自擬中藥復(fù)方金芩藍(lán)口服液對(duì)靶動(dòng)物臨床試驗(yàn)效果的研究報(bào)告

任麗花，楊國(guó)輝，王德功，劉 冬，張沛，李卓偉，呂 讓

（河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司，河北省獸藥工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050041）

1 前言

雞傳染性喉氣管炎（Infectious laryngotracheitis，ILT）是雞的一種接觸性呼吸道傳染病，可引起死淘率增加、產(chǎn)蛋率大幅下降、畸形蛋白蛋增多，并易繼發(fā)感染多種細(xì)菌性、病毒性疾病，而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。嚴(yán)重感染時(shí)病雞張口伸脖呼吸、明顯喘氣、咳嗽、甩鼻、咳出血樣黏液，此后死亡率大幅升高。在養(yǎng)殖密集地區(qū)，非典型感染日漸增多，呈現(xiàn)慢性消瘦、低死亡率感染，主要表現(xiàn)為鼻竇炎、結(jié)膜炎和黏液性氣管炎。我國(guó)自50年代以來大部分地區(qū)有不斷發(fā)生的報(bào)道，多呈地方流行性，并且近年來發(fā)病的日齡有明顯提前的趨勢(shì)。最早發(fā)病可見20～40日齡，給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，是集約化養(yǎng)雞場(chǎng)的重要疫病之一[1]。

對(duì)于本病的治療，目前尚無化學(xué)特效藥，主要是用高免血清、高免卵黃抗體和中藥復(fù)方制劑進(jìn)行治療。《中國(guó)獸藥典》收載的喉炎凈散和臨床應(yīng)用的喉瘟散、雞喉凈等對(duì)治療ILT 有較好的療效。中獸藥是在中獸醫(yī)理論指導(dǎo)之下用于防治動(dòng)物疾病的藥物，因其天然性、多能性、低毒副作用、不易產(chǎn)生有害物質(zhì)殘留和不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，為動(dòng)物臨床所廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)所采用的金芩藍(lán)口服液是本單位聯(lián)合相關(guān)單位研發(fā)的純中藥制劑，由金銀花、黃芩、連翹、板藍(lán)根四味中藥組成，1mL 含原生藥1.25g，臨床擬用于治療雞傳染性喉氣管炎引起的發(fā)熱、咳嗽、咽喉腫痛。

2 試驗(yàn)方法

2.1 材料

2.1.1 試驗(yàn)藥品和試劑

受試獸藥：金芩藍(lán)口服液。[規(guī)格]100mL，1mL 相當(dāng)于原生藥1.25g；[主要成分]金銀花、黃芩、連翹、板藍(lán)根；[功能]清熱解毒，消腫利咽；[主治]雞傳染性喉氣管炎引起的發(fā)熱、咳嗽、咽喉腫痛。河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：170702。

對(duì)照獸藥：喉炎凈散。標(biāo)準(zhǔn)《中國(guó)獸藥典二部（2015年版）》；[規(guī)格]250g；[主要成分]板藍(lán)根、蟾酥、人工牛黃、膽膏、甘草等；[功能]清熱解毒、通利咽喉；[主治] 雞喉氣管炎；[用法與用量] 雞0.05～0.15g，拌料；廣東高山動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)2017061702。

病毒基因組DNA 提取試劑盒及PCR 試劑盒均購自天根科技生化有限公司。

2.1.2 種毒和試驗(yàn)動(dòng)物

ILTV 王崗株，購自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：AV195；SPF 種蛋，購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

試驗(yàn)雞為80日齡未接種過ILT 疫苗的海蘭灰蛋雞（♀），平均體重約1kg/ 只，購自保定市清苑區(qū)華豐養(yǎng)殖場(chǎng)。攻毒試驗(yàn)雞飼養(yǎng)于動(dòng)物房。室內(nèi)使用三層階梯式育成雞籠架，每籠10 只雞。自動(dòng)飲水系統(tǒng)，人工給料。飼養(yǎng)溫度為18～28℃，相對(duì)濕度為50～60%，使用產(chǎn)蛋后備雞飼料（山西晉龍集團(tuán)太原飼料有限公司）。試驗(yàn)前雞群喉拭子PCR 檢測(cè)ILTV 陰性。陰性對(duì)照組的健康試驗(yàn)雞飼養(yǎng)于動(dòng)物房?jī)?nèi)（與攻毒試驗(yàn)雞距離1500 米），養(yǎng)殖單元信息同攻毒試驗(yàn)雞。兩個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)所的工作人員無交叉流動(dòng)。

