不同瓣型騰沖紅花油茶的遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)分析

甘沛華 李 旦 沈德周 周安佩 謝忠利 何承忠，4

( 1. 西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650233；2. 西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650233；3. 西南林業(yè)大學(xué)云南生物多樣性研究院，云南 昆明 650233；4. 西南林業(yè)大學(xué)西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650233)

騰沖紅花油茶（Camellia reticulatef.simplex）隸屬于山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia），是云南山茶花的原始種，被列為國(guó)家二級(jí)珍稀保護(hù)物種[1]。前期資源調(diào)查結(jié)果表明，騰沖紅花油茶屬于窄分布種，為局限性生態(tài)幅物種[2]，自然分布范圍僅限于滇西山地及滇中高原[3]，而其原始天然林集中分布于保山市昌寧縣、騰沖市、隆陽區(qū)，大理州永平縣、云龍縣、南澗縣、巍山縣，臨滄市鳳慶縣，麗江市華坪縣，楚雄州楚雄市[4]。其中，騰沖市打云山以及大麓叢山周圍的云華、中和、固?hào)|和曲石等鄉(xiāng)鎮(zhèn)分布著極其豐富的騰沖紅花油茶天然野生種群，該區(qū)域也是云南山茶的故鄉(xiāng)和起源地[1，5-7]。騰沖紅花油茶的茶油中不飽和脂肪酸含量高達(dá)85%，品質(zhì)優(yōu)良，是一種優(yōu)質(zhì)耐儲(chǔ)藏的食用油[4，8]。同時(shí)，長(zhǎng)期在自由授粉、天然雜交、分布區(qū)小氣候類型多樣等自然因素的綜合作用下，形成了繽紛多樣的花型和花色，為云南八大名花之一的“山茶花”優(yōu)良觀賞品種培育提供了豐富的育種資源[9-11]。因此，騰沖紅花油茶不僅是云南特有的優(yōu)良木本油料樹種，又由于花型多樣，花色豐富，也是觀賞價(jià)值很高的園林綠化樹種，具有巨大的開發(fā)利用潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

騰沖紅花油茶的主要觀賞器官是花朵。在20世紀(jì)30年代，英國(guó)植物學(xué)家Geerge Forrest將騰沖采集到的單瓣類型騰沖紅花油茶命名為C.reticuletavar.simplex，并認(rèn)為是云南山茶的原始種，而Sealy于1958年將騰沖紅花油茶拉丁名修訂為C. reticuletaf.simplex[12]。因此，騰沖紅花油茶最初是指單瓣類型。之后，俞德浚等[13]又根據(jù)花瓣輪數(shù)，初步將騰沖紅花油茶分為單瓣、半重瓣和重瓣3個(gè)類型，在此基礎(chǔ)上，根據(jù)花瓣數(shù)及其輪數(shù)，具體劃分為單瓣組、半重瓣組和重瓣組[1]，司馬永康等[10]利用計(jì)算機(jī)技術(shù)，采用直接觀察計(jì)數(shù)、數(shù)理統(tǒng)計(jì)和數(shù)量分類學(xué)的方法，將云南紅花油茶劃分為騰沖紅花油茶、云南紅花油茶、重瓣紅花油茶和疊瓣紅花油茶4個(gè)變種。沈立新等[9]以花、果性狀與形態(tài)、用途及經(jīng)濟(jì)價(jià)值為依據(jù)，將騰沖紅花油茶劃分為單瓣花系、半重瓣花系、重瓣花系3個(gè)自然類型，進(jìn)一步根據(jù)果形特征等將單瓣花系細(xì)分為5個(gè)品種類群，根據(jù)花的形態(tài)特征等將半重瓣和重瓣花系分別細(xì)分為5個(gè)和10個(gè)品種類群。上述分類主要依據(jù)表型性狀，而表型是基因與環(huán)境共同作用的結(jié)果，受環(huán)境條件影響明顯，表現(xiàn)出較大的可塑性。

AFLP分子標(biāo)記技術(shù)能夠準(zhǔn)確地開展物種鑒別、遺傳多樣性分析以及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系建立等，具有較好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性[14-17]。然而，從分子層面對(duì)不同瓣型騰沖紅花油茶的遺傳多樣性研究尚為空白。為此，本研究以采集于騰沖市騰沖紅花油茶天然野生種群和種質(zhì)資源收集保存基地的3個(gè)自然類型90株個(gè)體為材料，采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)揭示其遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，以期闡明騰沖紅花油茶遺傳變異水平和遺傳變異規(guī)律，為種質(zhì)資源的收集與保存提供科學(xué)依據(jù)，為類型的劃分提供分子證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

