浙江省淳安縣中華蜜蜂蜂房球菌聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

郭蕊，董捷，郭海坤，李君竹，王德前*

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 310021；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，杭州 310021；3.浙江省淳安千島湖好清蜜蜜蜂專(zhuān)業(yè)合作社，杭州 311701）

淳安縣隸屬于浙江省杭州市，屬山地丘陵區(qū)，蜜源豐富，以野桂花、枇杷花、山茶花、油菜花為主。隨著精準(zhǔn)扶貧工作的開(kāi)展，淳安縣政府對(duì)當(dāng)?shù)氐闹腥A蜜蜂（又稱(chēng)為“中蜂”）飼養(yǎng)業(yè)十分重視并大力推廣。目前，該地區(qū)的中蜂養(yǎng)殖量大幅度增加，但與此同時(shí)，各種蜜蜂傳染性疾病相繼爆發(fā)，對(duì)中蜂的健康和蜂產(chǎn)品的安全生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅[1]，因此，做好病害流行病學(xué)調(diào)查，因地制宜采取有效防治措施顯得尤為重要。然而，中蜂最易感染的細(xì)菌傳染病——?dú)W洲幼蟲(chóng)腐臭病在淳安縣中蜂中的流行情況尚不明確。

歐洲幼蟲(chóng)腐臭病（European foulbrood,EFB），簡(jiǎn)稱(chēng)“歐幼病”，是發(fā)生于蜜蜂幼蟲(chóng)和蛹中的一種惡性細(xì)菌性消化道疾病[2]，在世界范圍內(nèi)均有發(fā)生。歐幼病的病原主要為蜂房球菌（Melissococcus pluton）。中蜂一旦感染蜂房球菌，其傳播迅速，發(fā)病快，且遷延不愈。據(jù)報(bào)道，中蜂較意蜂更易感染，發(fā)病程度比西方蜜蜂更為嚴(yán)重[3]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將歐幼病列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病[4]。研究表明，感染了蜂房球菌的蜜蜂幼蟲(chóng)化蛹后，病原仍可在蜂群內(nèi)繼續(xù)存活若干年，常常于春秋繁殖季節(jié)復(fù)發(fā)；在生產(chǎn)中主要采取防治結(jié)合、以防為主的措施[4]。因此，對(duì)病原早期感染的檢測(cè)非常關(guān)鍵。蜂房球菌因其對(duì)培養(yǎng)條件要求嚴(yán)苛并存在顯著的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，所以很難分離出其單菌落[5-6]，且細(xì)菌涂片鏡檢[7]、分離培養(yǎng)[8]、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）[9]等傳統(tǒng)檢測(cè)方法無(wú)法滿足病原鑒定需要。

本文以中蜂蜂房球菌的16S rRNA基因保守序列（登錄號(hào)：AB61407.1）為模板設(shè)計(jì)引物，建立了快速檢測(cè)蜂房球菌的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）方法，并用于開(kāi)展淳安縣中蜂歐幼病的流行病學(xué)調(diào)查，為該地區(qū)制定歐幼病的防治措施提供科學(xué)依據(jù)，并對(duì)當(dāng)?shù)刂蟹浣】导懊鄯滹曫B(yǎng)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集

2017年11月1日至12月31日，根據(jù)中蜂場(chǎng)在淳安縣的分布密度，從該縣17個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的34個(gè)中蜂場(chǎng)采集298群蜜蜂樣品；每群隨機(jī)取50～100只工蜂，裝入帶有煉糖的蜂籠中，活體蜜蜂經(jīng)CO2處理后立即用液氮冷凍，并置于－80℃冰箱中保存。

1.1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司；1 000 bp DNA標(biāo)志物、pMD19-T載體、BamHⅠ和HindⅢ（QuickCutTM）內(nèi)切酶均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；2×EasyTaqPCR SuperMix、Trans2K Plus DNA標(biāo)志物、感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1、PCR產(chǎn)物純化試劑盒和質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。無(wú)水乙醇等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)，分析純。

1.2 歐幼病PCR檢測(cè)方法的建立

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中蜂房球菌16S rRNA基因保守序列（登錄號(hào)：AB61407.1），利用DNAStar和Oligo 6.24軟件設(shè)計(jì)F/R上下游引物（F：5′-GCGGCTCTC TGGTCTGTAACT-3′；R：5′-TGCTTAACCTCGCG GTCTT-3′），預(yù)計(jì)擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為548 bp，引物由江蘇省蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.2 DNA的提取

