塞尼卡病毒與口蹄疫病毒雙重RT-PCR鑒別檢測方法的建立

劉 濤，黃 元，陳錦良，向 華，肖少波，王曉虎，陳 晶，向 蓉，何繼軍，鄭海學

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所 廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室 廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學觀測實驗站，廣州 510640；2.華中農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院、動物醫(yī)學院，武漢 430070；3.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州 730070）

近年來，一種新型病毒正在席卷美國、加拿大、巴西、澳大利亞、新西蘭等地，豬感染后產(chǎn)生類似水泡樣病變，這種新型的病毒被命名為塞尼卡病毒A（SenecavirusA，SVA）[1]。2002年研究人員首次在人類胚胎成視網(wǎng)膜細胞培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)SVA，認為它可能是通過胎牛血清或豬胰蛋白酶引入培養(yǎng)物中的污染物[2]。SVA屬小RNA病毒科[3]。SVA具有非常強大的溶瘤特性，能夠選擇性感染并裂解腫瘤[4]。我國2015年檢測分離到首例SVA毒株CH-01-2015[5]。

口蹄疫（foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，致病原為口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）。FMD臨床表現(xiàn)為發(fā)熱，唇部、口腔粘膜、蹄部出現(xiàn)水泡性病變，傳播范圍廣，危害性大，被國際動物衛(wèi)生組織（OIE）列為18種A類動物傳染病之首。

SVA和FMDV同為小RNA病毒，感染癥狀相似，均表現(xiàn)為口鼻和蹄部出現(xiàn)囊泡樣癥狀，臨床診斷不易區(qū)分。本研究針對這2種病毒的基因序列合成特異性引物，建立了一種能同時檢測鑒別SVA和FMDV的雙重RT-PCR方法。

1 材料與方法

1.1 病毒與樣品FMDV由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所保存提供；SVA分離自廣東省某豬場發(fā)病豬水泡皮，在PK-15細胞上增殖；PK-15細胞和BHK-21細胞由廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所保存。10份樣品采集自廣東省某豬場。

1.2 主要試劑TaKaRa ExTaqDNA聚合酶、pMD19-T質(zhì)粒和DH5α感受態(tài)細胞購自寶生物工程（大連）有限公司；病毒RNA/DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質(zhì)粒小量快速抽提試劑盒購自美基生物科技有限公司；口蹄疫病毒通用型RT-PCR檢測試劑盒購自北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司。

1.3 引物合成針對FMDV UTR序列的口蹄疫通用引物[6]，以及針對SVA VP1基因的引物[7]（表1）由華大基因有限公司合成。

表1 雙重RT-PCR引物相關(guān)信息Table 1 Related information of double RT- PCR primers

1.4 引物驗證取A型FMDV、O型FMDV和SVA按照病毒RNA/DNA提取試劑盒說明書方法提取RNA，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板進行單引物單模板PCR擴增。PCR擴增體系為25 μL：TaKaRa ExTaq聚合酶0.5 μL，上游引物和下游引物各0.5 μL，模板cDNA為0.5 μL，剩余用去離子水補足。PCR擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環(huán)，72℃再延伸10 min，4℃保存。 PCR擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中進行點樣，90 V電泳25 min后，觀察擴增條帶。

1.5 陽性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建將FMDV和SVA擴增得到的目的PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒進行回收，并連接至pMD19-T載體，構(gòu)建分別含有上述2種病毒的5'UTR基因和VP1-2A基因片段的的陽性克隆質(zhì)粒。1.6 反應(yīng)體系優(yōu)化 將2種病毒的cDNA作為模板進行PCR擴增，反應(yīng)體系為25 μL：TaKaRa ExTaqDNA聚合酶0.5 μL、引物2 μL（每個引物0.5 μL）、模板1 μL、2種質(zhì)粒各0.5 μL，用去離子水補至25 μL。PCR擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，55℃ 退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃再延伸10 min，4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中進行點樣，90 V電泳25 min后，觀察擴增條帶。

