高效液相色譜法測定飼料及飼料添加劑中維生素B12新方法的研究

■賀習(xí)文 李 宏 趙彩會 高勤葉 馬 川 李易軒 黃姣姣

（1.陜西秦云農(nóng)產(chǎn)品檢驗檢測有限公司，陜西渭南714000；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料質(zhì)量監(jiān)督測試中心（西安），陜西西安710016）

維生素B12又叫鈷胺素，是B 族維生素中迄今為止發(fā)現(xiàn)比較晚的一種，也是所有維生素分子中結(jié)構(gòu)最大和最復(fù)雜的物質(zhì)。該分子的主要成分由一個以鈷作為中心元素的卟啉環(huán)組合，一個氰基(-CN)與鈷相連，4個還原的吡咯環(huán)連在一起成為1個咕啉大環(huán)（與卟啉相似）是維生素B12分子的核心。因此含這種環(huán)的化合物都被稱為類咕啉，含有3 價鈷的多環(huán)化合物。有鈷元素存在，該化合物也被叫做“氰鈷胺”，是商業(yè)上通用維生素形式，自然界少有。與鈷相連的氰基，可能被一個羥基取代生成羥基鈷胺素，這也是自然界中一種普遍存在的維生素B12的形式。這個氰基也可能被一個亞硝基(-NO2)取代，從而產(chǎn)生出(亞)硝(酸)鈷胺素，它存在于某些細(xì)菌中[1]。

維生素B12能參與制造骨髓紅細(xì)胞，防止惡性貧血，防止大腦神經(jīng)受到損害等良性作用。但由于B族維生素的特性，維生素B12不可過量使用，否則會產(chǎn)生毒副作用，如出現(xiàn)哮喘、蕁麻疹、濕疹、面部浮腫、寒顫等過敏反應(yīng)，還可能出現(xiàn)神經(jīng)興奮和心悸等不適感，更會導(dǎo)致體內(nèi)葉酸的缺乏。

飼料作為養(yǎng)殖動物最主要的食物來源，其主要成分一直是生產(chǎn)企業(yè)、養(yǎng)殖戶和飼料監(jiān)管部門所關(guān)注的重點，相關(guān)研究表明，維生素B12只有自然界的微生物能夠合成，動物特別是還未健全的動物，體內(nèi)合成維生素B12的能力很弱，飼料中添加維生素B12，可以防止維生素B12缺乏癥的發(fā)生[2]；另據(jù)實驗表明，在犢牛飼料中添加維生素B12，能夠提高牛的增重和采食量，而且采食量隨著添加量的增加而提高[3]。商品飼料添加劑維生素B12為1%、2%等規(guī)格，在飼料中的添加量較低，它的化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，決定著其在飼料中的檢測難度很大。所以對飼料和飼料添加劑中的維生素B12的監(jiān)測就顯得尤為重要。

我國現(xiàn)行有效的檢測飼料中維生素B12的標(biāo)準(zhǔn)為GB/T 17819—2017《添加劑預(yù)混合飼料中維生素B12的測定 高效液相色譜法》[4]，檢測飼料添加劑中維生素B12的標(biāo)準(zhǔn)為GB/T 9841—2006《飼料添加劑 維生素B12（氰鈷胺）粉劑》[5]，該方法操作相對復(fù)雜，檢測復(fù)合預(yù)混合飼料需要通過C18固相萃取柱分離，處理時間過長，整個峰走完需要2～3 min，目標(biāo)峰寬大，峰型差，靈敏度不高，影響積分和計算。而GB/T 9841 中流動相中含有己烷磺酸鈉，對色譜柱的壽命影響相對較大。

本文通過大量試驗驗證，確定以磷酸鹽緩沖液+甲醇為流動相，以流動相作為提取液來對飼料及飼料添加劑中的維生素B12進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，本法具有前處理簡單，出峰快，峰型狹窄，穩(wěn)定性好，回收率達(dá)到90%～120%之間，檢出限為0.05 mg/kg等特點。

