豆粕和發(fā)酵豆粕替代魚粉對(duì)黃河鯉生長和血清抗氧化性能及消化酶活性的影響

■殷海成 黃 進(jìn) 李昕朔 鄭 鑫

（1.國家糧食局糧油食品工程技術(shù)研究中心，河南鄭州450001；2.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州450001）

“豫選黃河鯉”（Cyprinus carpio-haematopterus）是國家水產(chǎn)良種認(rèn)證委員會(huì)審定通過的優(yōu)良推廣品種，是河南省區(qū)域養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟(jì)魚類之一[1]，其配合飼料所用蛋白源主要是魚粉[2]。目前，魚粉供給緊張、價(jià)格偏高等原因，探討豆粕（soybean meal，SBM）替代魚粉成為研究的熱點(diǎn)。豆粕富含蛋白質(zhì)以及相對(duì)平衡的氨基酸，而且價(jià)格低廉，因此，常用豆粕替代魚粉用于水產(chǎn)動(dòng)物飼料。然而，豆粕適口性差、蛋氨酸、賴氨酸等必需氨基酸含量偏低以及含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，過高比例替代魚粉對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類產(chǎn)生不良的影響[3-4]。研究表明，用30%豆粕替代魚粉飼喂大黃魚（Larimichthys crocea）[5]和34.25%～45.46%豆粕替代魚粉飼喂齊口裂腹魚（Schizothorax prenanti）[6]不影響生長性能，增加豆粕替代水平造成其腸道和肝臟損傷。同樣，吳莉芳等[7]在研究鯉、胡鲇（Clarias fuscus）和草魚飼料中添加大豆球蛋白（60 mg/g）和β-伴大豆球蛋白（40 mg/g）發(fā)現(xiàn)均引起3 種魚的腸道損傷。為降低豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，常采用發(fā)酵技術(shù)處理豆粕，以減少豆粕的抗?fàn)I養(yǎng)因子含量[8]。Gao 等[9]使用短乳桿菌（Lactobacillus brevis）和米曲霉（Aspergillus oryzae）發(fā)酵豆粕，發(fā)現(xiàn)L.brevis和A.oryzae分別使豆粕中胰蛋白酶抑制因子降低了57.1%和89.2%；Song等[10]利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）發(fā)酵豆粕48 h，其發(fā)酵豆粕（fermented soybean meal，F(xiàn)SBM）中的大豆抗原蛋白降低了88.0%。除此之外，豆粕經(jīng)發(fā)酵后，還改善其適口性，增加益生菌和其活性組分以改善魚類腸道菌群和提高魚對(duì)蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[11]。目前關(guān)于“黃河鯉”幼魚飼料的研究主要集中在飼料蛋白源和脂肪源、蛋白和脂肪水平及豆粕添加量等對(duì)生長性能和血清相關(guān)指標(biāo)研究[12-13]，但尚未見豆粕和發(fā)酵豆粕替代魚粉效果的比較研究。因此，本試驗(yàn)以“豫選黃河鯉”幼魚為研究對(duì)象，選用豆粕和多菌種發(fā)酵豆粕分別替代部分魚粉，探討對(duì)幼鯉的生長和血清抗氧化性能及消化酶活性的影響，以期為幼鯉蛋白源合理選用和豆粕替代魚粉配制水產(chǎn)動(dòng)物飼料提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和飼料配制

豆粕由開封正大有限公司提供，同一批次豆粕經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的Bacillus sublitis(ACCC 01746)、Sac?charomyces sp(CICIM Y0362)和Lactococcus lactis(ACCC 11092)三種菌株按照本課題組Guan 等[14]優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法，在30 ℃混合液態(tài)發(fā)酵8 h，經(jīng)45 ℃風(fēng)干6 h制成。豆粕和發(fā)酵豆粕的營養(yǎng)組成見表1。

表1 豆粕與發(fā)酵豆粕的營養(yǎng)組成（%干物質(zhì)）

試驗(yàn)飼料以酪蛋白、魚粉、SBM 和FSBM 為蛋白源，魚油和豆油為脂肪源，α-淀粉、糊精、微晶纖維素為主要碳水化合物，配制42%魚粉（對(duì)照組，F(xiàn)M）、27%魚粉+25%SBM（SBM25）、27%魚粉+23%FSBM（FSBM23）、12%魚粉+50%SBM（SBM50）和12%魚粉+46%FSBM（FSBM46）的5 組等氮（粗蛋白質(zhì)約38.50%）等能（粗脂肪約8.0%）的飼料（見表2）。除油脂外的其他各原料組分經(jīng)粉碎過60 目篩，按配方標(biāo)準(zhǔn)稱重，逐級(jí)放大混合，加油、加水拌勻，用SLKL-120B 型制粒機(jī)（曲阜市圣魯機(jī)械廠）制成直徑1.0 mm 的顆粒飼料，于40 ℃下烘干6 h，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 飼料組成及營養(yǎng)水平（%干物質(zhì)）