依據(jù)沈立新等[9]對(duì)騰沖紅花油茶單瓣、半重瓣與重瓣3個(gè)自然類型的劃分，在盛花期從騰沖市騰沖紅花油茶天然野生種群及種質(zhì)資源保存基地中按不同類型采集樣本，每個(gè)類型采集樣本30份，共計(jì)90份樣本。天然野生種群中同一類型的樣株間隔在30 m以上。采集嫩葉，用變色硅膠快速干燥處理，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。各樣本詳細(xì)信息見表1。

表 1 測(cè)試樣本信息Table 1 Information of the test samples

1.2 測(cè)試樣本總DNA提取

依照Ezup plant genomic DNA prep Kit（上海生工）說明書的步驟提取測(cè)試樣本總DNA，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取DNA的完整性，通過核酸蛋白檢測(cè)儀Agilent 2100（Agilent Technologies，CA，USA）對(duì)DNA的純度和濃度進(jìn)行檢測(cè)，稀釋至50 ng/μL的終濃度，于-20 ℃保存，備用。

1.3 AFLP體系

采用EcoR I +MseI限制性內(nèi)切酶組合對(duì)測(cè)試樣本的總DNA進(jìn)行雙酶切，取4 μL雙酶切產(chǎn)物連接E-adaptor和M-adaptor。以添加接頭后的產(chǎn)物4 μL為模板，采用E00+M00引物組合進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增，將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍作為選擇性擴(kuò)增模板。選擇性PCR擴(kuò)增引物組合方式為E+3+M+3。取選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL與雙指示劑（溴酚藍(lán)+二甲苯青）充分混合后上樣于6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，進(jìn)行選擇性擴(kuò)增引物的篩選。參照IRDyeTMFluoresecent AFLP Kit說明書對(duì)篩選出的選擇性擴(kuò)增引物錨定熒光標(biāo)記，熒光AFLP選擇性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在LI - COR 4300 DNA測(cè)序儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離。PCR擴(kuò)增均在PTC-100TMThermal PCR儀上進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

應(yīng)用GeneMarker V2.2.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行人工校對(duì)，統(tǒng)計(jì)不同樣本同一位置峰值的“有” “無”，轉(zhuǎn)換為1/0數(shù)據(jù)矩陣。采用POPGENE 1.32軟件[18]對(duì)騰沖紅花油茶的3個(gè)自然類型的多態(tài)性條帶百分率（PPB）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）、Shannon’s信息指數(shù)（I）、Nei’s總基因多樣度（Ht）、類型內(nèi)基因多樣度（Hs）、遺傳分化系數(shù)（Gst）、基因流（Nm）以及類型間的Nei’s遺傳距離等參數(shù)進(jìn)行計(jì)算。運(yùn)用AMOVA軟件[19]進(jìn)行3個(gè)類型間的分子方差分析。應(yīng)用MEGA5.0軟件[20]基于Nei’s遺傳距離分別構(gòu)建3個(gè)自然類型和90個(gè)樣株的UPGMA聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 騰沖紅花油茶3個(gè)自然類型的遺傳多樣性

篩選出7對(duì)AFLP引物組合用于騰沖紅花油茶3個(gè)自然類型共90份樣本的遺傳變異分析，共擴(kuò)增得到有效條帶697條，其中多態(tài)性條帶百分率（PPB）為100%，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.361 4，基因多樣性指數(shù)（H）和Shannon’s信息指數(shù)（I）分別為0.257 6和0.421 5，表明騰沖紅花油茶具有豐富的遺傳多樣性。3個(gè)自然類型之間，多態(tài)性條帶百分率（PPBnfp）變化范圍為99.14%～99.71%，平均為99.47%，半重瓣類型的多態(tài)性條帶百分率最高，而單瓣類型最低；有效等位基因數(shù)（Nenfp）變幅為1.347 9～1.377 0，平均為1.361 6，基因多樣性指數(shù)（Hnfp）和Shannon’s信息指數(shù)（Infp）分別介于 0.241 8～0.255 8和0.395 9～0.413 2之間，均值分別為0.248 7和0.404 7，該3個(gè)參數(shù)的最大值均出現(xiàn)在單瓣類型，最小值為重瓣類型（表2）。以基因多樣性指數(shù)為參照，3個(gè)自然類型的遺傳多樣性水平依次為單瓣類型 ＞半重瓣類型 ＞重瓣類型。

