巖陀ITS2片段PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化及物種鑒別研究

方強(qiáng)強(qiáng) 王燕

摘要：以巖陀植物葉片為材料，利用試劑盒提取方法提取植物葉片中的DNA，對ITS2序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化并對ITS2序列鑒別物種能力進(jìn)行考察;通過單因素實驗分別研究退火溫度、DNA模板量、循環(huán)次數(shù)等因素對巖陀DNA條形碼鑒別中所選的ITS2序列擴(kuò)增反應(yīng)的影響，并對擴(kuò)增體系進(jìn)行優(yōu)化，采用Seqman7.1軟件對測序峰圖進(jìn)行校對拼接，應(yīng)用MEGA計算種內(nèi)種間遺傳距離，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹;結(jié)果表明：優(yōu)化后的PC R擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為25μL， 含TaqPCR Master Mix 12.5μL、DNA模板量5ng、上下游引物（10mol/L）各1μL、ddH2O9.5μL，ITS2序列在退火溫度設(shè)置為60℃，循環(huán)次數(shù)為30次的條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得清晰單一的電泳條帶，ITS2測序成功率100%，比對后的序列長度475bp，GC含量約50%、種內(nèi)種間變異存在重疊，沒有明顯的Barcoding gap;結(jié)論：通過試劑盒提取巖陀植物葉片DNA，在優(yōu)化后的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系對ITS2序列進(jìn)行擴(kuò)增，可以滿足后續(xù)對鬼燈檠屬多基原植物巖陀的親緣關(guān)系、物種鑒別和遺傳多樣性等領(lǐng)域的研究，但I(xiàn)TS2序列不適合巖陀種DNA條形碼鑒別。

關(guān)鍵詞：巖陀;DNA提取;核糖體ITS2;PCR擴(kuò)增條件;側(cè)序;分子鑒別

巖陀來源于虎耳科鬼燈擎屬植物西南鬼燈檠（Rodegersia sambucifolia Hems1）或羽葉鬼燈檠（Rodegersia pinnata Franch）干燥根莖Ill，為苗族、白族、傈僳族等民族常用藥材，分布于我國云南、貴州、四川、陜西、甘肅、寧夏、河南、湖北、西藏等省區(qū)，而云南省資源最為豐富，3種鬼燈檠：西南鬼燈檠（Rodegersiasambucifolia Hemsl.）、七葉鬼燈檠（Rodegersia aes-culigolia Batalin）、羽葉鬼燈檠（Rodegersia pinnataFranch）均有分布。因其具有清熱解毒、收斂、消炎、祛風(fēng)除濕等功效[2]，對腸炎、菌痢、風(fēng)濕骨痛、外傷出血、老年性支氣管炎等常見疾病有較好療效而得以廣泛使用[3]。但由于多基原民族藥巖陀利用傳統(tǒng)方法很難鑒別，3種鬼燈檠來源的巖陀藥材混淆使用，用藥安全難以保證。因此，為了保證中藥臨床用藥的安全有效可控，利用生物學(xué)方法（DNA條形碼技術(shù)）構(gòu)建巖陀DNA條形碼識別系統(tǒng)很有必要，而建立DNA條形碼系統(tǒng)的前提條件為DNA提取及PCR擴(kuò)增條件的選擇與優(yōu)化。DNA條形碼技術(shù)是一項新的分子鑒別技術(shù)，擺脫傳統(tǒng)鑒別方法中需要豐富的物種鑒別知識的束縛，而且還可以構(gòu)建相應(yīng)數(shù)據(jù)庫，實現(xiàn)物種快速準(zhǔn)確鑒別[4]。因此，本研究中選用植物DNA條形碼鑒別中常用序列ITS2，進(jìn)行物種鑒別能力考查，以期為其它藥用植物在種屬鑒別方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：植物組織研磨儀、Ohaus corporation CP114型電子天平、SIGMA1-14ED臺式離心機(jī)、VOR-TEX-kylin-Bell型旋渦震蕩儀，DYCP-31DN型電泳儀、Bio-Rad SmartSpec Plus蛋白質(zhì)核酸定量檢測儀、Bio-Rad My Cycler型PCR擴(kuò)增儀。

試劑：乙二胺四乙酸二鈉（Ethylene diamine te-traacetic acid，EDTA）、Tris（北京索萊寶）、溴化乙錠（Ethidium Bromide，EB）、6×DNA Loading buffer（北京索萊寶）;瓊脂糖（Agarose LE）、DNA quick Plant System（非離心柱型）、Taq PCR Master Mix（2x，red dye）、DNAMarker[均購自北京天根生化科技有限公司;硼酸、異丙醇、氯仿、氫氧化鈉、無水乙醇、氯化鈉等為國產(chǎn)分析純。

