分子標(biāo)記輔助離體葉片接種鑒定甜瓜蔓枯病極端抗感單株

任琴琴 魯秀梅 柯思佳 錢春桃

摘? ? 要： 為了構(gòu)建抗感基因池，快速準(zhǔn)確篩選抗感單株，進(jìn)行抗蔓枯病基因的精細(xì)定位，加速育種進(jìn)程，采用分子標(biāo)記輔助離體葉片接種鑒定，篩選極端抗感單株。研究結(jié)果表明，利用甜瓜F2群體的96株植株，接種5 d后快速準(zhǔn)確篩選到抗感單株分別為17株和15株，抗感植株的離體葉片接種鑒定與分子標(biāo)記篩選的相關(guān)系數(shù)分別達(dá)0.85和0.68。

關(guān)鍵詞： 甜瓜;蔓枯病;分子標(biāo)記;離體葉片;接種鑒定

In vitro leaf inoculation combing with molecular marker selection to identify extreme resistance and susceptibility of melon to gummy stem blight

REN Qinqin，LU Xiumei，KE Sijia，QIAN Chuntao

（State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement，College of Horticulture， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， Jiangsu， China）

Abstract： In order to rapidly and accurately screen resistant plants， gene pools of resistant and susceptible were constructed to fine map resistance genes to gummy stem blight ， aiming to accelerate the breeding process.In this study， in vitro leaf inoculation combing with molecular marker-assisted selection was performed to identify extreme resistant plants. Results have shown that 96 indivduals of melon F2 population were used to screen rapidly and accurately 17 resitant plants and 15 susceptible plants 5 days after inoculation. The resistance and susceptible correlation coefficients of in vitro leaf inoculation identification and molecular marker screening results were 0.85 and 0.68， respectively.

Key words： Melon; Gummy stem blight; Molecular marker; In vitro leaf; Inoculation identification

甜瓜是世界上十大水果之一，營養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者的喜愛。蔓枯病是限制甜瓜優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的主要病害之一。在我國浙江、江蘇、河南、甘肅、新疆等地均有蔓枯病爆發(fā)，而且呈逐年加重趨勢[1]，篩選抗蔓枯病資源和培育抗蔓枯病品種具有重要意義[2]。常規(guī)育種周期長，常依賴于育種家的經(jīng)驗(yàn)和機(jī)遇，帶有很大的盲目性和機(jī)遇性，而分子標(biāo)記可以提高育種效率。

‘PI 420145是葫蘆科甜瓜屬甜瓜種質(zhì)資源，起源于日本，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)屬于高抗蔓枯病的甜瓜材料，在江蘇一帶地區(qū)栽培，綜合性狀優(yōu)良;抗性遺傳規(guī)律為單個(gè)顯性基因控制[3-4]，同時(shí)，Wolukau等[4-5]利用感病親本‘PI 5136170和抗病‘PI 420145，構(gòu)建F2群體，苗期活體接種鑒定，篩選到抗感植株，采用BSA分析和AFLP引物進(jìn)行分子標(biāo)記，篩選得到4個(gè)與其所含抗病基因Gsb-6連鎖的AFLP標(biāo)記，但由于存在遺傳距離較遠(yuǎn)，篩選率低。因此需篩選抗感單株、構(gòu)建抗感基因池，需更進(jìn)一步的抗蔓枯病基因的精細(xì)定位，加速抗蔓枯病育種進(jìn)程。

對現(xiàn)有的種質(zhì)資源進(jìn)行抗性鑒定是建立抗感基因池的前提。目前，國內(nèi)對甜瓜蔓枯病的抗性鑒定多采用苗期接種鑒定[6]，多項(xiàng)研究表明，苗期接種鑒定易受溫度、濕度等環(huán)境條件的影響，且單一鑒定方法常造成鑒定結(jié)果不穩(wěn)定，不能完全反應(yīng)材料的抗性程度[7];此外，苗期接種發(fā)病周期長、成本高，植株接種后無法進(jìn)行后續(xù)的生長研究使用，對甜瓜蔓枯病鑒定的準(zhǔn)確性有一定影響[8-9]。而采用離體接種鑒定具有準(zhǔn)確、快速、篩選量大、受外界環(huán)境條件影響較小等優(yōu)點(diǎn)[10]。因此，利用致病性極強(qiáng)的蔓枯病原菌，以抗病材料‘PI 420145、感病材料‘白皮脆及雜交F2群體進(jìn)行分子標(biāo)記輔助離體葉片接種方法鑒定，更快、更精確地篩選到抗感單株，構(gòu)建抗感基因池，提高育種效率。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2018年8—10月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白馬基地網(wǎng)室進(jìn)行，8月1日播種，8月20日定植，9月5日取第3片展開的真葉進(jìn)行離體葉片接種鑒定，9月10日統(tǒng)計(jì)病情。試驗(yàn)所用材料：感病材料‘白皮脆、抗病材料‘PI 420145以及‘白皮脆與‘PI 420145雜交所得的F2代，感病材料和抗病材料分別由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院和葫蘆科作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新試驗(yàn)室提供，均由葫蘆科作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新試驗(yàn)室連續(xù)多代自交保存。試驗(yàn)所用蔓枯病病原菌由江蘇省農(nóng)科院提供，經(jīng)葫蘆科作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新試驗(yàn)室分離純化并保存的DBJSJY2菌株。

