灰色關(guān)聯(lián)度法研究紅蓼抗腫瘤的藥用部位研究＊

張紫嫣，包永睿,2,3，王 帥,2,3，李天嬌,2,3，劉金瑛，孟憲生,2,3＊＊

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 大連 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心 大連 116600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實驗室 大連 116600；4.北京中醫(yī)藥大學(xué) 北京 100029）

紅蓼（Polygonum orientale L.）系蓼科（Polygonaceae）蓼屬（Polygonum）一年生草本植物，廣布于中國各地。紅蓼的全草稱為葒草，具有祛風(fēng)除濕、清熱解毒的功效，臨床上用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，冠心病，心胃氣痛等癥[1-3]。2015版藥典中植物紅蓼用藥部位為其果實水紅花子。紅蓼的根莖稱為葒草根，具有清熱解毒，除濕通絡(luò)的功效，臨床上用于痢疾，水腫，風(fēng)濕痹病，跌打損傷等癥[4]；紅蓼的花序稱為葒草花，具有行氣活血，消積，止痛的功效，臨床上用于頭痛，心胃氣痛，腹中痞積等癥[5]；紅蓼的果實稱為水紅花子，具有散血消癥，消積止痛的功效，臨床上用癥瘕痞塊，癭瘤腫痛，食積不消等癥，也可用于治療胃癌、腸癌、肝癌、胃痛和肝炎等，對糖尿病也有效[6-8]。紅蓼全草、根、莖、花和果實均可入藥[1,4]，研究紅蓼的精準(zhǔn)藥用部位具有重要意義。

本研究采用HPLC法建立紅蓼不同藥用部位HPLC指紋圖譜，結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度分析研究紅蓼根、莖、葉、花和果中抗腫瘤發(fā)揮藥效的精準(zhǔn)用藥部位[9,10]，為其新藥開發(fā)及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器

胎牛血清（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國GIBCO公司）；二甲基亞砜（Sigma公司）；胰蛋白酶（美國GIBCO公司）；四甲基偶氮唑鹽（美國GIBCO公司）；甲醇（色譜純，德國Merck公司）；對照品花旗松素（成都曼思特生物科技有限公司，批號：A0082，供含量測定用）；槲皮素（中國藥品生物制品檢定所，批號：100081-200406，供含量測定用）；山萘酚（中國藥品生物制品檢定所，批號：0861-200002，供含量測定用）。

實驗用6批紅蓼于2018年7-10月采集自遼寧沈陽，所有樣品均為野生，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥植物教研室許亮教授鑒定為紅蓼（Polygonum orientale L.），每批藥材由30株紅蓼組成，并按照不同藥用部位分為根（G）莖（J）葉（Y）花（H）果（Z）五個混合樣品，所有樣品于50℃條件下烘干至恒定質(zhì)量，粉碎過2號篩，充分混勻，放入自封袋避光保存。人肝癌細(xì)胞株（HepG2）購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。

Aglient1290型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；HD2-BCN-1360B型生物潔凈工作臺（哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；SUNRISE型酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司）；-80℃超低溫冰箱（海爾公司）；NKSY系列恒溫水浴鍋（常州諾基儀器有限公司）；US AUTOFLOW型CO2培養(yǎng)箱（德國NUAIRE公司）；AE31型倒置相差顯微鏡（Motic公司）；CP225D電子分析天平（德國Sarto-rius分析天平有限公司，十萬分之一）；Milli-q超純水處理裝置（美國Millipore公司）。

1.2 供試品溶液和對照品溶液的制備

取不同藥用部位紅蓼藥材，粉碎（過2號篩），稱定10.00 g，置250 mL錐形瓶中，精密加入50%乙醇150 mL，稱定質(zhì)量，回流提取2 h，冷卻至室溫并補(bǔ)足減失質(zhì)量，濾過，揮干，用色譜級甲醇配成0.1 g·mL-1（生藥量）藥液，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

精密稱取花旗松素、槲皮素、山萘酚對照品適量，加色譜級甲醇制成質(zhì)量濃度為0.0050 g·L-1的對照品溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