1.2 試驗(yàn)魚與管理

試驗(yàn)用“豫選黃河鯉”幼魚購于河南省水產(chǎn)科學(xué)研究院種魚繁殖場(chǎng)，并在河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院魚類營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行為期2周的馴化（馴化期用魚粉配制的全價(jià)飼料進(jìn)行飼喂）。馴化結(jié)束，隨機(jī)選擇600 尾、體質(zhì)量為(49.76±0.24)g 幼鯉，分成5 組，每組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)養(yǎng)殖幼鯉40尾，分養(yǎng)于15個(gè)體積為長（100 cm）×寬（60 cm）×高（70 cm）、安裝自動(dòng)循環(huán)微流水系統(tǒng)的深藍(lán)水族箱（有效的水體容積80%）中，進(jìn)行為期56 d 的養(yǎng)殖試驗(yàn)。試驗(yàn)期間，每天9:00 和17:00 投喂飼料，投喂量分別為體質(zhì)量的1.2%和1.8%。整個(gè)試驗(yàn)期間，養(yǎng)殖用水為曝氣的自來水，每日換水量約占總水量的1/3，水溫控制在(26±0.5)℃之間、溶氧大于6.0 mg/l、氨氮低于0.1 mg/l、pH值6.8。

1.3 樣品采集與測(cè)定指標(biāo)

56 d 的試驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)各組幼鯉禁食24 h，以0.03%的MS-222麻醉，然后計(jì)數(shù)，測(cè)體質(zhì)量和體長，計(jì)算各組平均增重率（SGR）、飼料系數(shù)（FCR）、蛋白質(zhì)效率（PER）和肥滿度（CF）。各重復(fù)組隨機(jī)選取幼鯉10 尾，剖腹，心臟取血，分離腸管。血液在3 000 r/min離心25 min，分離血清，-70 ℃冰箱保存，用于測(cè)定血清超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）和總抗氧化能力（T-AOC）；取出腸道，剔除附著物，第一個(gè)腸回轉(zhuǎn)點(diǎn)之前為前腸，最后一個(gè)回轉(zhuǎn)點(diǎn)之后為后腸，中間部分為中腸，分別用去離子水沖洗干凈并用濾紙吸干，加10 倍體積的去離子水進(jìn)行勻漿，4 ℃冰箱中靜置2 h，隨后5 000 r/min離心10 min，取上清液，4 ℃冰箱保存，24 h內(nèi)用于測(cè)定前、中、后腸蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性。

1.4 血清酶活性、生化指標(biāo)以及腸消化酶活性檢測(cè)

血清和腸主要檢測(cè)指標(biāo)均采用南京建成生物工程有限公司試劑盒檢測(cè)，具體步驟按說明書的描述進(jìn)行。其中，血清CAT 采用紫外吸收法測(cè)定，其酶活單位以1 min 內(nèi)A240減少0.1 的酶量為1 個(gè)U；SOD 采用黃嘌呤氧化酶法，當(dāng)反應(yīng)體系中有50%的抑制百分率時(shí)的酶量定義為一個(gè)SOD活力單位（U）、MDA含量采用MDA 與TBA 縮合形成紅色復(fù)合物，檢測(cè)532 nm處的最大吸光值可計(jì)算MDA 含量；T-AOC 采用可見分光光度法，活力單位表示為37 ℃時(shí)，每分鐘每毫升血清使反應(yīng)體系的吸光值每增加0.01 為一個(gè)單位[11]。消化酶活性按照檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）說明書嚴(yán)格執(zhí)行操作。37 ℃下，各酶活單位分別為pH 值8.0 時(shí)，每毫克（mg）蛋白中含有的蛋白酶，每分鐘（min）使吸光度變化0.003 即為一個(gè)蛋白酶活單位；每克（g）蛋白與底物反應(yīng)1 min，每消耗1 μmol 底物為一個(gè)脂肪酶活單位；每毫克（mg）蛋白與底物作用30 min，水解10 mg淀粉為一個(gè)淀粉酶活性單位，各酶活單位表示為U/mg。