選擇感染蜂房球菌的中蜂幼蟲(chóng)，經(jīng)液氮研磨，參照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA，并保存于－20℃冰箱中。

1.2.3 PCR退火溫度的優(yōu)化

以提取的DNA為模板，參考所設(shè)計(jì)引物的退火溫度值，優(yōu)化PCR退火溫度。反應(yīng)體系（50 μL）：DNA 1 μg，2×EasyTaqPCR SuperMix 25 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，用ddH2O補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，按50～65℃設(shè)置溫度梯度，退火30 s，72℃延伸1.5 min，共35個(gè)循環(huán)；最后，72℃再延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，以選擇最適的退火溫度。以ddH2O代替DNA模板作為陰性對(duì)照。

1.2.4 重組質(zhì)粒構(gòu)建及雙酶切鑒定

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1中，采用藍(lán)白斑篩選、BamHⅠ和HindⅢ雙酶切方法篩選包含插入片段的重組質(zhì)粒。雙酶切反應(yīng)體系（30 μL）：10×QuickCut緩沖液3 μL，陽(yáng)性重組質(zhì)粒8 μL，BamHⅠ1 μL，Hind Ⅲ 1 μL，用ddH2O補(bǔ)足至30 μL。反應(yīng)條件：30℃溫育10 min；37℃溫育10 min。反應(yīng)結(jié)束后，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，然后對(duì)陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的BLAST進(jìn)行比對(duì)。

1.2.5 特異性試驗(yàn)

以蜜蜂子囊球菌（Ascosphaera apis）、蜜蜂微孢子蟲(chóng)（Nosema apis）、幼蟲(chóng)芽孢桿菌（Paenibacillus larvae）和蜂房球菌陽(yáng)性樣品的DNA為模板，以本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物和最適退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以鑒定該方法的特異性。以ddH2O代替DNA模板作為陰性對(duì)照。

1.2.6 靈敏度試驗(yàn)

利用NanoVue紫外分光光度計(jì)測(cè)質(zhì)粒DNA的濃度，然后將5 μL模板稀釋成拷貝數(shù)系數(shù)為1的質(zhì)粒溶液，并依次10倍稀釋至0.01 μL－1。每個(gè)稀釋度取1 μL作為模板進(jìn)行PCR，根據(jù)出現(xiàn)目的條帶模板的最大稀釋倍數(shù)，確定模板濃度并推算最低檢出拷貝數(shù)。以1.2.4構(gòu)建的重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照；以ddH2O代替DNA模板作為陰性對(duì)照。

1.2.7 重復(fù)性及可靠性試驗(yàn)

選擇12份已知陰、陽(yáng)性的DNA樣品，用已建立的方法重復(fù)檢測(cè)3次，驗(yàn)證該方法的重復(fù)性；選擇陽(yáng)性PCR產(chǎn)物按照1.2.4步驟進(jìn)行克隆測(cè)序比對(duì)，驗(yàn)證該方法的可靠性。

1.3 淳安縣歐幼病流行病學(xué)調(diào)查

1.3.1 樣品處理

在采集的298群蜜蜂樣品中每群隨機(jī)取30只工蜂混合研磨，按照1.2.2步驟提取DNA。

1.3.2 病原檢測(cè)

以1.3.1提取的DNA為模板，用1.2建立的方法對(duì)待檢樣品進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。以ddH2O代替DNA模板作為陰性對(duì)照。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2007軟件統(tǒng)計(jì)298群中蜂樣品的蜂房球菌的感染情況，分析歐幼病在不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的陽(yáng)性檢出率。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測(cè)方法的建立

2.1.1 退火溫度的優(yōu)化結(jié)果

利用1.2.1設(shè)計(jì)的引物，以歐幼病陽(yáng)性樣品的DNA為模板，設(shè)置退火溫度為50～65℃，進(jìn)行PCR。結(jié)果（圖1）顯示，采用本研究建立的PCR方法可從歐幼病陽(yáng)性樣品DNA中擴(kuò)增出一條548 bp的特異目的條帶，其中，退火溫度從50℃到63.5℃均能擴(kuò)增出目的條帶。根據(jù)條帶的亮度及引物的特異性，本文選擇59℃作為歐幼病病原檢測(cè)的PCR退火溫度。

