多組學(xué)技術(shù)揭示葡萄葉片響應(yīng)灰葡萄孢菌侵染的抗性機(jī)制

方獻(xiàn)平，和雅妮，奚曉軍，查倩，張麗勍，蔣愛麗

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所，上海 201403）

由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)侵染植株引起的灰霉病是葡萄生產(chǎn)過程中的一類重要病害[1]。該菌在土壤或宿主中能夠以菌絲或菌核形式休眠越冬，在春季溫度適宜、濕度較高的條件下往往可迅速萌發(fā)形成大量孢子。真菌孢子可在風(fēng)雨媒介等因素影響下，進(jìn)一步感染葡萄葉片、葉柄和花穗等部位，從而在葡萄植株中廣泛傳播；在適宜的氣候條件下，孢子能在發(fā)病的葡萄組織處快速增殖和分生出新的孢子，從而急劇加重被感染植株的病情[2-3]。當(dāng)前針對灰霉病的防控主要以藥劑防治為主，但面臨著成本高和環(huán)境污染等一系列問題。

隨著現(xiàn)代生命科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，許多研究者紛紛借助不同的生物技術(shù)手段對植物-病原菌互作機(jī)制進(jìn)行了探索。蛋白質(zhì)組學(xué)是研究生物體內(nèi)整體蛋白質(zhì)組成成分及其變化規(guī)律的學(xué)科，能直接在蛋白表達(dá)水平上揭示生物變化的動態(tài)規(guī)律。蛋白質(zhì)組學(xué)作為挖掘抗病基因工作中一種重要的功能基因篩查技術(shù)手段，在包括擬南芥、煙草和葡萄等多種作物的植病互作機(jī)制研究中已經(jīng)得到了極為廣泛的應(yīng)用[4]。MUKHERJEE等通過二維電泳的方法在擬南芥中分離得到11個受黑斑病菌侵染而發(fā)生顯著變化的蛋白，其中病程相關(guān)蛋白PR4、糖基水解酶及抗菌蛋白等在黑斑病菌侵染后表達(dá)水平顯著上調(diào)，這些蛋白/基因可能對擬南芥抵御黑斑病菌的侵染起到一定的防御作用[5]。YAO等通過差異熒光凝膠電泳的方法研究葡萄與白粉病菌互作的過程，篩選得到了多種抗病相關(guān)蛋白，如PR類蛋白、NBS-LRR類膜上受體等[6]。在植病互作研究過程中，代謝組學(xué)研究手段往往能通過明確植物感染病菌前后代謝分子的變化規(guī)律，從而找到相關(guān)的代謝路徑和關(guān)鍵蛋白/基因，為功能機(jī)制的探討提供思路[7]。借助代謝組學(xué)研究方法，BATOVSKA等在葡萄葉片中鑒定了響應(yīng)白粉病菌和霜霉病菌的一類重要代謝標(biāo)志物——脂肪酸[8]。VON等借助代謝組學(xué)技術(shù)在擬南芥中找到葡糖基轉(zhuǎn)移酶的底物——異亮氨酸，從而進(jìn)一步揭示了茉莉酸信號途徑在白粉病菌防御過程中的重要性[9]。

隨著生物物理和分析化學(xué)等多學(xué)科技術(shù)的交叉融合，基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的蛋白分離鑒定手段已經(jīng)逐漸取代凝膠電泳技術(shù)，成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的主流研究方法[4,10-11]?；谝嘿|(zhì)聯(lián)用的代謝物分離鑒定技術(shù)也在代謝組學(xué)研究中得到非常廣泛的應(yīng)用[12-15]。然而，單一組學(xué)研究得出的結(jié)論可能還不夠全面，因此借助多組學(xué)技術(shù)有利于進(jìn)一步解決單一組學(xué)研究中可能出現(xiàn)的片面性問題[16-17]。

因此，本研究以灰葡萄孢菌高抗葡萄品種葉片為試驗材料，利用基于液質(zhì)聯(lián)用的非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)和非靶向定量代謝組學(xué)技術(shù)比較其響應(yīng)灰葡萄孢菌侵染的蛋白質(zhì)和代謝物表達(dá)差異，并采用基于多層組學(xué)整合的生物信息學(xué)方法，對響應(yīng)病菌侵染的差異蛋白和代謝物變化水平進(jìn)行深入比較分析，挖掘抗性品種顯著變化的信號通路，探索葡萄對灰葡萄孢菌的抗性機(jī)制，為今后抗病基因克隆和分子育種奠定重要的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及取樣