1.2 蔓枯病菌培養(yǎng)

參照Li[11]的方法，誘導(dǎo)蔓枯病菌產(chǎn)生分生孢子：選取純性蔓枯病原菌DBJSJY2，接種試驗(yàn)前，將蔓枯病菌DBJSJY2接種到PDA培養(yǎng)基上（土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L），26～28 ℃條件下暗培養(yǎng)1周。

1.3 離體葉片菌絲塊接種

接種方法參照Wang等[12]方法稍作改動(dòng)：取甜瓜植株展開的第3或第4片真葉（保留葉柄），用無菌水沖洗干凈，晾干后放置到鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中。統(tǒng)一采用直徑為0.5 cm的滅菌打孔器切取菌絲塊，接種到甜瓜葉片的中央，每個(gè)葉片接種1個(gè)菌絲塊，將培養(yǎng)皿放在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（26±1） ℃，16 h光照/8 h黑暗，相對濕度90%～95%。培養(yǎng)5 d后，測量病原菌的擴(kuò)展半徑，分析甜瓜對病原菌侵染的敏感性。

葉片侵染病情分級標(biāo)準(zhǔn)如下，1級：擴(kuò)展半徑<1.8 cm，2級：1.8 cm≤擴(kuò)展半徑<2.3 cm，3級：2.3 cm≤擴(kuò)展半徑<2.8 cm，4級：2.8 cm≤擴(kuò)展半徑<3.3 cm，5級：擴(kuò)展半徑≥3.3 cm。其中，1級為高抗（HR），2級為抗（R），3級為中抗（MR），4級為感（S），5級為高感（HS）。

1.4 分子標(biāo)記輔助篩選

待植株長至3葉1心時(shí)，取甜瓜幼嫩葉片0.8～1.0 g于2.0 mL的離心管中，浸入液氮研磨成粉末，采用改良CTAB法[13]提取DNA。選用Wolukau[5]等篩選的分子標(biāo)記進(jìn)行蔓枯病抗性篩選鑒定（表1）。

用于檢測抗病基因Gsb-6由葫蘆科作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新試驗(yàn)室設(shè)計(jì)，由南京擎科生物科技有限公司合成（表1）。PCR程序總反應(yīng)體系為20 ?L（包括10×buffer 10.0 ?L，10 ?mol·L-1前后引物各1.0 ?L，30 ng·?L-1模板DNA 1.0 ?L，ddH2O 7.0 ?L）。擴(kuò)增反應(yīng)在TaKaRa PCR儀中進(jìn)行。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，40個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 5 min。PCR產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠上電泳，采用銀染方法檢測。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office Excel 2003和SPSS 20.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、相關(guān)性分析和卡方值檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔓枯病分子標(biāo)記輔助鑒定

對親本及F2群體的96株植株進(jìn)行篩選（表2），20株親本‘白皮脆‘PI 420145各擴(kuò)增出20條‘白皮脆帶型和20條‘PI 420145帶型。F2群體中，20株擴(kuò)增出‘PI 420145帶型，54株擴(kuò)增出雜合帶型，22株擴(kuò)增出‘白皮脆帶型。由此可知，共篩選到20株純合抗性植株，分離比為1∶2.7∶1.1，經(jīng)卡平方檢驗(yàn)，χ 2=1.234 4<χ0.05，1=3.84，分離比近似接近1∶2∶1，與Wolukau等[4]的研究結(jié)果一致。