圖1 PCR的退火溫度優(yōu)化Fig.1 Optimization of annealing temperatures for PCR

2.1.2 重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

采用TA克隆方法（original T A cloning kit）將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，獲得重組質(zhì)粒，將其命名為pMD19-T/M.pluton。重組質(zhì)粒pMD19-T/M.pluton經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ酶切后，電泳檢測(cè)到2個(gè)條帶，大小分別在500～750和2 000～3 000 bp之間（圖2），與PCR目的片段和pMD19-T質(zhì)粒片段長(zhǎng)度一致，符合預(yù)期。然后對(duì)重組質(zhì)粒pMD19-T/M.pluton進(jìn)行測(cè)序和BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，用該方法獲得的目的片段與蜜蜂蜂房球菌DAT561菌株的16S rRNA基因序列（登錄號(hào)：AP018492.1）同源性為100%，說(shuō)明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，且利用已建立的PCR方法可特異性獲得預(yù)期產(chǎn)物。

2.1.3 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

利用NanoVue超微量分光光度計(jì)測(cè)定陽(yáng)性質(zhì)粒DNA質(zhì)量濃度為275 ng/μL，經(jīng)換算相當(dāng)于拷貝數(shù)7.77×1010μL－1。以不同稀釋倍數(shù)的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，結(jié)果表明，模板拷貝數(shù)從1到10號(hào)分別為108到10－1μL－1，均能擴(kuò)增出清晰、單一的目的條帶（圖3）。因此，所建立的PCR方法根據(jù)拷貝數(shù)計(jì)算最低檢測(cè)量為0.1 μL－1，對(duì)應(yīng)的模板濃度為3.44×10－10ng/μL。

圖2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Identification result of recombinant plasmid of pMD19-T/M.plutonby double restriction-enzymedigestion

圖3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Results of sensitivity test

2.1.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果

以不同細(xì)菌DNA為模板，應(yīng)用已建立的PCR方法進(jìn)行特異性檢測(cè)。結(jié)果顯示：該方法僅特異性擴(kuò)增出蜂房球菌，擴(kuò)增產(chǎn)物大小在500～700 bp之間（圖4），與預(yù)期一致。而以A.apis、N.apis、P.larvae的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均無(wú)條帶，說(shuō)明該方法可特異性檢測(cè)蜂房球菌。

2.1.5 重復(fù)性及可靠性驗(yàn)證結(jié)果

應(yīng)用已建立的PCR方法對(duì)感染蜂房球菌和未感染該細(xì)菌的蜜蜂樣品重復(fù)檢測(cè)3次，獲得的檢測(cè)結(jié)果一致，表明本文建立的歐幼病PCR檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性；對(duì)陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，經(jīng)BLAST分析發(fā)現(xiàn)，該陽(yáng)性產(chǎn)物與NCBI公布的17段序列的部分結(jié)構(gòu)蛋白的16S rRNA同源性均在99%以上，說(shuō)明該方法的可靠性高。

M：DL1000 DNA標(biāo)志物；1：蜜蜂子囊球菌；2：蜜蜂微孢子蟲(chóng)；3：幼蟲(chóng)芽孢桿菌；4：陰性對(duì)照（ddH2O）；5：蜂房球菌。M:DL1000 DNA marker;1:A.apis;2:N.apis;3:P.larvae;4:Negative control(ddH2O);5:M.pluton.

2.2 淳安縣歐幼病流行病學(xué)調(diào)查分析

2.2.1 檢測(cè)結(jié)果

利用本文建立的方法對(duì)淳安縣的298群工蜂樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，陽(yáng)性樣品的電泳條帶單一、清晰易辨（圖5）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，總共有75份陽(yáng)性樣品，測(cè)序驗(yàn)證表明，有目的條帶的樣品均呈蜂房球菌陽(yáng)性，說(shuō)明該方法可應(yīng)用于歐幼病病原檢測(cè)，且效果穩(wěn)定、可靠。