將雙重RT-PCR體系中濃度為10 μmol/L的引物依次以0.25 μL增加，從0.25 μL加至1.25 μL，退火溫度范圍設(shè)置為53℃～58℃，篩選出雙重RT-PCR的最佳反應(yīng)條件。

1.7 特異性試驗采用優(yōu)化后的雙重RT-PCR擴增體系和擴增條件，對豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）、豬細小病毒（Porcine parvovirus，PPV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、H5N1型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）、豬瘟病毒（Swine fever virus，SFV）、豬水皰病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）、豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）、FMDV和SVA提取總核酸，作為模板進行雙重RT-PCR和PCR，同時設(shè)置陰性對照，檢測雙重RT-PCR的特異性。

1.8 敏感性試驗用紫外分光光度計檢測2種病毒的陽性克隆質(zhì)粒的濃度，并計算拷貝數(shù)。對陽性克隆質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋，使質(zhì)粒濃度為108～101copies/μL。分別取相同濃度的2種病毒質(zhì)?；旌献鳛槟０?，按照已經(jīng)優(yōu)化后的雙重RT-PCR反應(yīng)條件進行擴增，分析雙重RT-PCR反應(yīng)的敏感性。

1.9 樣品檢測結(jié)果的驗證將所有已檢組織病料樣品進行冰上研磨和抗生素處理后，分別接種PK15和BHK21細胞，盲傳10代。將所有病料及最終代次的細胞培養(yǎng)產(chǎn)物進行總核酸提取，用商品化試劑盒進行FMDV檢測，并按照文獻[7] 進行針對SVA的RTPCR檢測。根據(jù)文獻擴增SVA的VP1基因，回收陽性PCR產(chǎn)物并送往華大基因公司進行測序。

2 結(jié)果

2.1 引物特異性驗證利用不同的引物對，對A型FMDV、O型FMDV和SVA進行單模板PCR檢測，以驗證引物的特異性。結(jié)果顯示引物特異性良好，以不同的cDNA作為模板，均能以對應(yīng)的引物擴增到相應(yīng)的目的片段（圖1）。

圖1 SVA、A型FMDV和O型FMDV單重RT-PCR結(jié)果Fig.1 PCR results of SVA and FMDV type A/O

2.2 擴增條件的優(yōu)化對FMDV和SVA的引物濃度和退火溫度進行了優(yōu)化。以各cDNA作為模板，雙重RT-PCR反應(yīng)體系中最佳引物終濃度分別為0.2 μmol/L（FMDV）、0.5 μmol/L（SVA）（圖2）；最佳退火溫度為57℃（圖3）。最佳反應(yīng)條件：94℃預變性5min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共進行30個循環(huán)；最后72℃再延伸10 min，4℃保存。

圖2 FMDV和SVA不同引物終濃度雙重RT-PCR結(jié)果Fig.2 Double RT-PCR results for SVA and FMDV in different concentration of primers

圖3 不同退火溫度下SVA和FMDV的雙重RT-PCR結(jié)果Fig.3 Double RT-PCR results for FMDV and SVA at different annealing temperature

2.3 特異性結(jié)果分析利用優(yōu)化好的雙重RT-PCR反應(yīng)條件，對FMDV和SVA cDNA模板隨機混合并進行雙重PCR擴增，結(jié)果含有FMDV和SVA的核酸樣品均能擴增出目的條帶，且無其他非特異性條帶（圖4）。PRRSV、PPV、PRV、VSV、H5N1、HCV、PCV、PEDV核酸樣品進行雙重PCR擴增，結(jié)果均為陰性（圖5）。

圖4 SVA和FMDV雙重PCR擴增結(jié)果Fig.4 Double RT-PCR results of FMDV and SVA

2.4 敏感性結(jié)果分析在FMDV和SVA引物終濃度分別為0.2 μmol/L、0.5 μmol/L時，該雙重RTPCR能檢出的最低拷貝數(shù)分別為103copies/μL（FMDV）、104copies/μL（SVA）（圖6）。