1 試驗原理、材料及方法

1.1 試驗原理

試樣中維生素B12經(jīng)提取液提取，以磷酸鹽緩沖液和甲醇為流動相，注入高效液相色譜儀分離檢測，外標(biāo)法定量。

1.2 試驗材料

1.2.1 儀器及設(shè)備

高效液相色譜儀：配備紫外檢測器；十萬分之一天平：梅特勒MS205DU；萬分之一天平；超聲波提取儀。

1.2.2 試劑及溶液

無水磷酸氫二鈉（分析純）；磷酸（優(yōu)級純）；氫氧化鈉（分析純）；甲醇（色譜純）；維生素B12標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：一級水。

4 g/l氫氧化鈉溶液：稱取0.4 g氫氧化鈉于100 ml容量瓶中，用水溶解定容。

維生素B12標(biāo)準(zhǔn)貯備液：于十萬分之一天平上準(zhǔn)確稱取含量為100%的維生素B12標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.025 27 g于25.00 ml 的棕色容量瓶中，用流動相溶解并定容，質(zhì)量濃度為1 010.8 μg/ml。

1.3 試驗方法

1.3.1 前處理方法

各類樣品稱重質(zhì)量如下，準(zhǔn)確稱取維生素B12添加劑0.1 g，維生素預(yù)混合飼料1～3 g，復(fù)合預(yù)混合飼料3～5 g，濃縮料和配合料5 g（均準(zhǔn)確至0.000 2 g）于25.0 ml 棕色容量瓶中，加入20 ml 左右的流動相，于超聲波提取儀上超聲20 min，超聲提取期間旋搖兩次，冷卻后用流動相定容至刻度，過0.45 μm 濾膜后上機測定。

1.3.2 試驗條件

色譜柱：Kromasil 100-5-C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 ml/min；柱溫：室溫；波長：361 nm。

2 試驗結(jié)果

2.1 流動相的確定

維生素B12在強酸強堿環(huán)境下容易分解，在弱酸環(huán)境pH 值4.5～5.0 時最穩(wěn)定，遇熱和強光也易分解，維生素B12易溶于水、甲醇和乙醇。

根據(jù)這些性質(zhì)，首先考慮相溶原理，流動相必須能夠溶解目標(biāo)物，即維生素B12，另外要形成一個pH值為4.5～5.0的弱酸環(huán)境，所以選用易調(diào)節(jié)pH值的磷酸鹽作為流動相，0.1 mol/l磷酸二氫鈉水溶液在25 ℃時pH 值為4.5，雖然是弱酸性，但是0.1 mol/l 的磷酸二氫鈉溶液配制1 L需要12 g無水磷酸二氫鈉，磷酸鹽對于色譜柱的損害很大。綜合考慮，選用了溶液呈弱堿性的磷酸氫二鈉，然后用磷酸和氫氧化鈉將pH值調(diào)節(jié)至4.5～5.0。

為了使目標(biāo)峰的峰型好看，出峰更快，在磷酸鹽緩沖液中加入甲醇，調(diào)節(jié)甲醇比例，先以磷酸鹽緩沖液+甲醇=80+20（V+V）的比例，出峰30 min后，繼續(xù)調(diào)節(jié)比例，磷酸鹽緩沖液+甲醇=70+30（V+V），出峰時間在4.73 min左右，再調(diào)節(jié)比例為磷酸鹽緩沖液+甲醇=60+40（V+V），出峰時間在3 min 左右，此時檢測添加劑比較適合，但檢測飼料時目標(biāo)峰和部分雜峰無法分開，所以綜合考慮選擇70+30（V+V）的比例。

最終確定流動相為：稱取4 g 無水磷酸氫二鈉于1 000 ml 容量瓶中，用水溶解定容，取該溶液700 ml與300 ml甲醇混合，用磷酸和4 g/l的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為4.5，過0.45 μm濾膜，超聲脫氣。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

分別準(zhǔn)確移取上述1.2.2中的維生素B12標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.05、0.1、0.5、1、2、5、10 ml于10 ml的棕色容量瓶中，用流動相配制成質(zhì)量濃度分別為0.505 4、1.010 8、5.054、10.108、20.216、50.54、101.08 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液，上機測定后得到的線性回歸方程為Y=20 530.7X-2 684.19，r=0.999 975 4，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1 維生素B12標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 穩(wěn)定性