2.2.2 歐幼病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

對(duì)浙江省淳安縣17個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的34個(gè)飼養(yǎng)點(diǎn)進(jìn)行歐幼病流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果（表1）顯示：該地區(qū)中蜂蜂群內(nèi)蜂房球菌總檢出率為25.2%；在17個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)中，僅有6個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)未檢出蜂房球菌感染，說(shuō)明該地區(qū)約有64.7%的鄉(xiāng)鎮(zhèn)的中蜂攜帶有歐幼病病原；在11個(gè)存在蜂房球菌陽(yáng)性的鄉(xiāng)鎮(zhèn)中，有5個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)蜂房球菌檢出率≥40%，分別為金峰鄉(xiāng)、臨岐鎮(zhèn)、安陽(yáng)鄉(xiāng)、宋村鄉(xiāng)和威坪鎮(zhèn)。

圖5 部分樣品蜂房球菌的PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Test results of some samples of M.pluton by PCR

表1 中蜂樣品采集信息及蜂房球菌檢測(cè)結(jié)果Table 1 Information of collected samples and detection result of M.pluton

3 討論

由蜂房球菌引起的歐洲幼蟲(chóng)腐臭病因傳播迅速、發(fā)病快，容易感染中蜂且病情嚴(yán)重，給我國(guó)中蜂養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展帶來(lái)嚴(yán)重威脅。本研究建立的PCR檢測(cè)方法是基于蜂房球菌16S rRNA基因保守序列，并通過(guò)優(yōu)化PCR反應(yīng)條件而建立的。試驗(yàn)證實(shí)，該方法特異性強(qiáng)，靈敏度高（DNA檢出量最低為3.44×10－10ng/μL），對(duì)于進(jìn)一步精準(zhǔn)檢測(cè)蜜蜂蜂房球菌感染具有重要的指導(dǎo)意義。

歐幼病的爆發(fā)具有明顯的季節(jié)性[10]。在我國(guó)南方，每年有2個(gè)高發(fā)期，一個(gè)是3月初至4月中旬，另一個(gè)是8月中旬至10月初。如果秋末冬初氣溫下降不明顯，歐幼病秋季發(fā)病的時(shí)間可能會(huì)延長(zhǎng)[4]。本文選擇在秋末冬初時(shí)開(kāi)展淳安縣歐幼病的調(diào)查，明確致病菌——蜂房球菌在中蜂蜂群內(nèi)的攜帶情況，可為春繁時(shí)期病害防控措施的制定提供參考。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在淳安縣17個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)中有11個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的M.pluton感染呈陽(yáng)性，說(shuō)明歐幼病病原在該地區(qū)的中蜂中普遍存在。在采樣過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，金峰鄉(xiāng)和宋村鄉(xiāng)蜂場(chǎng)出現(xiàn)“花子”脾面、蟲(chóng)體腐爛帶酸臭味[11]等現(xiàn)象，這與歐幼病典型癥狀吻合，其他一些蜂群也有發(fā)病跡象但癥狀特點(diǎn)不明顯。由于此時(shí)正值蜜蜂病毒病中蜂囊狀幼蟲(chóng)病的高發(fā)時(shí)期，蜂群如果感染該病后會(huì)導(dǎo)致消化系統(tǒng)功能紊亂和免疫力降低，如果再遇到暖冬氣候，便為M.pluton提供了適宜的繁殖條件，將出現(xiàn)蜂群細(xì)菌與病毒混合感染的復(fù)雜病癥。因此，細(xì)菌病與病毒病混合感染的現(xiàn)象需引起重視，及早干預(yù)病害發(fā)展進(jìn)程，減少對(duì)蜂群健康發(fā)展的影響。

總之，本研究建立了中蜂歐幼病PCR檢測(cè)方法，靈敏性很高，且利用該方法明確了秋末冬初M.pluton在淳安縣的感染情況，為該地區(qū)制定歐幼病防治措施提供了數(shù)據(jù)支撐。但本研究?jī)H在一個(gè)時(shí)期對(duì)千島湖地區(qū)M.pluton感染做了流行病學(xué)調(diào)查，為了深入了解該地區(qū)歐幼病發(fā)病情況，有待進(jìn)一步對(duì)該病的病原進(jìn)行季節(jié)性動(dòng)態(tài)檢測(cè)。另外，在實(shí)際生產(chǎn)中，中蜂病害的爆發(fā)往往并非單一病原感染所致，所以加強(qiáng)多種病原混合感染的檢測(cè)，尤其是細(xì)菌與病毒混合感染的快速檢測(cè)方法有待開(kāi)發(fā)。