圖6 SVA和FMDV雙重RT-PCR敏感性檢測Fig.6 The sensitivity of double RT-PCR for SVA and FMDV

2.5 樣品檢測結(jié)果應(yīng)用雙重RT-PCR方法對臨床送檢的10份樣品和細胞培養(yǎng)的病毒進行檢測，結(jié)果表明，F(xiàn)MDV和SVA細胞培養(yǎng)物檢測為陽性，有2份樣品檢測為SVA陽性，其余樣品均為陰性。

2.6 樣品檢測結(jié)果驗證雙重RT-PCR方法檢測為SVA陽性的病料，處理后接種PK15細胞，盲傳3～5代后均發(fā)生病變。將檢測為SVA陰性的病料接種BHK-21細胞，盲傳10代均未發(fā)生病變。所有病料和最終代次的細胞培養(yǎng)產(chǎn)物，分別進行FMDV和SVA的RT-PCR鑒定，結(jié)果均與本研究建立的雙重RT-PCR結(jié)果一致。SVA陽性病料VP1基因測序結(jié)果上傳至GenBank，登錄號分別為MG557660和MG557661。

3 討論

從2008年開始，研究人員陸續(xù)在美國中西部地區(qū)和巴西部分地區(qū)豬場檢測到SVA[2]。SVA感染的臨床表現(xiàn)和口蹄疫極其相似：口腔粘膜、舌頭、蹄冠和鼻子充滿液體或破裂的囊泡；妊娠或分娩母豬厭食，無生殖障礙；仔豬體型肥胖，肌無力，食欲不振，嗜睡，唾液分泌過多，皮膚充血，腹瀉，并且伴有神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)，部分仔豬會突然死亡[8]。我國2015年首次在廣東省某豬場檢測到SVA，同年擴散至我國中部地區(qū)[9]，1～4日齡的仔豬感染后死亡率可達30%～70%[5,10-12]。分析2015～2016年我國報道的塞尼卡病例后發(fā)現(xiàn)，SVA能夠?qū)е履肛i的生產(chǎn)性能下降。SVA現(xiàn)已蔓延至廣東、福建、河南、湖北、江西等多個省份，引發(fā)的經(jīng)濟損失已經(jīng)不可估量[13]。

多重PCR（multiplex PCR）由Chambercian等于1988年提出[14-15]，該技術(shù)以其效率高，成本低，速度快等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于基因組結(jié)構(gòu)與功能基因及數(shù)量性狀基因座的定位研究中[16]。雙重RT-PCR通過在同一個反應(yīng)體系中加入兩對不同的引物，能夠擴增出兩條特異性條帶。本研究建立的雙重RTPCR方法特異性和敏感性良好，能夠很好的區(qū)分出SVA和FMDV的不同核酸片段大小，對臨床檢測具有很高的應(yīng)用價值。

雙重RT-PCR結(jié)果可受到很多因素的影響，其中最重要的一點就是引物的設(shè)計。設(shè)計的兩種引物在目的基因上面無交叉擴增反應(yīng)，不會形成引物二聚體，且目的片段大小相差200 bp以上。本研究利用FMDV 5'UTR序列基因進行引物設(shè)計，由于5'-UTR區(qū)域比較保守，對尚未傳入亞洲的SAT1/2/3型擴增效率較低，可適用于A、O、C和Asia I型FMDV的擴增檢測[6]。SVA則利用報道過的VP1序列合成引物。利用NCBI在線引物設(shè)計工具，使兩對引物的Tm值控制在同一溫度附近，保證核酸擴增的效率。

已知FMDV共存在7種血清型，其中O型和A型分別于2010年和2013年在廣東省暴發(fā)，并在全國多個省份流行，是當前FMDV在我國流行的主要血清型。FMDV與SVA無論是臨床表現(xiàn)還是分子結(jié)構(gòu)都具有高度相似性，對于這兩種病毒進行有效的臨床鑒別診斷，在防控中具有重要的意義。本研究建立的雙重RT-PCR檢測方法能夠快速有效的檢測出SVA和FMDV，為兩種病毒的鑒別診斷提供了重要工具。