高效液相色譜法測(cè)定不同品種來源陳皮中多甲氧基黃酮含量*

李文東 ，魏 瑩 ，趙玉璽 ，張世鵬 ，劉 福 ，楊 蘭 △

（1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，四川 南充 637000； 2.川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥物研究所，四川 南充 637000）

陳皮來源于蕓香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培變種的干燥成熟果皮，藥材分為陳皮和廣陳皮，具有理氣健脾、燥濕化痰功效[1]，主產(chǎn)于廣東、福建、四川、浙江、江西。陳皮主要含黃酮類、揮發(fā)油類和生物堿類等活性成分[2-4]。其中黃酮類有黃酮苷類（如橙皮苷）和多甲氧基黃酮類（如川陳皮素[5]和桔皮素[6]）?，F(xiàn)代研究表明，多甲氧基黃酮類成分（川陳皮素、桔皮素）有平喘、抗癌、抗真菌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、治療神經(jīng)退行性疾病[7-11]等藥理作用。中藥陳皮的質(zhì)量主要決定于其活性成分的含量，此外，中藥材質(zhì)量還與產(chǎn)地、品種和采收期等因素相關(guān)[3，6，12]。不同產(chǎn)地、不同采收季節(jié)和基源陳皮中橙皮苷成分含量存在顯著差異[13-14]。為此，本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定不同產(chǎn)地、不同品種來源陳皮中多甲氧基黃酮的含量，為評(píng)價(jià)陳皮藥材的質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1200型高效液相色譜儀（包括四元泵、在線脫氣機(jī)、紫外檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司）；Sartoris BT224S型電子天平（萬分之一，賽多利斯科學(xué)儀器公司）；Mettle AE240型電子天平（十萬分之一，梅特勒公司）。

1.2 試藥

川陳皮素和桔皮素對(duì)照品（自制，1H-NMR、13CNMR，ESI-MS鑒定，含量采用HPLC峰面積歸一化法計(jì)算且不低于98%）；甲醇（色譜級(jí)，賽默飛世爾科技有限公司，批號(hào)為152836），水為純化水（Millipore水純化儀，自制）；其他試劑均為分析純。不同品種來源陳皮均由川北醫(yī)學(xué)院生藥教研室楊蘭講師鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（B）-水（A），二元梯度洗脫（0～6min、60%B，6 ～18 min、60%B→100%B）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：326 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

稱取減壓干燥至恒重的川陳皮素對(duì)照品和桔皮素對(duì)照品適量，精密稱定，置同一10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得含川陳皮素19.408 μg/mL和桔皮素9.968 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。取樣品粗粉約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇80 mL，稱定質(zhì)量，水浴加熱回流1.5 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取混合對(duì)照品溶液（含川陳皮素135.201 μg/mL 和桔皮素 71.432 μg/mL）適量，按比例稀釋 2，5，10，35，50 倍，即得系列對(duì)照品溶液。按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量（X，ng）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得川陳皮素、桔皮素回歸方程分別為Y川=2.608X川-10.210（r=0.999 9），Y桔=3.816X桔-7.206（r=0.999 6）。結(jié)果表明，川陳皮素和桔皮素進(jìn)樣量分別在27.04～1 352.01 ng和14.286～714.320 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果川陳皮素、桔皮素峰面積的RSD分別為1.95%和1.74%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液（12號(hào)廣東新會(huì)），按擬訂色譜條件分別在 0，2，4，8，12，24h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果川陳皮素、桔皮素峰面積的RSD分別為1.73%和1.51%（n=6），表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取同一批樣品（12號(hào)廣東新會(huì)），按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果川陳皮素、桔皮素含量的RSD分別為1.16%和2.64%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量（川陳皮素為0.176%，桔皮素為0.095%）的12號(hào)陳皮樣品，共6份，精密稱定，每份約0.5 g，分別精密加入混合對(duì)照品溶液（川陳皮素和桔皮素的質(zhì)量濃度分別為0.176 5，0.095 3 g/L）各5 mL，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定

按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定陳皮中川陳皮素和桔皮素的含量。結(jié)果見表2。

表2 不同來源陳皮中川陳皮素和桔皮素的含量（n=3）

3 討論

檢測(cè)波長(zhǎng)選擇：取川陳皮素和橘皮素的對(duì)照品溶液置UV-1750型紫外可見分光光度計(jì)下，于200～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果川陳皮素和桔皮素在326 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故將檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為326 nm。

色譜條件選擇：樣品中所含川陳皮素和桔皮素結(jié)構(gòu)相近、極性類似，等度洗脫難以實(shí)現(xiàn)同時(shí)分離，故采用梯度洗脫，試驗(yàn)考察了多種流動(dòng)相系統(tǒng)（乙腈-0.1%醋酸水、甲醇-0.1%醋酸水、甲醇-水）。結(jié)果顯示，甲醇-水能達(dá)到分離度的要求，分離時(shí)間合適，最后確定流動(dòng)相為甲醇（B）-水（A），二元梯度洗脫（0～6 min、60%B，6～18 min、60%B→100%B）。

提取條件選擇：曾考察了超聲提取法和水浴加熱回流法在不同提取時(shí)間（0.5，1，1.5 h）的提取效果，結(jié)果表明，在相同時(shí)間超聲提取回收率低于水浴加熱回流提取回收率；隨時(shí)間的增加，水浴加熱回流提取回收率越高，提取1.5 h后，提取回收率在98%，故本試驗(yàn)中采用水浴加熱回流法提取。

不同來源樣品的含量測(cè)定：化學(xué)成分是中藥中醫(yī)臨床產(chǎn)生藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，由于藥材種植產(chǎn)地、基源的不同，內(nèi)、外界因素導(dǎo)致中藥材中的化學(xué)成分發(fā)生變化，成分的變化必將引起藥效的變化。由表2可見，從多甲氧基黃酮的含量角度分析，江西南豐蜜桔、四川紅橘、重慶大紅袍質(zhì)量可與新會(huì)茶枝柑橘媲美，可結(jié)合生藥研究報(bào)道[15]進(jìn)行開發(fā)利用。目前，對(duì)于江西陳皮的研究甚少，柑橘類植物品種多、栽培廣，每年產(chǎn)出大量的柑橘水果，果皮也被大量廢棄，僅有少部分柑橘品種的果皮被利用。應(yīng)加強(qiáng)江西陳皮的研究力度，可結(jié)合藥效，以擴(kuò)大陳皮的藥用資源。