重慶市城口縣大巴山國家級自然保護區(qū)發(fā)現(xiàn)寧陜線形蛇與該物種的遺傳分化分析

陳澤檸，賀捷，吳軍，江建平，丁利*，王斌*

(1.中國科學院成都生物研究所，成都610041； 2. 西南石油大學，成都610500；3. 生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學研究所，南京210042)

原洪(1983)依據(jù)采自陜西省寧陜縣火地塘的雄性和雌性成體標本各1號以及幼體標本1號而訂立新種寧陜小頭蛇OligodonningshaanensisYuan，1983，將其歸隸于游蛇科Colubridae小頭蛇屬Oligodon。李磊和梁剛(2007)用掃描電鏡觀察了該物種1雄1雌2號地模標本身體不同部位的微皮紋結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其屬于鱗片基部為縱向溝槽的“canaliculate”型，這與棋斑游蛇Natrixtessellat類似(Price，1982)。楊林森等(2009)報道在湖北省神農(nóng)架國家級自然保護區(qū)海拔1 500～1 600 m處采集到該種。而肖文發(fā)(2009)報道該物種在緊鄰神農(nóng)架國家級自然保護區(qū)的重慶市五里坡國家級自然保護區(qū)有分布。Wang等(2014)通過形態(tài)比較、分子系統(tǒng)發(fā)育分析和捕食行為觀察等對該物種的系統(tǒng)地位做了探討，將該物種從小頭蛇屬中分出，訂立線形蛇屬Stichophanes，為單型屬單型種。由于該物種野外種群數(shù)量小且難以發(fā)現(xiàn)，從命名至今，公開發(fā)表資料中，野外采集記錄的標本僅7號(3號雄性、3號雌性和1號幼體)，《中國脊椎動物紅色名錄》將其列為近危種(NT；蔣志剛等，2016)，因此對該物種進行相關(guān)研究具有緊迫性和重要性。

2017年7月8日，在重慶市城口縣大巴山國家級自然保護區(qū)開展生物多樣性調(diào)查時，采集到1號疑似寧陜線形蛇的雌性成體標本。通過形態(tài)學比較和分子系統(tǒng)發(fā)育分析確定其分類地位，并進一步探討該個體與同種不同地理種群間的分化水平，為該類群的系統(tǒng)學和保護生物學研究提供新的信息。

1 材料與方法

1.1 標本采集

2017年7月8日16∶00，在重慶市城口縣大巴山國家級自然保護區(qū)高楠鄉(xiāng)方斗坪(108.590 3°E，32.104 9°N，海拔1 950 m)采集到1號疑似寧陜線形蛇標本。該個體為成體雌蛇，橫過馬路時遭車輛碾壓，所懷卵被軋出體外，發(fā)現(xiàn)并拍照時尚可輕微活動，約5 min后死亡。取其背部肌肉保存于95%乙醇溶液中用作DNA樣本，標本浸泡于75%乙醇溶液中，保存于中國科學院成都生物研究所(標本號：CIB2017070802)。

1.2 形態(tài)鑒定與比較

形態(tài)鑒定與比較依據(jù)原洪(1983)、趙爾宓(2006)和Wang等(2014)的記載。使用量尺(無錫錫工量具有限公司，精度0.01 mm)測量標本的頭體長和尾長，并與原洪(1983)記錄的3號標本和Wang等(2014)記錄的10號標本(1號野外采集雌蛇，9號實驗室孵化的幼蛇)進行比較。

1.3 總DNA提取、基因擴增與測序

使用動物組織DNA提取試劑盒(TIANGEN)提取基因組DNA。PCR擴增線粒體細胞色素b(cytb)基因和核基因oocytematurationfactor(cmos)片段，所用引物為L14910/H16064(cytb基因，參考Burbrinketal.，2000)和S77/S78(cmos基因，參考Lawsonetal.，2005)。PCR擴增條件和步驟參照Wang等(2014)。擴增產(chǎn)物純化后交由生工生物工程(上海)股份有限公司在ABI3730測序儀上雙向測序，測序引物同擴增引物。所得序列上傳到GenBank(登錄號：MH613781和MH613782)。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系重建和遺傳距離計算