2.1.3 主要儀器設(shè)備微電腦全自動(dòng)孵化機(jī)（FT-XF4）：北京春明方通電子有限公司；PCR 儀（AB2700）：美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)中國(guó)公司；凝膠成像分析儀（WD-9413A）：北京六一儀器廠；KD2508 輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)：浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司。

2.2 方法

2.2.1 ILT 病例診斷標(biāo)準(zhǔn)

經(jīng)查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，未發(fā)現(xiàn)有關(guān)ILT 的疾病詳細(xì)診斷標(biāo)準(zhǔn)，本次試驗(yàn)根據(jù)ILT 病雞臨床發(fā)病特點(diǎn)及分子生物學(xué)診斷方法，自行制訂本試驗(yàn)病例診斷標(biāo)準(zhǔn)為：具有ILT 典型臨床癥狀（咳嗽、呼吸羅音、發(fā)熱、喉頭腫脹、甩鼻、鼻部有分泌物）和特征性剖檢病變（喉和氣管粘膜腫脹、出血、有分泌物）且喉拭子PCR 檢測(cè)ILTV 為陽性。

2.2.2 ILT 病例納入標(biāo)準(zhǔn)

對(duì)人工造模并確診發(fā)病試驗(yàn)雞ILT 典型臨床癥狀進(jìn)行打分評(píng)估，包括咳嗽次數(shù)、羅音次數(shù)、體溫升高程度和喉頭腫脹程度，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)各項(xiàng)癥狀得分為1 分和2 分的病雞數(shù)量最多，達(dá)到88%，故制定本試驗(yàn)病例納入標(biāo)準(zhǔn)為：各項(xiàng)癥狀得分為1 分或2 分的病例，可用于金芩藍(lán)口服液治療ILT 的實(shí)驗(yàn)性臨床試驗(yàn)。

表1 ILT 病例納入評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

明顯 嚴(yán)重且2出血 3

2.2.3 金芩藍(lán)口服液治療ILT 使用劑量和療程依據(jù)

根據(jù)藥效學(xué)試驗(yàn)結(jié)果，小鼠的金芩藍(lán)口服液用藥劑量為2mL/kg?BW。小鼠標(biāo)準(zhǔn)體重按0.02kg計(jì)算，每只小鼠用藥量應(yīng)為0.04mL。根據(jù)體表面積比率換算等效劑量法（人對(duì)小鼠的等效劑量比值為387.9），計(jì)算人用劑量應(yīng)為0.04mL*387.9=15.52mL。按照臨床經(jīng)驗(yàn)1 個(gè)成人相當(dāng)于40 只雞，雞用藥量應(yīng)為15.52mL/40=0.39mL/只。每只成年雞飲水量約0.2L，雞的飲水給藥劑量應(yīng)為0.39mL/0.2L=1.93mL/L，本試驗(yàn)設(shè)置金芩藍(lán)口服液中劑量為飲水中添加2.0mL/L。故確定復(fù)方芩蘭口服液3 個(gè)試驗(yàn)組的給藥方案為：在飲水中分別按高、中、低三個(gè)劑量（4.0 mL/L、2.0 mL/L、1.0 mL/L）添加金芩藍(lán)口服液。

參考臨床治療雞病常用中藥用藥療程并經(jīng)藥效學(xué)試驗(yàn)驗(yàn)證，金芩藍(lán)口服液連續(xù)用藥5 天可以有效治療動(dòng)物呼吸道炎性病癥，故設(shè)置金芩藍(lán)口服液臨床用藥療程為5 天。

藥物對(duì)照組喉炎凈散根據(jù) 《中國(guó)獸藥典》規(guī)定用量為0.05～0.15g，本試驗(yàn)選取中間劑量0.1g。確定藥物對(duì)照組的給藥方案為：每只雞每天0.1g，拌料添加，連續(xù)用藥5 天。

2.2.4 ILT 病例模型的建立

ILTV 種毒復(fù)壯：將ILTV 種毒滅菌生理鹽水稀釋，經(jīng)絨毛尿囊膜途徑接種10日齡SPF 雞胚，38℃孵化，72h 后無菌收集尿囊液及病變尿囊膜，組織研磨器充分研磨，-20℃反復(fù)凍融，使病毒粒子從組織細(xì)胞中充分釋放出來，離心取上清液，作傳代接種。按上述方法傳至第4 代處理后作為病毒感染液備用，Reed-Muech 氏法計(jì)算ILTV 的EID50。