1.3 高效液相色譜條件

Aglient1290型高效液相色譜儀，Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm x 250 mm，5 mm)；流動相（A）0.2%磷酸水-（B）甲醇，洗脫梯度（0 min-25 min）30%-68%B；（25 min-50 min）68%-83%；流速1 mL·min-1；檢測波長310 nm；柱溫設(shè)定為30℃；進(jìn)樣量2 μL。

1.4 不同藥用部位紅蓼指紋圖譜的建立

取同一批紅蓼藥材的同一藥用部位，以花旗松素色譜峰（S）為參照，考察方法的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性RSD值均≤3%，符合指紋圖譜方法學(xué)考察相關(guān)規(guī)定。

取6批紅蓼藥材的不同藥用部位，按1.2項下方法制備供試品溶液，按1.3項下色譜條件記錄色譜圖，將其導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012版），以S1樣品為參照圖譜，中位數(shù)法生成譜圖，選擇色譜分離度、對稱度較好，且能夠滿足定性、定量要求的色譜峰作為特征峰，Mark峰匹配法進(jìn)行自動匹配，生成紅蓼藥材高效液相指紋圖譜25個特征峰[11-13]。

1.5 不同藥用部位紅蓼體外抗肝腫瘤藥效

取培養(yǎng)2-3天、處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的肝癌細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，接種于96孔培養(yǎng)板。取不同藥用部位紅蓼及含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液混合配制成生藥量1 mg·mL-1的含藥培養(yǎng)液鋪入孔板繼續(xù)培養(yǎng)。藥物作用24 h后，棄去含藥培養(yǎng)液，每孔避光加20 μL（5 mg·mL-1）MTT和180 μL培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去含藥培養(yǎng)液加入150 μL DMSO，用酶標(biāo)儀在492 nm處掃描，測定吸光值（OD）[14,15]。根據(jù)公式

計算不同藥用部位紅蓼抑制率。

1.6 紅蓼體外抗肝腫瘤藥效與高效液相色譜灰色關(guān)聯(lián)度研究

應(yīng)用灰色系統(tǒng)理論建模軟件（GTMS3.0）將不同藥用部位紅蓼高效液相指紋圖譜25個特征峰的峰面積與不同藥用部位紅蓼體外抗腫瘤的抑制率進(jìn)行關(guān)聯(lián)度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜法建立指紋圖譜

根據(jù)1.4項下建立不同藥用部位紅蓼藥材對照指紋圖譜，得到25個高效液相特征峰，并按保留時間進(jìn)行對照品比對[15]。特征峰保留時間分別為[1]7.186、[2]12.915（花旗松素）、[3]13.682、[4]14.390、[5]16.943、[6]18.306、[7]19.692、[8]20.679、[9]21.557、[10]25.308（槲皮素）、[11]26.773、[12]29.427、[13]29.850、[14]30.673（山萘酚）、[15]31.673、[16]31.800、[17]34.355、[18]35.047、[19]36.184、[20]38.437、[21]39.812、[22]40.503、[23]41.306、[24]41.952、[25]43.397，相似度均 ＞ 0.9（圖1，2，表1）。

2.2 不同藥用部位紅蓼體外抗肝腫瘤藥效

根據(jù)1.5供試品溶液制備方法配制不同藥用部位紅蓼含藥培養(yǎng)液，對肝癌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，以抑制率為指標(biāo)，考察藥物干預(yù)24 h不同藥用部位紅蓼對肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用（表2）。

圖1 不同部位紅蓼藥材對照指紋圖譜

2.3 灰色關(guān)聯(lián)度結(jié)果

根據(jù)1.6并將不同藥用部位紅蓼高效液相指紋圖譜25個特征峰的峰面積與體外抗腫瘤抑制率的相關(guān)性按關(guān)聯(lián)系數(shù)排列，得出相關(guān)系數(shù)大于0.7的特征峰保留時間、化學(xué)成分及關(guān)聯(lián)系數(shù)結(jié)果（表3）。