1.5 計(jì)算及數(shù)據(jù)處理

成活率（Survival rate，SR，%）=100×Nt/N0；

增重率（WGR，%）=100×(Wt-W0)/W0；

飼料系數(shù)（FCR）=總飼料投喂量/總(Wt-W0+死亡魚體質(zhì)量)；

蛋白質(zhì)效率（PER，%）=100×總(Wt-W0)/(總飼料投喂量×飼料蛋白含量)；

肥滿度（CF，g/cm3）=100×Wt/L3。

式中：Nt、N0——分別為實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)和實(shí)驗(yàn)開始時(shí)“豫選黃河鯉”幼魚的存活數(shù)；

Wt、W0——分別為實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诤统跗诘钠骄w質(zhì)量（g）；

L——體長（cm）。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（Mean±SD）表示，各組數(shù)據(jù)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），若組間差異顯著再進(jìn)行Tukey's檢驗(yàn)，顯著差異水平用P＜0.05表示。

2 結(jié)果

表3 豆粕和發(fā)酵豆粕替代魚粉對(duì)幼鯉生長和飼料利用的影響

2.1 豆粕和發(fā)酵豆粕替代魚粉對(duì)幼鯉生長及飼料利用率的影響（見表3）

由表3 可知，各組幼鯉的成活率均為100%。對(duì)照組（FM）的WGR、PER 和CF 最高，而FCR 最低，其中，WGR 和PER 顯著高于SBM25、SBM50 組和FSBM46 組（P＜0.05），但與FSBM23 組差異不顯著（P＞0.05），F(xiàn)CR 顯著低于SBM25、SBM50 組和FS?BM46 組（P＜0.05），但與FSBM23 組差異不顯著（P＞0.05）；對(duì)照組（FM）的CF 與SBM25、FSBM23 組和FSBM46 組 差 異 不 顯 著（P＞0.05），但 顯 著 高 于SBM50 組（P＜0.05）。SBM25、FSBM23 組和FSBM46組的WGR、FCR、PER 和CF 差異不顯著（P＞0.05），但SBM25 組和SBM23 組的WGR 和PER 顯著高于SBM50 組，F(xiàn)CR 顯著低于SBM50 組（P＜0.05），而CF在SBM25 組和FSBM46 組與SBM50 組差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 豆粕和發(fā)酵豆粕替代魚粉對(duì)幼鯉血清抗氧化性能的影響（見表4）

表4 豆粕和發(fā)酵豆粕替代魚粉對(duì)幼鯉血清抗氧化性能的影響

由表4 可知，幼鯉血清中CAT、SOD、GSH-Px 和T-AOC 活 性 在FM 組 最 高，相 反，MDA 含 量 最 低。FSBM23 組CAT 活 性顯著高 于SBM25 組和SBM50 組（P＜0.05），但與FSBM46 組差異不顯著（P＞0.05），最低為SBM50 組，但與SBM25 組差異不顯著（P＞0.05）；SOD 活性在SBM25 組、FSBM23 和FSBM46 組以及SBM25 組與SBM50 組差異不顯著（P＞0.05），但顯著低于FM 組（P＜0.05）；SBM50 組的MDA 含量最高，顯 著 高 于FM 和FSBM23 組（P＜0.05），但 與SBM25 組和FSBM46 組差異不顯著（P＞0.05）；GSHPx 和T-AOC 活性在FM 組和FSBM23 組組間以及SBM25、FSBM23、SBM50 組和FSBM46 組間差異不顯著（P＞0.05），但SBM25、SBM50 組和FSBM46 組顯著低于FM 組（P＜0.05）。

2.3 豆粕和發(fā)酵豆粕替代魚粉對(duì)幼鯉消化酶活性的影響(見表5)