試驗用葡萄品種‘申豐’和‘巨峰’由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所葡萄生產(chǎn)基地提供。灰霉病菌株從感病的葡萄植株中分離，并通過形態(tài)學(xué)和序列分析進(jìn)行鑒定，以0.001%體積比的吐溫80為溶劑制成濃度為5.0×106U/mL的孢子懸液，噴灑于葡萄植株葉部進(jìn)行病菌感染。同時，設(shè)模擬處理組，噴灑液為0.001%體積比的吐溫80。真實接菌或模擬處理后將植株移入氣候室繼續(xù)生長，保持溫度20℃，濕度90%，3 d后取葉片作為試驗材料。每5株幼苗葉片組織取樣混合作為1個生物學(xué)重復(fù)，蛋白質(zhì)組每個樣本設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)；考慮到代謝物成分的復(fù)雜性和不穩(wěn)定性，代謝組試驗要求更嚴(yán)格，每個樣本設(shè)5個生物學(xué)重復(fù)。

1.2 非標(biāo)記定量差異蛋白質(zhì)組學(xué)試驗

1.2.1 蛋白質(zhì)的提取及定量

稱取1.5 g新鮮葉片，研磨成細(xì)粉，分裝入1.5 mL離心管中，加入1 mL左右蛋白提取液Ⅰ（含10%三氯乙酸和0.07%β-巰基乙醇的丙酮溶液）沉淀粗蛋白（－20 ℃，1 h），在4 ℃、1.3×104r/min條件下離心20 min。再加入相同體積的蛋白提取液Ⅱ（含0.07%β-巰基乙醇的丙酮溶液）懸浮粗蛋白（－20℃，1 h），在4℃、1.3×104r/min條件下離心20 min。真空抽干得粗蛋白干粉。稱取50 mg粉末，加入1 mL裂解液（8 mol/L尿素、10 mmol/L二硫蘇糖醇、2 mmol/L乙二胺四乙酸和1 mmol/L苯甲基磺酰氟）中，振蕩混勻，4℃放置1 h，其間取出振蕩3～5次，在20℃、1.3×104r/min條件下離心15 min，棄沉淀，取上清液。用Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，并用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測總蛋白提取質(zhì)量，分裝，于－80℃條件下保存，備用。

1.2.2 還原烷基化、胰酶酶解與C18柱除鹽

取約100 μg蛋白樣本進(jìn)行酶解，按1∶10體積比加入100 mmol/L二硫蘇糖醇至終濃度為10 mmol/L，在56℃條件下還原反應(yīng)1 h。冷卻至室溫后，按1∶10體積比加入500 mmol/L碘代乙酰胺至終濃度為50 mmol/L，避光反應(yīng)45 min。按1∶10體積比加入100%的三氯乙酸至終濃度為10%，4℃沉淀2 h；用冷丙酮洗3次后離心得沉淀顆粒，溶于100 mmol/L NH4HCO3中，超聲5 min。按酶與蛋白質(zhì)量比1∶50加入胰蛋白酶，37℃反應(yīng)12 h。酶解后的肽段經(jīng)德國Qiagen公司的C18固相萃取柱除鹽后，進(jìn)行真空干燥。

1.2.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用與數(shù)據(jù)庫搜索鑒定

真空干燥后的肽段用0.1%甲酸水溶液溶解，之后使用EASY-nLC 1000超高效液相系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific公司，美國）進(jìn)行分離。流動相A為含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液；流動相B為含0.1%甲酸和98%乙腈的水溶液。液相梯度設(shè)置：5%～8%，6 min；8%～30%，34 min；30%～60%，5 min；60%～80%，3 min；80%，7 min平衡；80%～5%，3 min；5%，7 min平衡。流速維持在200 nL/min。肽段經(jīng)由超高效液相系統(tǒng)分離后被注入離子源中進(jìn)行電離，然后于Q ExactiveTM質(zhì)譜系統(tǒng)中進(jìn)行分析。二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Proteome Discoverer 1.4軟件檢索Uniprot葡萄蛋白數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/proteomes/UP000009183），在數(shù)據(jù)庫中加入常見的污染庫，用于消除鑒定結(jié)果中污染蛋白的影響。借助Thermo Fisher Sieve 2.2軟件對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行相對定量，以峰面積作為每條肽段的定量值，差異定量標(biāo)準(zhǔn)必須滿足某個蛋白至少在2個生物學(xué)重復(fù)中被鑒定到，且接菌組蛋白質(zhì)/模擬組蛋白質(zhì)＞1.50或＜0.67，P＜0.05，CV＜30%。