取一份維生素B12添加劑和一份復(fù)合預(yù)混合飼料按1.3 中的前處理方法處理，所得試液在高效液相色譜儀上連續(xù)進(jìn)樣6次，所得的出峰時間和出峰面積如表1。

從表1可以看出，兩份試樣連續(xù)進(jìn)樣6次，其出峰時間和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差都低于0.5%，證明此方法穩(wěn)定性良好。

表1 添加劑、預(yù)混合飼料的出峰時間和峰面積

2.4 回收率

另取維生素預(yù)混合飼料、復(fù)合預(yù)混合飼料、濃縮飼料、配合飼料、豆粕試樣各一份，各稱取4個平行樣，向試樣其中兩份中加入1.2.2中的維生素B12標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1 010.8 μg/ml）0.5 ml，即加標(biāo)505.4 μg，4個平行樣同時使用1.3中的前處理方法處理，測定結(jié)果如表2。

表2 維生素B12回收率測定

從表2可以看出，選取的維生素預(yù)混合飼料回收率為101.5%、99.2%，復(fù)合預(yù)混合飼料回收率為105.9%、97.7%，濃縮料回收率為117.1%、107.6%，配合料回收率為113.2%、109.4%，豆粕回收率為98.9%、96.8%。

選取的五種飼料及飼料原料，回收率均在90%～120%之間，但由于基質(zhì)不同，維生素預(yù)混合飼料、復(fù)合預(yù)混合飼料、豆粕三種樣品的回收率較好，濃縮飼料和配合飼料回收率偏高，可能原因是樣品中本身含有維生素B12，含量很小，被其余雜峰干擾，難以判別維生素B12的目標(biāo)峰。

2.5 最小檢出限

向空白基質(zhì)樣品中以逐級遞減的方式進(jìn)行加標(biāo)試驗，試驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)加標(biāo)濃度為0.05 μg/g 時，目標(biāo)峰峰高約為3 倍基線噪音值，則可得本方法的最小檢出限為0.05 mg/kg，檢出限較國標(biāo)更小，適合檢測的范圍廣，能夠檢測不同含量的維生素B12樣品（如圖2）。

圖2 最小檢出限0.05 mg/kg色譜圖

2.6 方法結(jié)果對比

使用本方法和GB/T 17819—2017《添加劑預(yù)混合飼料中維生素B12的測定 高效液相色譜法》、GB/T 9841—2006《飼料添加劑 維生素B12（氰鈷胺）粉劑》兩種方法分別進(jìn)行對比試驗，檢測同一份維生素B12添加劑樣品時，本方法測定的結(jié)果為0.94%，GB/T 9841—2006 測定的結(jié)果為0.93%，兩者的相對偏差為0.5%，結(jié)果在滿意范圍5%以內(nèi)，檢測同一份預(yù)混合飼料樣品時，本方法測定的結(jié)果為25.1 mg/kg，GB/T 17819—2017 測定的結(jié)果為24.7 mg/kg，兩者的相對偏差為0.8%，結(jié)果在滿意范圍5%以內(nèi)。

通過試驗證明，此方法可以有效檢測飼料添加劑及部分飼料產(chǎn)品，圖3、圖4分別為標(biāo)準(zhǔn)品圖譜和添加劑樣品圖譜。

圖3 維生素B12標(biāo)準(zhǔn)圖譜

圖4 維生素B12飼料添加劑圖譜

3 結(jié)論

試驗證明，本方法測定飼料及飼料添加劑中維生素B12前處理簡單，線性良好，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999 9，穩(wěn)定性好，出峰時間和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于0.5%，回收率高，五種不同種類的飼料及飼料原料的回收率都能達(dá)到90%～120%之間，最小檢出限為0.05 mg/kg，且檢測數(shù)值準(zhǔn)確，和國標(biāo)檢測數(shù)值的相對偏差均在滿意范圍內(nèi)，綜合以上優(yōu)點，本方法值得推廣使用。