下載GenBank中目前僅有的2號寧陜線形蛇標本(標本號：CIB100191和CIB100192；Wangetal.，2014)的相應基因片段(表1)。由于該物種具有相對獨立的系統(tǒng)發(fā)育位置，參考Wang等(2014)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，在每個近緣分支選取1個代表物種進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建：三角斑水蛇Hydropstriangularis、密河泥蛇Faranciaabacura、崇安斜鱗蛇Pseudoxenodonkarlschmidti、黑鏈劍蛇Sibynophissubpunctatus、孟加拉眼鏡蛇Najakaouthia；并以瘰鱗蛇Acrochordusgranulatus的相關(guān)基因片段作為外群(表1)。序列比對在MEGA 7.0(Kumaretal.，2016)中進行。采用貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育推理法(BI)和最大似然法(ML)基于線粒體cytb基因和核基因cmos片段聯(lián)合序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。構(gòu)建發(fā)育樹前，利用Partitionfinder 2.1.1(Lanfearetal.，2012)基于貝葉斯信息準則(BIC)選擇最適核苷酸替代模型，為cytb和cmos序列數(shù)據(jù)所選最佳模型分別為TrN+G和HKY+G。利用MrBayes 3.2(Ronquistetal.，2012)及PhyML 7.0.4(Stamatakis，2006)分別進行BI和ML分析，并進行1 000次自舉重抽樣，檢驗各節(jié)點置信度。在TCS 1.2中，利用最大簡約法構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖(Clementetal.，2000)探討城口大巴山標本單倍型與其他地區(qū)寧陜線形蛇單倍型之間的關(guān)系?；赾ytb基因數(shù)據(jù)，利用MEGA中的非校正成對距離模型計算寧陜線形蛇種群間及其與近緣種間的遺傳距離。

表1 本文樣品信息Table 1 Information of samples used in this study

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)鑒定與比較

比較城口大巴山標本CIB2017070802和文獻所列游蛇科屬種的形態(tài)鑒別特征，發(fā)現(xiàn)該標本與寧陜線形蛇形態(tài)相近，因此，從形態(tài)上(圖1)鑒定為寧陜線形蛇。

2.1.1 鱗被身體細長，圓柱形；頭部橢圓形，中部寬，基部收窄，頭頸部區(qū)分不明顯。鼻鱗長，約為眼徑的1.5倍，前端橢圓，后端尖。眼大，眼徑大于眼睛下緣到口緣的距離，瞳孔圓，活體時為黑色?？羟镑[1，眶后鱗2，眶上鱗1，顳鱗1+2。上唇鱗5/5，第1枚長，后緣與眶前鱗接觸；第2、3枚入眶；第4枚最大，與眶后鱗、顳鱗相切，相切處有黑色斑紋。下唇鱗6/6，第1對左右相互接觸；第2、3、4對與頜鱗接觸；具頜溝，頜溝后緣有1枚鱗片(圖1)。

背鱗光滑，不起棱，通體13行；腹鱗165枚；肛鱗2分；尾下鱗61對，交錯排列，最后1對融合成1枚。

2.1.2 色斑體背整體黃棕色，在左右兩側(cè)第2、3行背鱗間具1條黑色縱紋，從頸部起一直延伸至尾端(圖1：a)；腹鱗黃色，從第4枚腹鱗開始，每枚腹鱗前端均有1黑色斑紋，一直延伸到肛鱗，形成1行斷續(xù)的黑色縱線(圖1：b)；尾下鱗灰色，與腹鱗顏色區(qū)分明顯，除左第5、6、7、9枚和右第2～6枚具黑色斑紋，其余無黑色斑紋，僅在每枚鱗片后緣散有隱約可見的淡黑色大理石紋，尾尖有1白點；頂鱗、額鱗以及眶上鱗有黑色斑紋(圖1：c)；頸部脊鱗具1道黑色縱紋，從頂鱗開始一直向后延伸約16枚脊鱗，顏色由深變淺。