1.2.4 差異蛋白的信息注釋、功能分類與功能富集

利用Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫（http://www.ebi.uniprot.org）對所鑒定到的各差異蛋白進(jìn)行基因本體（gene ontology,GO）分析，依據(jù)蛋白參與的生物學(xué)過程、細(xì)胞學(xué)組分和分子功能屬性，對葡萄響應(yīng)灰霉菌感染的差異蛋白進(jìn)行GO注釋和功能分類。以鑒定到的蛋白質(zhì)為背景，分別進(jìn)行GO富集和京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路富集分析。

1.3 非靶標(biāo)定量差異代謝組學(xué)試驗

1.3.1 葡萄葉片代謝物的提取及定量

稱取40 mg經(jīng)液氮碾磨之后的葉片樣品，加入800 μL預(yù)冷的0.1%甲酸甲醇溶液，立即充分渦旋30 s，然后持續(xù)超聲破碎30 min，接著在4℃、1.2×104r/min條件下高速離心15 min。小心取出離心管，移取200 μL上清液，經(jīng)0.22 μm細(xì)菌過濾器過濾后，轉(zhuǎn)入進(jìn)樣小瓶中。

1.3.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

代謝組試驗所用的儀器分析平臺為高效液相色譜Ultimate 3000，質(zhì)譜儀為 Orbitrap Q-Exactive，分離色譜柱為Hypergod C18（100 mm×4.6 mm，3 μm）（Thermo Fisher Scientific公司，美國）。色譜分離條件為：柱溫40℃，流速0.3 mL/min；流動相A（0.1%甲酸水溶液）和B（0.1%甲酸乙腈溶液）。梯度洗脫程序為：95%，2 min；95%～5%，10 min；5%，3 min；5%～95%，2 min。流速維持在0.3 mL/min，進(jìn)樣量為4 μL，自動進(jìn)樣器溫度4℃，在正負(fù)離子模式下各掃描1次。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理、代謝物定性定量與代謝通路富集分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)Thermo Fisher Sieve 2.2軟件進(jìn)行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊和歸一化分析處理。采用多維分析和單維分析相結(jié)合的辦法，篩選組間差異代謝物，篩選的標(biāo)準(zhǔn)為該軟件中的一般變量權(quán)重值（variable important in projection,VIP）大 于 1，P＜0.05。 基 于 Metlin、KEGG、KNApSAcK和HMDB等公共數(shù)據(jù)庫及自建數(shù)據(jù)庫，采用Thermo Fisher Sieve 2.2軟件對代謝物進(jìn)行定性分析。借助Thermo Fisher Sieve 2.2軟件對差異代謝物進(jìn)行相對定量，以峰面積作為每種代謝物的相對定量值，差異定量標(biāo)準(zhǔn)必須滿足某個代謝物至少在3個生物學(xué)重復(fù)中被鑒定到，且接菌組蛋白質(zhì)/模擬組蛋白質(zhì)＞1.50或＜0.67，P＜0.05，CV＜30%。對滿足條件的目標(biāo)差異代謝物進(jìn)行KEGG代謝通路富集分析。

1.4 差異蛋白質(zhì)組和代謝組聯(lián)合分析

利用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異蛋白和代謝分子參與的信號通路進(jìn)行聯(lián)合分析：一方面，根據(jù)差異蛋白及差異代謝物的KEGG路徑分析結(jié)果，尋找其共同參與的路徑，進(jìn)行后續(xù)綜合分析；另一方面，通過ID轉(zhuǎn)換，將蛋白和代謝物ID統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為KEGG格式，然后映射到KEGG數(shù)據(jù)庫，獲取其整合的路徑圖形，直觀地展現(xiàn)分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄葉片在接種灰葡萄孢菌前后的病癥變化

葡萄品種‘申豐’葉片在模擬接種后未見任何病癥，在真實接種灰葡萄孢菌3 d后僅出現(xiàn)個別極微小病斑，而‘巨峰’在真實接菌3 d后出現(xiàn)了較為明顯的病斑（圖1），反映出葡萄品種‘申豐’對灰葡萄孢菌極強(qiáng)的抗性。本研究僅對模擬和接菌3 d的‘申豐’葉片進(jìn)行了比較多組學(xué)分析。