3 討論

紅蓼具有抗腫瘤的作用，其全草、根、莖、花和果實均可入藥[1,4]，研究紅蓼的精準(zhǔn)藥用部位具有重要意義。本實驗采集6批紅蓼全株植物，按照藥用部位每批分為根、莖、葉、花和果共30個樣品，用灰色關(guān)聯(lián)度法將不同部位紅蓼高效液相對照指紋圖譜與體外抗肝癌抑制率關(guān)聯(lián)，關(guān)聯(lián)系數(shù)大于0.7的特征峰根據(jù)對照品比對，10號和14號峰分別為槲皮素和山萘酚，均是具有報道的抗肝癌化學(xué)成分，明確了紅蓼抗肝癌的物質(zhì)基礎(chǔ)。其中槲皮素是自然界廣泛存在的多醇羥基黃酮類化合物，具有明確的抗肝癌作用，機(jī)制可能與p53/miR-34a/SIRT1通路有關(guān)，近年來受學(xué)者廣泛關(guān)注[16]；山萘酚是一種多酚類抗氧化物，為天然黃酮類化合物的一種，已有文獻(xiàn)表明隨著山萘酚濃度增加和孵育時間延長導(dǎo)致肝癌細(xì)胞HepG2中凋亡因子Cleavedcaspase3的表達(dá)逐步增強(qiáng)，促使肝癌細(xì)胞HepG2凋亡[17]；根據(jù)本實驗室前期基礎(chǔ)，水紅花子中黃酮類成分可對肝癌SMMC-7721細(xì)胞具有明顯的抑制作用，且抑制作用和時間劑量成線性關(guān)系，其作用機(jī)制為抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)該細(xì)胞的凋亡[3,11]，皆可說明槲皮素和山萘酚均與肝癌的發(fā)生發(fā)展有相關(guān)性，該實驗證明槲皮素和山萘酚是紅蓼抗肝癌的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖2 紅蓼對照品比對圖譜

表1 不同部位紅蓼藥材對照指紋圖譜相似度評價

根據(jù)圖2不同部位紅蓼藥材高效液相對照指紋圖譜和表1不同部位紅蓼藥材對照指紋圖譜相似度評價可看出根莖成分相似，但根莖，葉，花和果之間差距較大；根據(jù)表2不同藥用部位紅蓼對肝癌的抑制率考察結(jié)果，可看出紅蓼抗肝癌藥效的相似；實驗結(jié)果表明，紅蓼根莖葉花果成分差異較大，但藥效結(jié)果相似，對藥效貢獻(xiàn)較大的色譜峰為紅蓼不同藥效部位的共有峰高度相似，這提示共有峰為紅蓼抗肝癌的作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，其非公有峰有可能為紅蓼發(fā)揮其他藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，為今后精準(zhǔn)治療提供實驗依據(jù)。

表2 不同藥用部位紅蓼對肝癌的抑制作用結(jié)果s,n=5

表2 不同藥用部位紅蓼對肝癌的抑制作用結(jié)果s,n=5

注：與空白組比較*P＜0.05。

1 2 3 4 5 6空白0.658±0.036-平均抑制率/%-根（G）32.23莖（J）34.55 38.48葉（Y）花（H）44.39果（Z）OD值抑制率OD值抑制率OD值抑制率OD值抑制率OD值抑制率OD值抑制率0.442±0.023*32.86%0.427±0.034*35.13%0.407±0.047*38.13%0.368±0.039*44.10%0.382±0.033*41.99%0.437±0.065*33.69%0.432±0.066*34.37%0.395±0.057*39.97%0.353±0.054*46.45%0.397±0.062*39.70%0.459±0.046*30.33%0.433±0.021*34.23%0.406±0.051*38.37%0.369±0.061*44.00%0.376±0.029*42.92%0.442±0.033*32.80%0.436±0.039*33.79%0.415±0.045*37.02%0.357±0.062*45.77%0.391±0.044*40.57%0.445±0.057*32.45%0.431±0.069*34.59%0.399±0.022*39.39%0.386±0.032*41.44%0.375±0.047*42.99%0.453±0.045*31.22%0.427±0.044*35.17%0.408±0.048*38.00%0.365±0.022*44.57%0.372±0.036*43.42%42.27

表3 關(guān)聯(lián)度計算結(jié)果及關(guān)鍵峰峰號

紅蓼全國分布廣泛，廉價易得，其中的山萘酚和槲皮素對肝癌藥效顯著，如作為精準(zhǔn)治療肝癌藥物投入生產(chǎn)，將對治療癌癥做出巨大貢獻(xiàn)。同時該研究可以為其他中藥精準(zhǔn)治療及明確物質(zhì)基礎(chǔ)提供方法和借鑒。