2.2 蔓枯病抗性離體葉片接種鑒定分析

對兩親本進(jìn)行離體葉片接種發(fā)現(xiàn)（圖1），抗感品種的病斑大小和擴(kuò)展速度不同。接種第5天后，20株‘白皮脆全表現(xiàn)為感病，擴(kuò)展半徑在3.07 cm到4.05 cm不等，其中12株感病植株的病情級別為4級，8株高感植株的病情級別為5級;20株‘PI 420145鑒定結(jié)果全表現(xiàn)為抗病，擴(kuò)展半徑在1.45 cm到2.1 cm不等，10株高抗植株的病情級別為1級，10株抗病植株的病情級別為2級。

進(jìn)一步對分子標(biāo)記篩選到的20株抗性植株和22株感病植株進(jìn)行離體葉片接種鑒定，結(jié)果見表3、表4。經(jīng)測量發(fā)現(xiàn)，抗感植株菌絲侵染擴(kuò)展范圍差異明顯，抗性級別從1級到5級不等，擴(kuò)展半徑從1.5 cm到3.9 cm不等。其中，20株抗病植株中，篩出高抗、抗、中抗植株分別有8株、9株、3株;22株感病植株中，篩選出感病、高感植株分別有7株、15株。

2.3 分子標(biāo)記輔助篩選與離體葉片接種方法相關(guān)性分析

表2、表3、表4結(jié)果顯示，利用分子標(biāo)記篩選到20株純合抗性植株和22株感病植株;篩選到極端高抗、高感植株分別為17和15株，抗感分子標(biāo)記輔助篩選與離體葉片接種鑒定結(jié)果的相關(guān)系數(shù)分別為到0.85和0.68。由此可見，分子標(biāo)記篩選與離體葉片接種鑒定是高度相關(guān)的。

3 討論與結(jié)論

人工接種鑒定是篩選抗蔓枯病資源的重要組成部分，為構(gòu)建抗感基因池，篩選抗感單株，是甜瓜抗病性育種的前提。離體接種鑒定具有在空間有限的條件下，短時(shí)間內(nèi)大量快速準(zhǔn)確鑒定抗感材料，而且不易受環(huán)境條件的影響[14]，并已在菜瓜、甜瓜、黃瓜、西瓜等園藝作物上被廣泛運(yùn)用于蔓枯病、葉斑病、黑星病、炭疽病等的抗性鑒定[15-16]。姚協(xié)豐、張永兵等[16-17]研究表明，感病材料離體葉片接種蔓枯病菌后，有不同程度的擴(kuò)展;而在抗病材料中，沒有被侵染的現(xiàn)象。在本試驗(yàn)中，感病材料離體接種后結(jié)果與此相一致;而在抗病材料中，與張永兵等[16]的研究結(jié)果不一致，離體接種后也有不同程度的侵染;這可能與研究所用的抗性材料抗性、培養(yǎng)條件、病原菌不同有關(guān)。張艷苓等[18]研究發(fā)現(xiàn)，苗期人工接種鑒定與成株期田間鑒定存在顯著差異，下一步對離體葉片接種鑒定的擴(kuò)展速率及不同時(shí)期發(fā)病率進(jìn)行研究。

利用分子標(biāo)記輔助篩選抗病基因的可靠性主要取決于分子標(biāo)記與基因的連鎖距離，即連鎖距離越近，輔助選擇的準(zhǔn)確性越高[19-20]。本研究中所用的分子標(biāo)記與抗病基因Gsb-6的遺傳連鎖距離為2.0 cM，但存在篩選率低的問題，因此需進(jìn)一步的進(jìn)行抗蔓枯病的進(jìn)行定位。本試驗(yàn)中，利用抗蔓枯病基因Gsb-6在F2群體的96株植株中共篩選到20株純合抗性植株，54株雜合抗病植株，22株感病植株，利用離體葉片接種鑒定，高抗性植株和高感植株的篩選率分別達(dá)到85%和68%，與宋茂興等[21]的研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果表明，利用分子標(biāo)記輔助甜瓜蔓枯病離體葉片接種鑒定具有發(fā)病快，縮短檢測周期，接種5 d后就可得到鑒定結(jié)果;同時(shí)節(jié)省空間，降低試驗(yàn)成本;同時(shí)植株離體接種后還可進(jìn)行后續(xù)的研究使用，操作簡便等優(yōu)勢。因此，利用分子標(biāo)記輔助離體葉片接種快速準(zhǔn)確地篩選抗感抗感單株，構(gòu)建抗感基因池，加速抗蔓枯病基因精細(xì)定位的進(jìn)程，為甜瓜極端抗感基因池的篩選鑒定提供一條新的研究思路。

參考文獻(xiàn)

[1] 李英.瓜類蔓枯病菌的生物學(xué)特性和黃瓜抗病資源的篩選[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[2] 畢研飛，徐兵劃，郭靜，等.分子標(biāo)記輔助甜瓜抗蔓枯病基因聚合及‘白皮脆品種改良[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，38（3）：375-380.