表 2 騰沖紅花油茶3個(gè)自然類型的遺傳多樣性Table 2 Genetic diversity of 3 natural floral patterns of C. reticulata f. simplex

2.2 騰沖紅花油茶自然類型的遺傳結(jié)構(gòu)

POPGENE分析結(jié)果顯示，騰沖紅花油茶的總基因多樣度（Ht）為0.257 6，自然類型內(nèi)的基因多樣度（Hs）為0.248 7，不同自然類型之間的基因流（Nm）為13.99，說明不同自然類型之間的基因交流頻繁，不存在基因交流的屏障。遺傳分化系數(shù)（Gst）為0.034 5，表明自然類型之間的遺傳變異僅占總變異的3.45%，而96.55%的遺傳變異存在于自然類型內(nèi)的不同個(gè)體之間。應(yīng)用AMOVA軟件對(duì)3個(gè)自然類型遺傳變異的分子方差分析結(jié)果（表3）顯示，不同自然類型間的基因分化系數(shù)（Φst）為0.056，變異組分為7.76，變異占總變異的5.59%，而自然類型內(nèi)的變異占總變異的94.41%。POPGENE和AMOVA分析結(jié)果均表明，自然類型內(nèi)不同個(gè)體之間的遺傳差異是騰沖紅花油茶遺傳多樣性的主要來源。

表 3 騰沖紅花油茶3個(gè)自然類型的AMOVA分析Table 3 Analysis of molecular variance among 3 natural floral patterns of C. reticulata f. simplex

2.3 遺傳距離與聚類分析

為揭示騰沖紅花油茶3個(gè)自然類型在不同層次上的差異變化，分別以自然類型和個(gè)體作為分析基本單元進(jìn)行遺傳距離的統(tǒng)計(jì)分析。由表4可見，以自然類型為基本單元時(shí)，3個(gè)自然類型之間的遺傳距離變幅為0.016 1～0.021 3，平均為0.017 9，半重瓣類型與重瓣類型之間的遺傳距離最小，其次為單瓣類型與半重瓣類型之間，而單瓣類型與重瓣類型之間的遺傳距離最大。UPGMA聚類結(jié)果顯示，在遺傳距離0.008 2處，3個(gè)自然類型聚為2個(gè)大組，第1組由半重瓣類型和重瓣類型構(gòu)成，第2組僅有單瓣類型（圖1），半重瓣類型和重瓣類型可能由單瓣類型演化而形成。

表 4 騰沖紅花油茶3個(gè)自然類型間遺傳距離Table 4 Genetic distance among 3 natural floral patterns of C. reticulata f. simplex

以騰沖紅花油茶樣本單株為基本單元進(jìn)行分析，3個(gè)自然類型的90個(gè)個(gè)體之間的遺傳距離介于0.268 3～0.671 9，平均為0.498 1。其中，單瓣類型30個(gè)單株之間的遺傳距離變幅在0.268 3～0.606 6，平均為0.481 9；半重瓣類型個(gè)體之間的遺傳距離變化范圍為0.279 6～0.588 4，平均為0.475 6；重瓣類型樣株間的遺傳距離介于0.344 2～0.638 6之間，平均為0.463 3。單瓣類型的單株間遺傳距離變幅最大，說明其個(gè)體遺傳差異較大，遺傳背景較豐富?；?0個(gè)個(gè)體間的遺傳距離UPGMA聚類結(jié)果（圖2）顯示，90個(gè)騰沖紅花油茶單株主要聚分為3個(gè)大組，第1組由單瓣類型16個(gè)個(gè)體（53.33%）構(gòu)成，第2組包含有單瓣類型14個(gè)個(gè)體（46.67%）和半重瓣類型19個(gè)個(gè)體（63.33%），第3大組包含半重瓣類型5個(gè)個(gè)體（16.67%）和重瓣類型27個(gè)個(gè)體（90.00%）。由此可見，騰沖紅花油茶的單瓣類型、半重瓣類型和重瓣類型具有各自的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)，其3個(gè)自然類型劃分具有科學(xué)性和合理性，且半重瓣類型為單瓣類型和重瓣類型的過渡類型。