城口大巴山標本與寧陜線形蛇其他種群標本在個別形態(tài)特征上也存在差異(表2)。城口大巴山雌蛇標本全長638 mm，略短于寧陜火地塘雌蛇(標本號810200，655 mm)；上唇鱗數(shù)量為5/5，左右側(cè)均是第2、3枚入眶，寧陜火地塘和湖北神農(nóng)架種群標本的上唇鱗數(shù)量為6/6，左右側(cè)均是第3、4枚入眶；第1 枚上唇鱗的位置對應其他種群標本的第1枚和第2枚上唇鱗的位置；尾下鱗數(shù)量為61對，而其他種群標本的尾下鱗數(shù)量大于64對。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、遺傳距離和地理距離

BI樹和ML樹顯示，城口大巴山標本(H1)與寧陜火地塘的寧陜線形蛇地模標本(H2)和湖北神農(nóng)架標本(H3)聚為一單系(支持率為100%)，其中，寧陜火地塘標本首先與湖北神農(nóng)架的標本聚為一支(posterior probability=70%；bootstrap parsimony=64%)，而后與城口大巴山標本聚在一起(圖2：a)。在cmos基因上，城口大巴山標本與寧陜線形蛇其他地區(qū)標本共享1個單倍型，而在cytb基因上，它們各自有1個單倍型。因此，只構(gòu)建了基于cytb基因的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖(圖2：b)。結(jié)果表明，城口大巴山單倍型與湖北神農(nóng)架標本單倍型之間有1個突變、與模式產(chǎn)地寧陜火地塘之間有9個突變。基于cytb基因片段估算的遺傳距離表明，城口大巴山標本與湖北神農(nóng)架標本間的遺傳距離最近(0.001)，與模式產(chǎn)地寧陜火地塘標本的遺傳距離為0.009，而湖北神農(nóng)架標本和模式產(chǎn)地寧陜火地塘標本的遺傳距離為0.008，遠小于本種與其他近緣物種之間的遺傳距離(0.174～0.292；表3)。

單倍型網(wǎng)絡(luò)圖和遺傳距離結(jié)果與地理距離相對應，地理距離較近的種群具有較小的遺傳距離和較少的突變(圖3)。

2.3 生境描述

在城口縣大巴山國家級自然保護區(qū)發(fā)現(xiàn)寧陜線形蛇的海拔為1 960 m，時間為16∶00，天氣晴，23 ℃，濕度65%，微風。該蛇穿越公路時被車輛碾壓致死。該路段處于盤山公路翻山埡口下方，為新修近3年的水泥路，路寬約4 m，路的左側(cè)為人工開辟的陡坡，坡下半部分的植被剛開始恢復，右側(cè)為灌叢和次生林，坡度很大(圖4)。在該區(qū)域附近還發(fā)現(xiàn)菜花原矛頭蝮Protobothropsjerdonii、大眼斜鱗蛇Pseudoxenodonmacrops和頸槽蛇Rhabdophisnuchalis。