表5 豆粕和發(fā)酵豆粕替代魚粉對(duì)幼鯉腸道消化酶活性的影響（U/mg）

由表5 可知，前、中、后腸的蛋白酶活性在FM 組均為最高，SBM50 組最低，且兩者差異顯著（P＜0.05）。在前腸和中腸中，SBM25、FSBM23 組和FS?BM46組組間差異不顯著，但都顯著高于SBM50組，顯著低于FM 組（FSBM23 組除外）（P＜0.05）；在后腸中，SBM25、FSBM23 組和FSBM46 組與FM 組差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于SBM50組（FSBM46組除外）（P＜0.05）。在前腸，F(xiàn)M 組的淀粉酶活性最低，顯著低于其他組，F(xiàn)SBM23組最高，顯著高于其他組（FSBM46組除外）（P＜0.05）；在中腸和后腸，F(xiàn)M 組淀粉酶活性最高，其中中腸顯著高于SBM25 組和SBM50 組（P＜0.05），但與FSBM23 組和FSBM46 組差異不顯著（P＞0.05），后 腸 顯 著 高 于SBM50 組 和FSBM46 組（P＜0.05），但與SBM25 組和FSBM23 組差異不顯著（P＞0.05）。在前腸，F(xiàn)M 組脂肪酶活性最高，顯著高于其他組（P＜0.05），SBM25 和FSBM23 組顯著高于SBM50組和FSBM46 組（P＜0.05），但兩組間差異不顯著（P＞0.05）；中腸和后腸的脂肪酶活性在FM 組最低，顯著低于其他組（P＜0.05），其中SBM25 組和FSBM23 組顯著高于SBM50組和FSBM46組（中腸FSBM46組除外）（P＜0.05）。

3 討論

3.1 豆粕和發(fā)酵豆粕替代魚粉對(duì)幼鯉生長和飼料利用的影響

研究表明，適量豆粕替代魚粉對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的生長性能無顯著性影響，但當(dāng)替代水平不斷提高，則抑制水產(chǎn)動(dòng)物生長性能[5]。飼料中用豆粕替代少于40%的魚粉時(shí)，其生長性能無顯著差異，高于40%則生長性能下降[15]。本試驗(yàn)中，SBM25、SBM50 組和FS?BM46組幼鯉WGR顯著低于FM組，相反，F(xiàn)CR顯著高于FM 組，但FSBM23 組各指標(biāo)與FM 組差異不顯著。由此可知，豆粕對(duì)于幼鯉的生長性能影響較大，而適量的發(fā)酵豆粕不影響幼鯉生長。發(fā)酵豆粕的促生長作用研究較多，李云蘭等[16]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵豆粕中胰蛋白酶抑制因子（STI）、大豆抗原蛋白的含量顯著降低，替代魚粉飼喂鯉魚顯著提高其生長性能。類似研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵的豆粕替代方正鯽飼料中的魚粉，具有顯著促生長作用[17]；同樣研究也在南美白對(duì)蝦（Penae?us vannamei）養(yǎng)殖中得以證實(shí)[18]。主要原因在于發(fā)酵的豆粕中，大豆抗原蛋白等抗?fàn)I養(yǎng)因子含量顯著降低，小肽含量增加，游離的氨基酸含量提高等，使發(fā)酵豆粕比豆粕更利于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的消化和吸收[19]。

3.2 豆粕和發(fā)酵豆粕替代魚粉對(duì)幼鯉血清抗氧化能力的影響

魚類機(jī)體新陳代謝產(chǎn)生的過量氧自由基，能通過其體內(nèi)的酶系和非酶系抗氧化系統(tǒng)進(jìn)行清除，維持機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)[20]。SOD 是生物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)中唯一以自由基為底物的抗氧化酶，通過歧化反應(yīng)，清除體內(nèi)過量的超氧化物自由基，產(chǎn)生的H2O2由CAT催化分解生成H2O和O2，從而避免魚體內(nèi)氧化損傷。若氧自由基清除不及時(shí)，則產(chǎn)生大量丙二醛，加重組織細(xì)胞的氧化損傷[21]。動(dòng)物機(jī)體各抗氧化酶活性互相影響，用T-AOC能體現(xiàn)機(jī)體總抗氧化能力，可用于衡量抗氧化性能的綜合指標(biāo)。本研究中，F(xiàn)M 組幼鯉血清鯉的抗氧化能力總體顯著高于其他各組，但CAT 活性在FS?BM46 組顯著低于FM 組，GSH-Px 和T-AOC 活性在FSBM23組與FM組無顯著差異，且豆粕組抗氧化活性低于發(fā)酵豆粕組，提示幼鯉的抗氧化性能受豆粕和發(fā)酵豆粕的影響。已知研究表明，對(duì)比豆粕，發(fā)酵豆粕含有活性更高的大豆異黃酮和小肽等，具有增強(qiáng)機(jī)體抗氧化功能和改善肝功能的作用[22]。原因在于發(fā)酵的豆粕中，大豆異黃酮糖苷被降解為大豆異黃酮苷元，具有較強(qiáng)的抗氧化性，此外，高含量的大豆異黃酮能激活CAT 的啟動(dòng)子以促進(jìn)CAT mRNA 的表達(dá)，從而進(jìn)一步提高CAT 活性，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力[23]。而高水平添加豆粕使血清丙二醛含量顯著升高，丙二醛是脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，而脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致蛋白質(zhì)損傷[24]。除此之外，研究證實(shí)大多數(shù)益生菌具有提高機(jī)體抗氧化能力，而發(fā)酵豆粕中枯草芽孢桿菌進(jìn)入幼鯉腸道后能通過分泌抗氧化酶或者作為抗氧化酶激活劑促進(jìn)其抗氧化酶分泌，從而增強(qiáng)幼鯉的抗氧化性能[25]。因此使用枯草芽孢桿菌等發(fā)酵的豆粕適量添加到飼料中可以提高幼鯉抗氧化性能。