2.2 葡萄葉片差異應(yīng)答蛋白質(zhì)的定性與定量

本研究在每一個生物學(xué)重復(fù)中都鑒定到了2 400個以上的蛋白質(zhì)（圖2A～B）。模擬組中3次生物學(xué)重復(fù)試驗總共鑒定到3 285個蛋白質(zhì)（圖2A），接菌組中總共鑒定到3 481個蛋白質(zhì)，取得了比較全面的鑒定結(jié)果（圖2B）。在差異蛋白質(zhì)定量比較中，我們采取非常嚴(yán)格的篩選策略，須同時滿足以下2個條件：1）某個蛋白質(zhì)至少在各組樣本的2次生物學(xué)重復(fù)中被鑒定到。模擬組和接菌組中分別有2 396和2 602個蛋白滿足此要求，其中2 092個蛋白質(zhì)在2組樣本中被共同鑒定到（圖2C）。2）在差異表達(dá)蛋白質(zhì)中，滿足接菌組蛋白質(zhì)/模擬組蛋白質(zhì)＞1.50或＜0.67，P＜0.05，CV＜30%，才能被界定為顯著差異表達(dá)。經(jīng)過這2個條件篩選，有304個蛋白質(zhì)在病菌處理后表達(dá)消失，510個蛋白質(zhì)表達(dá)新增，而在2 092個共性蛋白質(zhì)中只有358個蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生顯著上調(diào)，202個蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生顯著下調(diào)（圖2C）。這些發(fā)生消失或新增的差異蛋白質(zhì)和顯著上下調(diào)的共性蛋白質(zhì)共計1 374個，在本研究中被界定為顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)，其中差異表達(dá)3.0倍以上的共性蛋白質(zhì)如表1所示。

圖1 模擬和真實接種灰葡萄孢菌3 d后‘申豐’‘巨峰’葡萄葉片的病癥變化Fig.1 Symptom of Vitis vinifera cultivar‘Shenfeng’and‘Jufeng’leaves induced by mock and B.cinereainfection for three days

A.模擬接種組中3次重復(fù)試驗的蛋白鑒定情況；B.真實接菌組中3次重復(fù)試驗的蛋白鑒定情況；C.模擬與接菌樣本蛋白組鑒定情況。A.Summary of the identified proteins in three repeated experiments of mock-infected samples;B.Summary of the identified proteins in three repeated experiments of B.cinerea-infected samples;C.Diagram of total proteins identified in mock-and B.cinerea-infected samples.

表1 葡萄葉片差異表達(dá)3.0倍以上的蛋白質(zhì)定量信息Table 1 Quantitation information of differentially expressed proteins for more than three folds

續(xù)表1 Continuation of Table 1

2.3 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的功能分類

圖3 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的GO功能歸類分析Fig.3 GO functional category analysis of differentially expressed proteins

對1 374個差異蛋白質(zhì)進(jìn)行GO功能分類（圖3）發(fā)現(xiàn)：在生物學(xué)進(jìn)程中，生物學(xué)調(diào)控、定位和脅迫應(yīng)答等過程占據(jù)了較大比例，分別為17%、16%和11%；在細(xì)胞成分分析中，較多差異蛋白質(zhì)位于各種形式細(xì)胞器（41%）和細(xì)胞膜（25%）中，且往往參與了大分子復(fù)合體（20%）的組成；而在分子功能的分類中，連接活性（49%）和催化活性（26%）占比較高。

2.4 差異表達(dá)蛋白的功能與代謝通路富集分析

本研究以鑒定到的蛋白為背景，分別進(jìn)行了GO富集和KEGG通路富集分析。GO富集分析顯示：葉綠體、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶活性和氧化還原過程3個子集的富集程度最高（圖4A）；除了以上3個子集之外，質(zhì)體、氧化還原活性和單位代謝過程等子集的富集程度都排在了各個二級注釋的前列位置。KEGG富集分析顯示，植病互作過程、核糖體和MAPK信號通路的富集程度都比較高（圖4B），預(yù)示這幾條路徑改變最為明顯。

