劉 濤,黃 元,陳錦良,向 華,肖少波,王曉虎,陳 晶,向 蓉,何繼軍,鄭海學
(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所 廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室 廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學觀測實驗站,廣州 510640;2.華中農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院、動物醫(yī)學院,武漢 430070;3.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所,蘭州 730070)
近年來,一種新型病毒正在席卷美國、加拿大、巴西、澳大利亞、新西蘭等地,豬感染后產(chǎn)生類似水泡樣病變,這種新型的病毒被命名為塞尼卡病毒A(SenecavirusA,SVA)[1]。2002年研究人員首次在人類胚胎成視網(wǎng)膜細胞培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)SVA,認為它可能是通過胎牛血清或豬胰蛋白酶引入培養(yǎng)物中的污染物[2]。SVA屬小RNA病毒科[3]。SVA具有非常強大的溶瘤特性,能夠選擇性感染并裂解腫瘤[4]。我國2015年檢測分離到首例SVA毒株CH-01-2015[5]。
口蹄疫(foot-and-mouth disease,F(xiàn)MD)是一種急性、熱性、高度接觸性傳染病,致病原為口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,F(xiàn)MDV)。FMD臨床表現(xiàn)為發(fā)熱,唇部、口腔粘膜、蹄部出現(xiàn)水泡性病變,傳播范圍廣,危害性大,被國際動物衛(wèi)生組織(OIE)列為18種A類動物傳染病之首。
SVA和FMDV同為小RNA病毒,感染癥狀相似,均表現(xiàn)為口鼻和蹄部出現(xiàn)囊泡樣癥狀,臨床診斷不易區(qū)分。本研究針對這2種病毒的基因序列合成特異性引物,建立了一種能同時檢測鑒別SVA和FMDV的雙重RT-PCR方法。
1.1 病毒與樣品FMDV由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所保存提供;SVA分離自廣東省某豬場發(fā)病豬水泡皮,在PK-15細胞上增殖;PK-15細胞和BHK-21細胞由廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所保存。10份樣品采集自廣東省某豬場。
1.2 主要試劑TaKaRa ExTaqDNA聚合酶、pMD19-T質(zhì)粒和DH5α感受態(tài)細胞購自寶生物工程(大連)有限公司;病毒RNA/DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質(zhì)粒小量快速抽提試劑盒購自美基生物科技有限公司;口蹄疫病毒通用型RT-PCR檢測試劑盒購自北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司。
1.3 引物合成針對FMDV UTR序列的口蹄疫通用引物[6],以及針對SVA VP1基因的引物[7](表1)由華大基因有限公司合成。
表1 雙重RT-PCR引物相關(guān)信息Table 1 Related information of double RT- PCR primers
1.4 引物驗證取A型FMDV、O型FMDV和SVA按照病毒RNA/DNA提取試劑盒說明書方法提取RNA,并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后以cDNA為模板進行單引物單模板PCR擴增。PCR擴增體系為25 μL:TaKaRa ExTaq聚合酶0.5 μL,上游引物和下游引物各0.5 μL,模板cDNA為0.5 μL,剩余用去離子水補足。PCR擴增條件:94℃預變性5 min;94℃變性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸1 min,30個循環(huán),72℃再延伸10 min,4℃保存。 PCR擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中進行點樣,90 V電泳25 min后,觀察擴增條帶。