建立病例模型：選健康試驗(yàn)雞150 只，采用滴鼻方式人工接種ILTV 0.2 mL（100×EID50）/只，同時(shí)雞舍灑水并電扇吹風(fēng)造成冷應(yīng)激。攻毒72h 后，觀察記錄雞群臨床癥狀表現(xiàn)，取10 只剖檢觀察呼吸道病變，所有試驗(yàn)雞采集喉部分泌物進(jìn)行PCR 檢測(cè)，依據(jù)病例診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行發(fā)病診斷。另選20 只健康試驗(yàn)雞作為陰性對(duì)照組，由專人飼養(yǎng)于動(dòng)物房?jī)?nèi)。

2.2.5 PCR 檢測(cè)

PCR 檢測(cè)用于種毒鑒定和試驗(yàn)雞發(fā)病診斷。試驗(yàn)雞棉拭子采集喉部分泌物，提取病毒DNA，PCR 擴(kuò)增ILTV 的TK 基因。TK 基因引物P1：5′- ACG ATG ACT CCG ACT TTC-3′，P2：5′-CGT TGG AGG TAG GTG GTA-3′，由TaKaRa 公司合成，產(chǎn)物大小為643 bp。擴(kuò)增體系：5μL10×buffer、4μLdNTP、上下游引物（25pmol/μL）各1μL，模板DNA4μL、TaqDNA 聚合酶（5 U/μL）0.5μL、加水將體積補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，51℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30 次；最后72℃延伸5 min，之后4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取5μLPCR 產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，于凝膠成像儀中觀察、照相。

2.2.6 試驗(yàn)病例診斷和篩選納入

病例診斷：攻毒72h 后，試驗(yàn)雞表現(xiàn)出一系列臨床癥狀，包括咳嗽，呼吸有羅音，不同程度發(fā)熱，鼻部有分泌物，經(jīng)常甩鼻，喉頭腫脹。剖檢病雞可見喉和氣管粘膜腫脹、出血，表面覆蓋分泌物。實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)檢測(cè)PCR 試驗(yàn)，ILTV 核酸均為陽性。根據(jù)本試驗(yàn)病例診斷標(biāo)準(zhǔn)，判定本試驗(yàn)雞群發(fā)生了ILT。

病例篩選納入：依據(jù)本試驗(yàn)病例納入標(biāo)準(zhǔn)，在受試雞群中選擇同時(shí)符合咳嗽為每分鐘1-2次、羅音為每分鐘1-4 次、體溫為41.6-42.5℃、喉頭有可見腫脹（即各項(xiàng)癥狀得分為1 分或2 分）的病雞100 只，用于金芩藍(lán)口服液治療ILT 的臨床試驗(yàn)。

2.2.7 金芩藍(lán)口服液治療ILT 試驗(yàn)

2.2.7.1 試驗(yàn)動(dòng)物編號(hào)和隨機(jī)分組方法

試驗(yàn)雞編號(hào)：在確診病例中依據(jù)病例納入標(biāo)準(zhǔn)篩選出100 只試驗(yàn)雞，制備腳環(huán)確定初始編號(hào)。方法為取2cm×3cm 紙片100 張，按1、2、3……順序填寫數(shù)字，覆以透明膠帶，依照每籠取出順序分別環(huán)繞粘貼在試驗(yàn)雞雞腳上。20 只陰性對(duì)照組健康雞同法編號(hào)。

試驗(yàn)病雞隨機(jī)分組：將100 只試驗(yàn)病雞初始編號(hào)錄入計(jì)算機(jī)Excel 文件中，賦予隨機(jī)數(shù)字，并按照隨機(jī)數(shù)字由小到大順序?qū)Τ跏季幪?hào)排序，排序后第1～20 個(gè)編號(hào)為第1 組，第21～40 個(gè)編號(hào)為第2 組，以此類推，分出5 組。依照隨機(jī)分組順序?qū)⒃囼?yàn)雞歸籠，每籠10 只，每2 籠為1 組。1～5組分別對(duì)應(yīng)為金芩藍(lán)口服液高、中、低劑量組，藥物對(duì)照組和陽性對(duì)照組。分組信息由試驗(yàn)設(shè)計(jì)人員和飼養(yǎng)管理人員掌握，試驗(yàn)設(shè)計(jì)人員和飼養(yǎng)管理人員不參與試驗(yàn)雞的癥狀、剖檢的觀察和評(píng)分。