圖 1 基于Nei’s遺傳距離的騰沖紅花油茶3個(gè)自然類型聚類Fig. 1 UPGMA dendrogram among 3 natural floral patterns of C. reticulata f. simplex based on Nei’s genetic distance

圖 2 基于Nei’s遺傳距離的騰沖紅花油茶90個(gè)單株聚類Fig. 2 UPGMA dendrogram among 90 individuals of C. reticulata f. simplex based on Nei’s genetic distance

3 結(jié)論與討論

前期調(diào)查結(jié)果表明，騰沖紅花油茶的花型與花色[9-11]、果實(shí)形態(tài)[8，21-24]、以及茶油成分組成[8，25-26]等均存在較大的變異，種質(zhì)資源的遺傳背景十分豐富。Xin等[27]采用AFLP標(biāo)記技術(shù)對(duì)采自云南省5個(gè)群體190份樣本云南山茶遺傳多樣性進(jìn)行了分析，4對(duì)AFLP引物共擴(kuò)增出387條帶，其中多態(tài)性條帶百分率為100%，基因多樣性指數(shù)（H）為 0.339 7，Shannon’s信息指數(shù)（I）為 0.523 6，且群體內(nèi)的遺傳變異（96.31%）高于群體間的遺傳變異（3.69%）。Wang等[28]應(yīng)用ISSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)收集于云南省和四川省各3個(gè)群體共114個(gè)樣本的云南山茶（C. reticuleta）遺傳變異進(jìn)行了研究，7對(duì)引物擴(kuò)增得到108條帶，多態(tài)性條帶百分率為88.89%，H和I分別為0.280 9和0.427 8，群體間遺傳分化系數(shù)為0.380 7。劉嬋[29]應(yīng)用ISSR標(biāo)記技術(shù)分析了收集于騰沖市的46個(gè)山茶花品種遺傳多樣性，17對(duì)引物擴(kuò)增出193個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)183個(gè)（94.8%），17對(duì)引物的平均I為2.628。本研究采用熒光AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，篩選出7對(duì)引物組合從90份樣本中擴(kuò)增得到有效條帶679條，多態(tài)性條帶百分率（PPB）為100%，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.361 4，H為0.257 6，I為0.421 5，遺傳分化系數(shù)（Gst）為0.034 5。騰沖紅花油茶的遺傳多樣性參數(shù)相同或略低于云南山茶，可能是騰沖紅花油茶的分布區(qū)域較狹窄，僅分布于云南省楚雄州、保山市、大理州、臨滄市和麗江市的部分區(qū)域，且較集中分布于騰沖市境內(nèi)，而云南山茶的分布區(qū)域從云南省的滇中、滇西、滇西北地區(qū)延伸至四川省的涼山州、攀枝花市以及貴州省的部分地區(qū)。但騰沖紅花油茶與云南山茶的遺傳變異規(guī)律相同，均為群體內(nèi)的遺傳變異大于群體間的遺傳變異。因此，加強(qiáng)對(duì)其現(xiàn)存?zhèn)€體的保護(hù)，將是保護(hù)騰沖紅花油茶遺傳多樣性的有效措施。

本研究采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)依據(jù)單瓣、半重瓣和重瓣3個(gè)自然類型分類系統(tǒng)采集的各類型30份樣本共計(jì)90個(gè)單株基于Nei’s遺傳距離進(jìn)行聚類分析，單瓣類型的30個(gè)個(gè)體被聚分為2個(gè)分支，16個(gè)單株處于同一分支，其余14個(gè)單株與半重瓣類型19個(gè)單株聚于一個(gè)分支，而重瓣類型的27個(gè)單株與半重瓣類型5個(gè)單株相聚構(gòu)成一個(gè)分支。由此可見，單瓣、半重瓣和重瓣類型在DNA水平存在差異，具有各自獨(dú)特的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)，表明騰沖紅花油茶劃分為單瓣、半重瓣和重瓣3個(gè)自然類型具有一定的科學(xué)性和合理性。同時(shí)，本研究結(jié)果也支持半重瓣為單瓣與重瓣騰沖紅花油茶的過渡類型[9，11]。而將云南紅花油茶劃分為騰沖紅花油茶（C. reticulatef.simplex）、云南紅花油茶（C.reticulatevar.reticulate）、重瓣紅花油茶（C.reticulatevar.pleiopetala）和疊瓣紅花油茶（C.reticulatevar.Pleistopetala）4個(gè)變種是否具有分子水平依據(jù)，有待于進(jìn)一步研究。