1.5 陽性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建將FMDV和SVA擴增得到的目的PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒進行回收,并連接至pMD19-T載體,構(gòu)建分別含有上述2種病毒的5'UTR基因和VP1-2A基因片段的的陽性克隆質(zhì)粒。1.6 反應(yīng)體系優(yōu)化 將2種病毒的cDNA作為模板進行PCR擴增,反應(yīng)體系為25 μL:TaKaRa ExTaqDNA聚合酶0.5 μL、引物2 μL(每個引物0.5 μL)、模板1 μL、2種質(zhì)粒各0.5 μL,用去離子水補至25 μL。PCR擴增條件:94℃預變性5 min;94℃變性1 min,55℃ 退火1 min,72℃延伸1 min,30個循環(huán);72℃再延伸10 min,4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中進行點樣,90 V電泳25 min后,觀察擴增條帶。
將雙重RT-PCR體系中濃度為10 μmol/L的引物依次以0.25 μL增加,從0.25 μL加至1.25 μL,退火溫度范圍設(shè)置為53℃~58℃,篩選出雙重RT-PCR的最佳反應(yīng)條件。
1.7 特異性試驗采用優(yōu)化后的雙重RT-PCR擴增體系和擴增條件,對豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV)、豬細小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive respiratory syndrome virus,PRRSV)、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、H5N1型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)、豬瘟病毒(Swine fever virus,SFV)、豬水皰病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)、豬偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)、FMDV和SVA提取總核酸,作為模板進行雙重RT-PCR和PCR,同時設(shè)置陰性對照,檢測雙重RT-PCR的特異性。
1.8 敏感性試驗用紫外分光光度計檢測2種病毒的陽性克隆質(zhì)粒的濃度,并計算拷貝數(shù)。對陽性克隆質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋,使質(zhì)粒濃度為108~101copies/μL。分別取相同濃度的2種病毒質(zhì)?;旌献鳛槟0?,按照已經(jīng)優(yōu)化后的雙重RT-PCR反應(yīng)條件進行擴增,分析雙重RT-PCR反應(yīng)的敏感性。
1.9 樣品檢測結(jié)果的驗證將所有已檢組織病料樣品進行冰上研磨和抗生素處理后,分別接種PK15和BHK21細胞,盲傳10代。將所有病料及最終代次的細胞培養(yǎng)產(chǎn)物進行總核酸提取,用商品化試劑盒進行FMDV檢測,并按照文獻[7] 進行針對SVA的RTPCR檢測。根據(jù)文獻擴增SVA的VP1基因,回收陽性PCR產(chǎn)物并送往華大基因公司進行測序。
2.1 引物特異性驗證利用不同的引物對,對A型FMDV、O型FMDV和SVA進行單模板PCR檢測,以驗證引物的特異性。結(jié)果顯示引物特異性良好,以不同的cDNA作為模板,均能以對應(yīng)的引物擴增到相應(yīng)的目的片段(圖1)。
圖1 SVA、A型FMDV和O型FMDV單重RT-PCR結(jié)果Fig.1 PCR results of SVA and FMDV type A/O
2.2 擴增條件的優(yōu)化對FMDV和SVA的引物濃度和退火溫度進行了優(yōu)化。以各cDNA作為模板,雙重RT-PCR反應(yīng)體系中最佳引物終濃度分別為0.2 μmol/L(FMDV)、0.5 μmol/L(SVA)(圖2);最佳退火溫度為57℃(圖3)。最佳反應(yīng)條件:94℃預變性5min;94℃變性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸1 min,共進行30個循環(huán);最后72℃再延伸10 min,4℃保存。
圖2 FMDV和SVA不同引物終濃度雙重RT-PCR結(jié)果Fig.2 Double RT-PCR results for SVA and FMDV in different concentration of primers
圖3 不同退火溫度下SVA和FMDV的雙重RT-PCR結(jié)果Fig.3 Double RT-PCR results for FMDV and SVA at different annealing temperature