3.3 豆粕和發(fā)酵豆粕替代魚粉對(duì)幼鯉腸道消化酶活性的影響

消化酶作為反映魚類對(duì)飼料的消化力和飼料利用能力的關(guān)鍵酶，對(duì)于同一種魚（如鯉魚），不同的消化酶分泌部位其消化酶的活性不同，這與其食性有關(guān)[26]。利用豆粕替代魚粉配制魚類飼料研究其消化酶的活性，可為豆粕型全價(jià)飼料的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。然而，研究顯示，魚類飼料中高水平添加豆粕可抑制其腸道的消化酶活性，其因在于豆粕中含有胰蛋白酶抑制因子、大豆抗原蛋白、植酸等多種抗?fàn)I養(yǎng)因子[27]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)M 組幼鯉前腸和中腸的蛋白酶活性顯著高于SBM25、SBM50 組和FSBM46 組，而與FS?BM23 組差異不顯著；后腸蛋白酶活性FM、SBM25 組和FSBM23 組與FSBM46 組差異不顯著，但都顯著高于SBM50 組，顯然，幼鯉飼料中添加豆粕和發(fā)酵豆粕使蛋白酶活性降低，這與大豆胰蛋白酶抑制因子、大豆抗原蛋白等有關(guān)[26]。FM組幼鯉前腸淀粉酶活性顯著低于其他組，中腸和后腸淀粉酶活性顯著高于SBM25（中腸）、SBM50 組和FSBM46 組（后腸）。而FM 組脂肪酶活性在前腸顯著高于其他組，中腸和后腸顯著低于其他組。這可能原因是豆粕富含碳水化合物，誘導(dǎo)幼鯉前腸分泌淀粉酶，提高了前腸淀粉酶活力[27]，關(guān)于豆粕和發(fā)酵豆粕引起幼鯉中腸和后腸淀粉酶活力下降還需進(jìn)一步研究。另外，豆粕和發(fā)酵豆粕使幼鯉中腸和后腸脂肪酶活性增強(qiáng)，這可能是豆粕和發(fā)酵豆粕中胰蛋白酶抑制因子被酶解有關(guān)，消除對(duì)蛋白酶活性的抑制作用[26]。此外，發(fā)酵豆粕對(duì)比豆粕發(fā)現(xiàn)蛋白酶、淀粉酶活性明顯增強(qiáng)，而脂肪酶活性影響較小，甚至略有降低。表明發(fā)酵豆粕在促進(jìn)幼鯉蛋白酶和脂肪酶活性優(yōu)于豆粕，有利于提高蛋白質(zhì)和淀粉轉(zhuǎn)化；而對(duì)于脂肪酶活性影響還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)表明，從幼鯉的生長、血清抗氧化指標(biāo)以及腸道消化酶活性等綜合分析可知，幼鯉飼料中，魚粉是不可或缺的組分，使用豆粕和發(fā)酵豆粕替代魚粉對(duì)于其生長和飼料利用有較大的影響；飼料中用23%的發(fā)酵豆粕替代15%的魚粉不影響幼鯉生長、蛋白酶活性和總抗氧化能力，但血清CAT 和SOD 活性降低，并使前腸淀粉酶活性、中腸和后腸脂肪酶活性增加，而前腸脂肪酶活性降低。50%豆粕和46%發(fā)酵豆粕分別替代30%的魚粉，幼鯉的生長性能、血清抗氧化以及腸道消化酶活性顯著降低。