1.2 材料采集與處理

實驗研究所用鬼燈檠屬的3個品種的巖陀植物由課題組成員2018年7月采自云南省大理蒼山。樣品由大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院生藥教研室張德全博士鑒定完成，憑證植物標(biāo)本存放于大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院王燕課題組，樣品采集信息表見表1。

1.3 DNA的提取

采用試劑盒法，取經(jīng)硅膠干燥處理后的巖陀植物葉片約20mg于離心管，加入400μLFP1和6KLRNase，旋渦振蕩1min，室溫放置10min：后加入130μL緩沖液FP2，混勻旋渦振蕩1min，12000rpm離心5min，取上清液于新的離心管中，重復(fù)操作1次;向上清液加入0.7倍體積的異丙醇，充分混勻12000rpm離心2min，棄上清液;加入600μL70%乙醇，旋渦振蕩5s，12000rpm離心2min，棄上清液，重復(fù)操作1次;開蓋倒置5～10min，加入50μL緩沖液TE，充分混勻使其溶解，-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 DNA純度的檢測

將提取的DNA溶液適當(dāng)稀釋后，采用核酸蛋白成像儀進(jìn)行純度檢測，記錄A₂₆₀和A₂₈₀吸光光度值，以A₂₆₀/A₂₈₀的比值鑒定純度。采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，0.5*TBE buffer（54g Tris，27.58硼酸，20mL 0.5mol/LEDTA（pH值8.0》，瓊脂糖凝膠成像儀觀察并拍照。

1.5 ITS2序列擴(kuò)增反應(yīng)和程序

PCR擴(kuò)增在Bio-Rad MyCler型PC R擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，引物參考陳士林[4]課題組設(shè)計的序列，由生工生物工程（上海）公司合成。引物序列為：ITS2F ATGC-GATACTTGGTGTGAAT;ITS3R GACGCTTCTCCA-GACTACAAT。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中的Taq PCR Master Mix采購自北京天根，加入量按產(chǎn)品說明為準(zhǔn);引物濃度10μM;樣品DNA模板加入量1 μL（1-10[，g/mL）。初始反應(yīng)程序為：第1階段：預(yù)變性，94℃，4min;1個循環(huán);第2階段：變性，94℃，30s;退火，45～68℃，30s;延伸，72℃，45s：30～35個循環(huán);第3階段：72℃10min，1個循環(huán)，終止反應(yīng)，4℃保存。

1.6 ITS2測序及物種鑒別

PCR擴(kuò)增的序列送至華大基因科技（武漢）有限公司進(jìn)行雙向測序。利用seqman7.1去除序列低質(zhì)量區(qū)和引物區(qū)并對測序峰圖進(jìn)行校正拼接，利用軟件MEGA7.0計算種內(nèi)種間遺傳距離值并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，利用Taxon DNA軟件對種內(nèi)種間遺傳距離分布進(jìn)行概率統(tǒng)計，并繪制Barcoding gap圖，比較種內(nèi)種間遺傳差異，對ITS2序列鑒別能力進(jìn)行評估。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取

試劑盒提取結(jié)果如圖1，試劑盒提取的總DNA條帶明亮，但由于試劑盒本身的原因，總DNA條帶中部分條帶存在彌散和點(diǎn)樣孔有亮斑的現(xiàn)象，可能存在少量蛋白質(zhì)、糖類、酚及RNA等雜質(zhì)沒有去除干凈，植物總DNA提取過程中總DNA中存在少量雜質(zhì)的污染，不會對后續(xù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生影響。條帶存在但采用試劑盒提取方法提取DNA方便快捷，課題組在利用不同方法提取DNA的過程中發(fā)現(xiàn)，利用試劑盒提取方法對經(jīng)硅膠干燥葉片的提取DNA效果較佳。故本試驗采用試劑盒提取樣品DNA。

2.2 ITS2序列PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化

2.2.1 退火溫度的優(yōu)化。退火溫度是影響PCR特異性的重要因素，變性后溫度快速冷卻至40～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)率會遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞[5]。不同的引物有著不同的退火溫度，而退火溫度的選擇取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度（對于序列數(shù)在20bp，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度最為理想。引物理論退火溫度Tm=4（G+C）+2（A+T）[6]。實際退火溫度要根據(jù)具體樣品的不同擇優(yōu)選擇，實驗設(shè)定44℃、46℃、48℃、50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃等10個梯度的退火溫度，10種退火溫度以篩選最合適的退火溫度結(jié)果見圖2。當(dāng)退火溫度在44～62℃之間均能有效擴(kuò)增且條帶明亮，3～10號條帶非特異性擴(kuò)增較明顯。隨著退火溫度升高至60℃，PCR反應(yīng)特異性略有提高。退火溫度高于60℃時，擴(kuò)增效率無明顯改變，但擴(kuò)增特異性有所下降，ITS2序列擴(kuò)增退火溫度選擇60℃比較合適。在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的退火溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。退火時間一般為30～60s，足以使引物與模板之間完全結(jié)合[6]。后續(xù)條件優(yōu)化均在該優(yōu)化退火溫度基礎(chǔ)上完成。