3 討論

寧陜線形蛇為中國特有種(Wangetal.，2014)，此前報道該物種僅分布于陜西省寧陜縣火地塘自然保護區(qū)(原洪，1983；Wangetal.，2014)、湖北省神農(nóng)架國家級自然保護區(qū)(楊林森等，2009)和重慶市五形態(tài)比較和分子系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果表明，寧陜線形蛇種群間存在分化。形態(tài)上，城口大巴山種群的上唇鱗數(shù)量為5/5，寧陜火地塘和湖北神農(nóng)架種群為6/6，且城口大巴山種群尾下鱗數(shù)量為61對，少于其他2個種群(64～73對)。遺傳方面，3個種群在cytb基因上各自擁有1個單倍型，城口大巴山單倍型與湖北神農(nóng)架單倍型之間有1個突變、與寧陜火地塘單倍型之間有9個突變。雖然這3個種群的遺傳距離較小，但是共享單倍型的缺失顯示他們之間可能存在地理隔離。地理隔離往往被認為是同一物種不同地理種群產(chǎn)生遺傳分化的重要原因(Burbrink & Guiher，2015)。秦嶺和大巴山橫亙于陜西南部、四川北部以及重慶北部，是中國自然地理、氣候及動物分布的重要分界線，秦嶺-大巴山區(qū)的南北氣候、動植物分布均有明顯的差異(鄭作新等，1962；胡淑琴等，1966)。寧陜線形蛇的寧陜火地塘種群位于秦嶺，與位于大巴山的另外2個種群之間有顯著的漢江盆地隔離，這可能是造成該種群與其他2個種群間有明顯分化的重要原因。值得注意的是，盡管位于秦嶺的寧陜火地塘種群在地理距離和遺傳距離上與大巴山區(qū)域的2個種群較遠，但系統(tǒng)發(fā)育分析卻支持寧陜火地塘種群與湖北神農(nóng)架種群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較近。可見，它們之間的親緣關(guān)系及分化模式值得進一步研究。

a. 背面觀，b. 腹面觀，c. 頭部背面觀，d. 頭部腹面觀，e. 頭部右側(cè)面觀； SL1～SL5. 第1～5枚上唇鱗，IL1～IL6. 第1～6枚下唇鱗

a. dorsal view，b. ventral view，c. dorsal view of head，d. ventral view of head，e. right lateral view of head； SL1-SL5. supralabial 1-5，IL1-IL6. infralabial 1-6

表2 寧陜線形蛇不同種群的形態(tài)比較Table 2 Morphological comparison of Stichophanes ningshaanensis populations

注：*文獻記錄數(shù)據(jù)存疑，因模式標本已經(jīng)遺失

Note：*doubtful data in reference due to the loss of holotype

圖2 寧陜線形蛇的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 2 Phylogenetic relationship and haplotype network of Stichophanes ningshaanensis

a. 基于cytb基因和cmos基因序列構(gòu)建的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育推理樹和最大似然樹，支系上數(shù)字表示貝葉斯后驗概率/自舉檢驗值，低于50%的值用“—”替代，樣本1～9參考表1； b.cytb基因單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，H1～H3為標本CIB2017070802，CIB100191和CIB100192各自享有的單倍型，1個空心圓代表1個連接突變或1個缺失單倍型里坡國家級自然保護區(qū)(肖文發(fā)，2009)。本研究發(fā)現(xiàn)該物種也分布于重慶市城口縣大巴山國家級自然保護區(qū)。該分布點位于前期報道的3個分布點的中間，推測寧陜線形蛇在上述區(qū)域可能呈連續(xù)分布。

a. Bayesian phylogenetic inference tree and maximum-likelihood tree constructed based oncytbandcmosgene sequences，numbers on branches indicated Bayesian posterior probabilities or bootstrap values (the values lower than 50% were displayed as “—”)，samples 1-9 were corresponding to those in table 1； b. haplotype network constructed based oncytbgene sequences，haplotypes H1，H2 and H3 were occupied by specimens CIB2017070802，CIB100191 and CIB100192，respectively，one hollow circle denoted one linking mutation or one missing haplotype in haplotype network

表3 基于線粒體細胞色素b基因序列估算的寧陜線形蛇和近緣物種間的非校正遺傳距離Table 3 Uncorrected p-distances between Stichophanes ningshaanensis and the related speciesbased on cyt b gene sequences

圖3 寧陜線性蛇樣本產(chǎn)地分布Fig. 3 Sample localities of Stichophanes ningshaanensis

圖4 重慶城口縣大巴山國家級自然保護區(qū)的寧陜線形蛇生境(陳澤檸 攝)Fig. 4 The habitat of Stichophanes ningshaanensis in Dabashan National Nature Reserve，Chengkou county，Chongqing city (Photographed by CHEN Zening)