2.5 差異代謝物的篩選和定性定量分析

我們采用多維分析和單維分析相結(jié)合的辦法，來篩選組間差異代謝物，并結(jié)合Metlin、KEGG、KNApSAcK和HMDB等多種公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行定性分析，共鑒定和定量篩選到64種差異代謝物。其中，變化倍數(shù)為接菌組蛋白質(zhì)/模擬組蛋白質(zhì)＞1.5或＜0.67的差異代謝物有33種（P＜0.01）（表2）。

圖4 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的GO功能（A）和KEGG代謝通路富集（B）分析Fig.4 GO function(A)and KEGG pathway enrichment(B)analysis of differentially expressed proteins

表2 33種變化1.5倍以上的差異代謝物Table 2 Thirty-three differentially expressed metabolites(more than 1.5-fold)

續(xù)表2 Continuation of Table 2

2.6 差異代謝物參與的代謝通路分析

利用差異代謝物的KEGG ID進(jìn)行通路富集分析，獲得代謝通路富集結(jié)果。該代謝通路的P＜0.05表示差異顯著，P值越小，則差異性越顯著，并計算出了－lgP。本研究分析發(fā)現(xiàn)，差異代謝物參與了硫胺素代謝、苯丙氨酸合成和生物堿合成等眾多代謝過程，其中以植物激素的生物合成代謝通路改變最為明顯（圖5）。

圖5 差異代謝物參與的KEGG代謝通路富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis of differentially expressed metabolites

2.7 差異蛋白質(zhì)組與代謝組數(shù)據(jù)的整合分析

本研究對蛋白質(zhì)組與代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行了聯(lián)合分析，將各組學(xué)結(jié)果富集得到的P值轉(zhuǎn)換為－lgP，發(fā)現(xiàn)灰葡萄孢菌侵染從蛋白組和代謝組水平上主要共同改變了葡萄葉片組織內(nèi)以下幾條代謝路徑：光合作用過程、丙酮酸代謝、糖酵解/糖異生和次生代謝物的生物合成等。然而在蛋白和代謝物水平上發(fā)生共同變化的所有代謝通路中，激素水楊酸的生物合成與抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑改變尤為顯著（圖6）。在這條通路中，灰葡萄孢菌的侵染誘使異分支酸丙酮酸裂解酶pchB、轉(zhuǎn)錄因子TGA和病程相關(guān)蛋白PR-1分別上調(diào)5.12、2.09和3.33倍（表1）；相應(yīng)地，定量代謝組學(xué)檢測出水楊酸和分支酸含量也分別增加了3.84和2.92倍（表2）。本研究結(jié)果可以揭示出，高抗葡萄品種‘申豐’采取了一條積極的水楊酸信號通路上調(diào)策略來頗為有效地抵御了灰葡萄孢菌的侵染。

3 討論

3.1 受灰葡萄孢菌侵染影響最大的蛋白群體集中于葉綠體

在差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，GO二級注釋結(jié)果顯示響應(yīng)病菌的差異應(yīng)答蛋白質(zhì)在葉綠體中顯著富集。

很多研究已經(jīng)表明，病菌侵染會使植物的光合速率明顯下降，葉綠體受到破壞，葉綠素含量降低，光合作用減弱[18-20]。本研究結(jié)果顯示，葉綠體基質(zhì)蛋白和葉綠體被膜蛋白的表達(dá)水平都發(fā)生了下調(diào)。其中，果糖-1,6-二磷酸醛縮酶、促氧增強(qiáng)結(jié)合蛋白和捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白表達(dá)分別下調(diào)了3.85、1.59和1.69倍。果糖-1,6-二磷酸醛縮酶負(fù)責(zé)催化果糖-1,6-二磷酸和景天庚酮糖-1,7-二磷酸的合成反應(yīng)，是卡爾文循環(huán)中的重要限速步驟。促氧增強(qiáng)結(jié)合蛋白是光合系統(tǒng)Ⅱ的重要組成部分，在電子傳遞中發(fā)揮重要作用。捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白可與葉綠素和類胡蘿卜素結(jié)合形成捕光葉綠素蛋白復(fù)合體，從而能吸收光能并將其迅速轉(zhuǎn)化為化學(xué)能存儲在植物體內(nèi)[21]。這3類重要的光合作用相關(guān)蛋白的下調(diào)表達(dá)，很有可能與灰霉菌的侵染在一定程度上影響了葉綠體的正常生理功能有關(guān)。在其他逆境脅迫中，研究人員也觀察到這些酶下調(diào)表達(dá)的現(xiàn)象，如SARRY等通過雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜的研究手段發(fā)現(xiàn)重金屬處理會使擬南芥體內(nèi)的果糖-1,6-二磷酸醛縮酶蛋白表達(dá)明顯下調(diào)[22]。

長方形代表酶，橢圓形代表小分子代謝物，紅色箭頭表示表達(dá)上調(diào)，數(shù)字表示上調(diào)倍數(shù)。The rectangles represent enzymes,and the ellipses represent small molecule metabolites,and the red arrows and number indicate the expression up-regulation and multiple of up-regulation,respectively.