2.2.7.2 試驗(yàn)動(dòng)物處理

金芩藍(lán)口服液的3 個(gè)試驗(yàn)組在飲水中分別按高、中、低三個(gè)劑量（4.0 mL/L、2.0 mL/L、1.0 mL/L）添加金芩藍(lán)口服液，全天自由飲用。藥物對(duì)照組在飼料中按0.1g/天/只劑量添加喉炎凈散，陽性對(duì)照組不給藥，陰性對(duì)照組試驗(yàn)雞正常飼養(yǎng)。用藥組連續(xù)用藥5 天，用藥結(jié)束后觀察5 天。試驗(yàn)期間記錄各組雞的死亡情況，試驗(yàn)結(jié)束后根據(jù)臨床癥狀和剖檢病變?cè)u(píng)分標(biāo)準(zhǔn)予以打分，采集喉部組織常規(guī)法制備切片、HE 染色、鏡下觀察并拍照，依據(jù)療效判定標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)各組的治療有效率、治愈率和死亡率。見表2。

表2 試驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

2.2.8 金芩藍(lán)口服液治療ILT 療效判定標(biāo)準(zhǔn)

（1）死亡率：試驗(yàn)期間死亡（排除飼養(yǎng)管理等意外因素），剖檢喉和氣管具有ILT 特征性病變者判定為ILT 死亡病例。死亡雞數(shù)占每組試驗(yàn)雞數(shù)的百分率為死亡率。

（2）有效率：試驗(yàn)結(jié)束后，臨床癥狀有所減輕者判定為有效病例。有效雞數(shù)占每組試驗(yàn)雞數(shù)的百分率為有效率。

（3）治愈率：試驗(yàn)結(jié)束后，臨床癥狀完全消失、剖檢喉和氣管無ILT 特征性病變者判定為治愈病例。治愈雞數(shù)占每組試驗(yàn)雞數(shù)的百分率為治愈率。

（4）用藥后臨床癥狀及剖檢病變?cè)u(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 用藥后ILT 病例臨床癥狀及剖檢病變?cè)u(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS17.0（單因素方差分析和卡方檢驗(yàn)）對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

3.1 人工誘發(fā)ILT 病例模型試驗(yàn)

用于ILTV 種毒增殖的雞胚尿囊膜增厚且出現(xiàn)痘斑，胚體有出血，四代病毒液經(jīng)PCR 擴(kuò)增呈陽性。Reed-Muech氏法計(jì)算ILTV 的EID50為10-4.81/0.2mL。

陰性對(duì)照組雞正常生長(zhǎng)，無病征和死亡，喉拭子PCR 擴(kuò)增ILTV 呈陰性。人工接種ILTV 的雞群在攻毒72h 后，陸續(xù)出現(xiàn)癥狀，包括采食減少，體溫升高，縮頭閉眼，頸部羽毛逆立。病雞經(jīng)?？人?，有鼻液，張口呼吸，有濕性羅音，喉部紅腫，有的眼瞼腫脹。剖檢具有典型臨床癥狀的病雞，可見喉頭和氣管粘膜腫脹，有明顯出血點(diǎn)，氣管內(nèi)壁覆蓋帶血的黏液性分泌物，個(gè)別雞肺臟有出血點(diǎn)。采集喉部分泌物PCR 擴(kuò)增ILTV 均呈陽性。依據(jù)ILT 病例診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，150 只雞全部發(fā)病，發(fā)病率為100%。

3.2 金芩藍(lán)口服液對(duì)ILT 病雞臨床癥狀的影響

統(tǒng)計(jì)結(jié)果可見，各組雞癥狀評(píng)分在試驗(yàn)開始時(shí)組間差異不顯著。經(jīng)用藥治療后各組雞臨床癥狀均有所減輕。至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，金芩藍(lán)口服液高、中劑量組所有癥狀和剖檢評(píng)分與陽性對(duì)照組比較差異極顯著（P＜0.01），且均低于金芩藍(lán)口服液低劑量組和藥物對(duì)照組，高、中劑量?jī)山M間差異不顯著（P＞0.05）。各組雞癥狀及剖檢評(píng)分見表4。

