動，將混合溶液排出注射器，即可以制備出形態(tài)大小均一的凝膠珠。

3 結(jié)論與展望

3.1 實驗結(jié)論 海藻酸鈉用酒精燈火加熱溶解時，火勢大小難以控制，易發(fā)生焦糊，可用恒溫水浴鍋（設(shè)定水溫為60℃）進(jìn)行加熱。

隨著海藻酸鈉濃度的增加，凝膠珠孔徑逐漸減小，酵母菌越難泄漏，固定效果越好；但同時混合液粘稠度增加，拖尾嚴(yán)重，凝膠珠成形效果較差。綜合而言，濃度為7%的海藻酸鈉溶液比4%和10%的更適合固定酵母菌。

凝膠珠在CaCl2溶液中的固定化時間越長，凝膠珠形態(tài)結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，越不易破裂。一般而言，在0.05 mol／L 的CaCl2溶液中需固定20～30 min，但若增加CaCl2溶液的濃度，則固定化時間可等比減少，例如在2 mol／L 的CaCl2溶液中只需固定7.5 min。

3.2 展望 可以考慮研究相同條件下，固定化的酵母菌和游離的酵母菌在增殖和發(fā)酵方面的差別，例如酒精的產(chǎn)生效率是否相同等。