[3] WOLUKAU J N，ZHOU X H，LI Y，et al.Resistance to gummy stem blight in melon （Cucumis melo L.） germplasm and inheritance of resistance from plant introductions 157076，420145，and 323498[J].Hortscience A Publication of the American Society for Horticultural Science，2007，42（2）：215-221.

[4] WOLUKAU J N.甜瓜抗蔓枯病的遺傳學(xué)、系統(tǒng)發(fā)生學(xué)和分子標(biāo)記的研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[5] WOLUKAU J N，ZHOU X，CHEN J F.Identification of amplified fragment length polymorphism markers linked to gummy stem blight （Didymella bryoniae） resistance in melon （Cusumis melo L.） PI 420145[J].HortScience，2009，44（1）：32-34.

[6] 張學(xué)軍，郭麗霞，馬新力，等.甜瓜種質(zhì)資源抗霜霉病和蔓枯病苗期篩選與評價(jià)[J].中國瓜菜，2014，27（S1）：38-40.

[7] 林代福.應(yīng)用離體接種技術(shù)鑒定稻瘟病菌生理小種[J].植物保護(hù)，1998，24（4）：29-30.

[8] ZHANG Y P，KYLE M，ANAGNOSTOU K，et al.Screening melon （Cucumis melo） for resistance to gummy stem blight in the greenhouse and field[J].Hortscience A Publication of the American Society for Horticultural Science，1997，32（1）：117-121.

[9] FRANTZ J D，JAHN M M.Five independent loci each control monogenic resistance to gummy stem blight in melon （Cucumis melo L.）[J].Theoretical & Applied Genetics，2004，108（6）：1033-1038.

[10] 何文蘭，宋玉立，張忠山，等.用小麥離體葉段鑒定抗白粉病性的方法[J].作物學(xué)報(bào)，1998，24（6）：916-918.

[11] LI P F，REN R S，YAO X F，et al.Identification and characterization of the causal agent of gummy stem blight from muskmelon and watermelon in east China[J].Journal of Phytopathology，2015，163（4）：314-319.

[12] WANG H，HWANG S F，CHANG K F，et al.Characterization of ascochyta isolates and susceptibility of pea cultivars to the ascochyta disease complex in alberta[J].Plant Pathology，2000，49（5）：540-545.

[13] SUN X M，CHEN X，DENG Z X，et al.A CTAB-assisted hydrothermal orientation growth of ZnO nanorods[J].Materials Chemistry & Physics，2003，78（1）：99-104.

[14] 張彪，黃軍艷，劉勝毅，等.大豆灰斑病菌菌絲塊離體葉接種快速鑒定方法的建立[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（21）：12714-12718.

[15] 文生倉，王鳴.西瓜炭疽病人工接種鑒定的新方法──離體葉接種和AD評價(jià)法[J].西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994（1）：17-22.

[16] 張永兵，王登明，張聰，等.甜瓜蔓枯病離體接種方法初步研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，46（3）：521-525.

[17] 姚協(xié)豐，徐錦華，李蘋芳，等.菜瓜蔓枯病苗期抗性鑒定方法比較[J].中國瓜菜，2017，30（2）：11-14.

[18] 張艷苓，卜崇興，李謙盛，等.網(wǎng)紋甜瓜苗期和成株期蔓枯病抗性的鑒定和相關(guān)性[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，22（4）：83-85.

[19] ZALAPA J E，STAUB J E，MCCREIGHT J D，et al.Detection of QTL for yield-related traits using recombinant inbred lines derived from exotic and elite US western shipping melon germplasm[J].Theoretical and Applied Genetics，2007，114（7）：1185-1201.

[20] PALOMARES-RIUS F J，VIRUEL M A，YUSTE-LISBONA F J，et al.Simple sequence repeat markers linked to QTL for resistance to watermelon mosaic virus in melon[J].Theoretical & Applied Genetics，2011，123（7）：1207-1214.

[21] 宋茂興，瞿會，閆偉，等.2個(gè)玉米抗矮花葉病分子標(biāo)記的有效性評價(jià)[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2016，17（3）：555-561.