2.2.2 DNA擴(kuò)增模板量的選擇。DNA擴(kuò)增所加入的模板量也是影響PCR擴(kuò)增的重要因素，模板量少影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度，模板量多又會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。因此，為了獲得最佳擴(kuò)增條帶，考察模板加入量很有必要。實驗樣品選擇101號樣品，核酸濃度檢測該樣品A₂₆₀=0.164，A₂₆₀/₂₈₀=1.85，樣品提取濃度為45.8592μg/mL，在25μL的反應(yīng)體系中設(shè)定8個DNA模板用量梯度，加入模板DNA量分別為0.05ng/25μL、0.2ng/25μL、0.4ng/25μL、2ng/25 μL、5ng/25μL、20ng/25μL、40ng/25μL、70ng/25μL。不同模板加入量得到的擴(kuò)增結(jié)果如圖3，模板原液加入量在5～40ng的范圍內(nèi)DNA條帶明亮，考慮節(jié)約模板量與實驗的操作的準(zhǔn)確性，選擇每25μL反應(yīng)體系加入模板量為5ng較為合適。

2.2.3 擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。確定合適的退火溫度和DNA模板加入量后，選擇合適的循環(huán)次數(shù)可以降低非特異擴(kuò)增量。實驗設(shè)定6個循環(huán)次數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增DNA擴(kuò)增結(jié)果如圖4，表明PCR擴(kuò)增反應(yīng)第2階段30個循環(huán)較為合適，該條件同時滿足目標(biāo)產(chǎn)物的擴(kuò)增量和低非特異擴(kuò)增量。

2.2.4 優(yōu)化條件組合的PCR擴(kuò)增結(jié)果。以優(yōu)化條件組合對巖陀10個品種提取的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的結(jié)果在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，0.5*TBE buffer，溴化乙錠染色，瓊脂糖凝膠成像儀拍照觀察如圖5，在500bp處有一條明亮的條帶，表明優(yōu)化條件適合ITS2反應(yīng)要求。

2.2.5 ITS2片段的PCR產(chǎn)物則序及序列數(shù)據(jù)處理。10條ITS2序列，由華大基因科技（武漢）有限公司進(jìn)行雙向測序，測序成功率100%。測序所得峰圖采用Seq-man7.1.0進(jìn)行校對拼接，去除引物區(qū)和低質(zhì)量區(qū)，運(yùn)用MEGA7.0軟件對拼接后的序列進(jìn)行比對，基于Kimu-rat-Parameter雙參數(shù)模型和距離法中的（neigh-bor-joining，NJ）計算遺傳距離，構(gòu)建Barcoding gap圖和系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹中各分支相對支持率采用Bootstrap模式檢測，自展次數(shù)設(shè)置為1000，Gap/missingDate Treatment模式選擇complete deletion計算。

3 ITS2序列鑒別分析

3.1 ITS2序列特征

各樣本所得的ITS2序列經(jīng)MEGA比對后所得序列長度為475bp，GC含量50.84%，保守位點(diǎn)99.6%，變異位點(diǎn)0.2%，簡約信息位點(diǎn)0.2%，變異位點(diǎn)較低，利用ITS2序列作為種下鑒別較為困難。

3.2 ITS2序列種內(nèi)種間差異性分析

利用MEGA7.0軟件計算鬼燈檠屬巖陀種不同樣品之間的遺傳距離，K2P計算結(jié)果表明，種內(nèi)種間平均遺傳距離分別是0.00079和0.00099，種間遺傳距離分布于0～0.00213。種內(nèi)種間差異性分析見表2，理想的DNA條形碼應(yīng)該滿足：種間最小遺傳距離大于種內(nèi)最大遺傳距離，但表2數(shù)據(jù)結(jié)果表明最小種間遺傳距離的平均值為零。因此，ITS2種內(nèi)種間差異性分析并不能很好的表明ITS2對巖陀種間的鑒別能力。

3.3 ITS2序列Barcoding gap檢驗

MEGA7.0軟件計算樣品種內(nèi)種間遺傳距離值，采用Taxon DNA軟件對種內(nèi)種間遺傳距離概率分布進(jìn)行統(tǒng)計，并制作出ITS2序列的Barcoding gap圖，見圖6。如圖所示，ITS2序列的種內(nèi)種間變異重疊很大，沒有明顯的Barcodinggap。