3.2 植物激素與生物堿合成途徑改變明顯

植物在生長過程中會受到各種生物和非生物脅迫，代謝組學(xué)技術(shù)可以系統(tǒng)地鑒定出植物應(yīng)答脅迫產(chǎn)生的各種抗性小分子及抵御病原物入侵的小分子前體，不僅可以了解植物的整體防御狀態(tài)，也可以鑒定植物在病菌侵染情況下產(chǎn)生的標(biāo)志性分子[23-24]。本代謝組學(xué)研究結(jié)果顯示：差異代謝物涉及嘌呤源生物堿和煙酸生物堿、莽草酸途徑生物堿、萜和聚酮體生物堿、苯丙素、植物激素和萜與類固醇的生物合成等各個方面。在植物與病原菌的互作過程中，植物會產(chǎn)生一系列的抗病反應(yīng)，其中最重要的一類初級反應(yīng)便是能調(diào)控次級代謝通路上相關(guān)基因/酶的表達(dá)變化，從而進(jìn)一步指導(dǎo)調(diào)控次級代謝物的合成。包括煙酸、萜、非蛋白氨基酸和苯丙素等在內(nèi)的小分子代謝物不但可以作為抗體抵御病菌侵染，而且還可以作為信號物質(zhì)參與植物的防衛(wèi)反應(yīng)[25]。如HUFFAKER等發(fā)現(xiàn)，催化合成半倍萜的2個基因TPS6和TPS11都發(fā)生了明顯的表達(dá)上調(diào)[26]。本試驗結(jié)果和已有的研究發(fā)現(xiàn)都表明，次生代謝物的明顯變化是植物體防御病菌侵染的積極響應(yīng)。

3.3 水楊酸介導(dǎo)的抗病信號通路全面激活

水楊酸已被廣泛證實是植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性的重要小分子信號物質(zhì)。植物中水楊酸可以由分支酸經(jīng)異分支酸合酶pchA催化形成異分支酸，然后再由異分支酸丙酮酸裂解酶pchB催化轉(zhuǎn)變?yōu)樗畻钏醄27]。水楊酸可以繼續(xù)與細(xì)胞內(nèi)受體NPR1互作，然后NPR1作為轉(zhuǎn)錄輔助因子與轉(zhuǎn)錄因子TGA結(jié)合，再進(jìn)一步啟動抗性基因PR-1的表達(dá)[28]。

在本研究中，差異代謝組學(xué)鑒定到激素合成路徑中的中間產(chǎn)物分支酸和終產(chǎn)物水楊酸的含量都呈現(xiàn)大幅度的增加，而且異分支酸丙酮酸裂解酶pchB也出現(xiàn)明顯表達(dá)上調(diào)。在水楊酸后續(xù)誘導(dǎo)的抗病信號路徑中，蛋白組學(xué)鑒定到的轉(zhuǎn)錄因子TGA和病程蛋白PR-1表達(dá)水平也急劇上升。本多組學(xué)綜合研究的結(jié)果表明，水楊酸合成與抗病信號通路的全面激活，可能是高抗葡萄品種‘申豐’有效抵御灰葡萄孢菌侵染的重要手段。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究利用基于液質(zhì)聯(lián)用的定量蛋白質(zhì)組和代謝組學(xué)技術(shù)綜合分析了灰霉病高抗葡萄品種‘申豐’在病菌侵染前后的組學(xué)變化。一共鑒定到了差異變化值在1.5倍以上的1 374個蛋白和33種代謝物。系列生物信息學(xué)分析表明，葉綠體蛋白表達(dá)豐度受病菌侵染影響最大，植病互作、植物激素與生物堿合成3條途徑改變最為明顯，其中水楊酸介導(dǎo)的抗病信號通路的全面激活可能是葡萄葉片有效抵御灰葡萄孢菌侵染的重要策略。