表4 人工感染ILT 病雞臨床癥狀及剖檢病變?cè)u(píng)分(n=20)

3.3 金芩藍(lán)口服液對(duì)ILT病雞喉部組織病變的影響

組織切片鏡下觀察可見，陰性對(duì)照組喉部黏膜表面纖毛整齊，黏膜層腺體結(jié)構(gòu)完整；陽性對(duì)照組喉部黏膜表面纖毛脫落，黏膜層細(xì)胞排布雜亂、松散，腺體結(jié)構(gòu)破壞甚至消失；各用藥組與陽性對(duì)照組比較，組織病變較輕，結(jié)構(gòu)基本正常，有部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

3.4 金芩藍(lán)口服液對(duì)ILT 病雞的治療效果

經(jīng)比較可見，用藥治療后病雞死亡情況得到控制，各用藥組死亡率均明顯低于陽性對(duì)照組，其中金芩藍(lán)口服液高劑量組與陽性對(duì)照組比較差異顯著（P＜0.05）。金芩藍(lán)口服液高劑量組治療有效率達(dá)到100%，治愈率為90%，中劑量組有效率為95%，治愈率為80%，均高于低劑量組和藥物對(duì)照組，且高、中劑量?jī)山M間差異不顯著（P＞0.05）。證明金芩藍(lán)口服液按高劑量（4.0mL/L）、中劑量（2.0mL/L）給藥，對(duì)ILT 病雞的治療效果優(yōu)于喉炎凈散。陽性對(duì)照組病雞在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，有個(gè)別自愈，但自愈率極低，與所有用藥組比較差異極顯著（P＜0.01）。各組治療效果見表5。

表5 金芩藍(lán)口服液對(duì)ILT 病雞的治療效果（n=20）

4 討論和結(jié)論

本試驗(yàn)通過人工接種ILTV 結(jié)合冷應(yīng)激的方法，導(dǎo)致試驗(yàn)雞在染毒72h 后出現(xiàn)ILT 典型臨床癥狀和特征性剖檢病變，喉拭子PCR 檢測(cè)ILTV為陽性，隔離飼養(yǎng)的陰性對(duì)照組雞正常生長(zhǎng)無病征和死亡，證明本次試驗(yàn)成功制造了ILT 病例模型，發(fā)病率為100%。依據(jù)病例納入評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)確診病雞進(jìn)行癥狀評(píng)分，考慮到避免單項(xiàng)指標(biāo)過輕或過重病例無法客觀的反應(yīng)藥效，故而選擇每項(xiàng)癥狀得分為1 分或2 分的試驗(yàn)雞進(jìn)行復(fù)方芩蘭口服液的實(shí)驗(yàn)性臨床試驗(yàn)。采用隨機(jī)方法分組后經(jīng)統(tǒng)計(jì)各組雞癥狀評(píng)分差異不顯著，保證了本次試驗(yàn)各組納入病例品種、年齡、病期相同，病程、體質(zhì)相近，符合農(nóng)業(yè)部對(duì)獸用中藥、天然藥物臨床試驗(yàn)的樣本納入要求，從而確保本試驗(yàn)的數(shù)據(jù)和結(jié)果科學(xué)可信。

本試驗(yàn)中使用金芩藍(lán)口服液按高、中、低三種劑量治療人工感染ILT 病雞，各組的臨床癥狀和剖檢病變均有所改善。比較各組的療效指標(biāo)，金芩藍(lán)口服液高、中、低劑量組有效率分別為100%、95%和90%，治愈率分別為90%、80%和60%，藥物對(duì)照組有效率為90% ，治愈率為75%，金芩藍(lán)口服液高、中劑量組治療效果優(yōu)于低劑量組和藥物對(duì)照組。本試驗(yàn)證實(shí)金芩藍(lán)口服液對(duì)ILT 癥候有顯著的治療作用，雞飲服本藥的最適治療濃度為2mL/L～4mL/L。因此，金芩藍(lán)口服液有效減輕ILT 病雞的臨床癥狀和組織病變，降低死亡率，可用于雞傳染性喉氣管炎引起的發(fā)熱、咳嗽、咽喉腫痛，且綜合考慮臨床用藥效果推薦用法用量為：雞，2mL/L 混飲，連用5 天。