3.4 ITS2序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育分析

3.4.1 ITS2堿基替換飽和性檢驗。系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建基于建樹序列是否達(dá)到飽和，針對已經(jīng)達(dá)到飽和的序列不太適合建樹，因此對ITS2序列建樹之前進(jìn)行堿基替換飽和性檢驗很有必要。ITS2序列序列飽和性檢驗值如表3所示，Iss.c（轉(zhuǎn)換值）遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Iss（替換值）且P值為0，說明ITS2堿基替換沒有達(dá)到飽和，適合遺傳發(fā)育樹的構(gòu)建。

3.4.2 NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。為了增大樣本量，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的序列除了課題組采集的10個樣品外，還從GeneBank下載了七葉鬼燈檠序列4個，西南鬼燈檠3個、羽葉鬼燈檠2個及1個梅花草屬梅花草基因作為外類群，GeneBank ID：MH045282.1、MH045359.1、MH045360.1、MH045366.1、MH045376.1、MH045377.1、MH045375.1、MH045341.1、MH045343.1、JF811095.1。采用NJ法對序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，判斷各樣品分支情況，結(jié)果見圖7，從基因庫下載的序列的9個序列及課題組代表性樣品序列均不能很好聚為一支，說明ITS2序列在巖陀種之間的鑒別并不理想，不適合作為巖陀種間的鑒別序列。

4 討論與小結(jié)

從核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想到聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的發(fā)明，歷經(jīng)10年之久，為分子生物學(xué)及其相關(guān)領(lǐng)域的研究提供了經(jīng)典的實驗方法。PCR擴(kuò)增反應(yīng)是特異的、高效的，任何一種因素控制不當(dāng)都會影響目標(biāo)產(chǎn)物的擴(kuò)增。針對不同的研究對象和儀器，均需要摸索其最佳反應(yīng)條件，這是利用分子生物學(xué)鑒別物種和遺傳多樣性研究的基礎(chǔ)。影響PCR擴(kuò)增反應(yīng)的因素有很多。首先，引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。在引物的設(shè)計過程中應(yīng)該注意到：①引物的長度不能過長，一般為20bp左右;②引物堿基中G+C含量以45%～55%[7]為宜，G+C含量太少擴(kuò)增效果不佳，G+C含量過多易出現(xiàn)非特異條帶。堿基A、T、G、C最好隨機(jī)分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶脫氧核苷酸的成串排列。其次，Taq DNA聚合酶的濃度，PCR擴(kuò)增反應(yīng)是DNA的體外擴(kuò)增，選擇合適的酶量對擴(kuò)增反應(yīng)能否順利進(jìn)行至關(guān)重要;再者，緩沖系統(tǒng)、dNTP的濃度、Mg²⁺的量的影響，選擇合適的濃度配比即是對Taq DNA聚合酶提供合適的反應(yīng)環(huán)境，也是對擴(kuò)增率的保障。最后，就是對模板濃度、溫度、循環(huán)周期的篩選。總之，在PCR特異性擴(kuò)增反應(yīng)中應(yīng)該保證目標(biāo)產(chǎn)物量的最大化。嚴(yán)格控制退火溫度，適當(dāng)提高退火溫度可以減少不匹配的雜交，從而提高特異性;減短退火時間及延伸時間可以減少錯誤引發(fā)及錯誤延伸;適當(dāng)降低引物及酶的濃度可以減少非特異性擴(kuò)增的發(fā)生;有效調(diào)整Mg²⁺濃度，降低Mg²⁺的濃度對Tap DNA聚合酶的活性有直接的影響;PCR擴(kuò)增產(chǎn)物要盡快完成電泳檢測，延時電泳檢測會出現(xiàn)電泳條帶不規(guī)則或消失的現(xiàn)象。

針對ITS2序列對巖陀種間鑒別能力研究，本研究采用種內(nèi)種間遺傳差異分析，Barcoding gap及系統(tǒng)發(fā)育3個方面的分析，均不能很好對巖陀3個種進(jìn)行鑒別。筆者通過閱讀大量文獻(xiàn)得出，ITS2在種水平鑒別率達(dá)到97.2%[8]，但作為巖陀種DNA條形碼鑒別不太適合。因此，課題組在今后巖陀種DNA條形碼鑒別研究中準(zhǔn)備采用葉綠體基因psbA-trnH、matK、rbcL序列及多片段組合的方法對巖陀種（西南鬼燈檠、七葉鬼燈擎、羽葉鬼燈檠）的3個物種進(jìn)行鑒別研究。另外，本研究中雖然未能利用ITS2序列對巖陀種進(jìn)行區(qū)分鑒別，但實驗中建立的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系希望能為其它DNA條形碼鑒別研究中PC R擴(kuò)增條件的探索提供借鑒和幫助。（收稿：2018-12-20）

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