2.3 特異性結(jié)果分析利用優(yōu)化好的雙重RT-PCR反應(yīng)條件,對FMDV和SVA cDNA模板隨機混合并進行雙重PCR擴增,結(jié)果含有FMDV和SVA的核酸樣品均能擴增出目的條帶,且無其他非特異性條帶(圖4)。PRRSV、PPV、PRV、VSV、H5N1、HCV、PCV、PEDV核酸樣品進行雙重PCR擴增,結(jié)果均為陰性(圖5)。
圖4 SVA和FMDV雙重PCR擴增結(jié)果Fig.4 Double RT-PCR results of FMDV and SVA
2.4 敏感性結(jié)果分析在FMDV和SVA引物終濃度分別為0.2 μmol/L、0.5 μmol/L時,該雙重RTPCR能檢出的最低拷貝數(shù)分別為103copies/μL(FMDV)、104copies/μL(SVA)(圖6)。
圖6 SVA和FMDV雙重RT-PCR敏感性檢測Fig.6 The sensitivity of double RT-PCR for SVA and FMDV
2.5 樣品檢測結(jié)果應(yīng)用雙重RT-PCR方法對臨床送檢的10份樣品和細胞培養(yǎng)的病毒進行檢測,結(jié)果表明,F(xiàn)MDV和SVA細胞培養(yǎng)物檢測為陽性,有2份樣品檢測為SVA陽性,其余樣品均為陰性。
2.6 樣品檢測結(jié)果驗證雙重RT-PCR方法檢測為SVA陽性的病料,處理后接種PK15細胞,盲傳3~5代后均發(fā)生病變。將檢測為SVA陰性的病料接種BHK-21細胞,盲傳10代均未發(fā)生病變。所有病料和最終代次的細胞培養(yǎng)產(chǎn)物,分別進行FMDV和SVA的RT-PCR鑒定,結(jié)果均與本研究建立的雙重RT-PCR結(jié)果一致。SVA陽性病料VP1基因測序結(jié)果上傳至GenBank,登錄號分別為MG557660和MG557661。
從2008年開始,研究人員陸續(xù)在美國中西部地區(qū)和巴西部分地區(qū)豬場檢測到SVA[2]。SVA感染的臨床表現(xiàn)和口蹄疫極其相似:口腔粘膜、舌頭、蹄冠和鼻子充滿液體或破裂的囊泡;妊娠或分娩母豬厭食,無生殖障礙;仔豬體型肥胖,肌無力,食欲不振,嗜睡,唾液分泌過多,皮膚充血,腹瀉,并且伴有神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn),部分仔豬會突然死亡[8]。我國2015年首次在廣東省某豬場檢測到SVA,同年擴散至我國中部地區(qū)[9],1~4日齡的仔豬感染后死亡率可達30%~70%[5,10-12]。分析2015~2016年我國報道的塞尼卡病例后發(fā)現(xiàn),SVA能夠?qū)е履肛i的生產(chǎn)性能下降。SVA現(xiàn)已蔓延至廣東、福建、河南、湖北、江西等多個省份,引發(fā)的經(jīng)濟損失已經(jīng)不可估量[13]。
多重PCR(multiplex PCR)由Chambercian等于1988年提出[14-15],該技術(shù)以其效率高,成本低,速度快等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于基因組結(jié)構(gòu)與功能基因及數(shù)量性狀基因座的定位研究中[16]。雙重RT-PCR通過在同一個反應(yīng)體系中加入兩對不同的引物,能夠擴增出兩條特異性條帶。本研究建立的雙重RTPCR方法特異性和敏感性良好,能夠很好的區(qū)分出SVA和FMDV的不同核酸片段大小,對臨床檢測具有很高的應(yīng)用價值。
雙重RT-PCR結(jié)果可受到很多因素的影響,其中最重要的一點就是引物的設(shè)計。設(shè)計的兩種引物在目的基因上面無交叉擴增反應(yīng),不會形成引物二聚體,且目的片段大小相差200 bp以上。本研究利用FMDV 5'UTR序列基因進行引物設(shè)計,由于5'-UTR區(qū)域比較保守,對尚未傳入亞洲的SAT1/2/3型擴增效率較低,可適用于A、O、C和Asia I型FMDV的擴增檢測[6]。SVA則利用報道過的VP1序列合成引物。利用NCBI在線引物設(shè)計工具,使兩對引物的Tm值控制在同一溫度附近,保證核酸擴增的效率。
已知FMDV共存在7種血清型,其中O型和A型分別于2010年和2013年在廣東省暴發(fā),并在全國多個省份流行,是當前FMDV在我國流行的主要血清型。FMDV與SVA無論是臨床表現(xiàn)還是分子結(jié)構(gòu)都具有高度相似性,對于這兩種病毒進行有效的臨床鑒別診斷,在防控中具有重要的意義。本研究建立的雙重RT-PCR檢測方法能夠快速有效的檢測出SVA和FMDV,為兩種病毒的鑒別診斷提供了重要工具。