HPLC法比較哈蟆油和哈蟆卵中1-甲基海因的含量

鮑慧瑋，徐陽(yáng)，王永生，王詩(shī)涵

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 130117；2.長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，長(zhǎng)春 130031；3.吉林大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 130000；4.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春 130000）

中國(guó)林蛙（Rana temporaria chensinensis David）為蛙科動(dòng)物的一種，主要分布在我國(guó)東北地區(qū)，其輸卵管的干制品是東北道地藥材—哈蟆油[1]。有關(guān)哈蟆油的研究越來(lái)越全面、深入[2]，其中藥效成分之一的1-甲基海因在鎮(zhèn)咳和抗炎等方面具有良好的藥效作用[3-4]，是《中國(guó)藥典》中哈蟆油鑒別的指標(biāo)性成分[5-6]。哈蟆卵同樣是中國(guó)林蛙的一部分重要產(chǎn)物，其產(chǎn)量與哈蟆油相近，但是往往被忽視。哈蟆卵現(xiàn)有的藥理研究發(fā)現(xiàn)，哈蟆卵具有抑制血小板聚集、降低血脂、抗自由基、抗氧化、減少體內(nèi)過(guò)氧化脂質(zhì)的生成等作用，同樣具有臨床應(yīng)用意義。本試驗(yàn)建立HPLC法測(cè)定1-甲基海因含量的方法，并比較其在哈蟆油和哈蟆卵中的含量，為哈蟆卵的進(jìn)一步發(fā)展提供理論依據(jù)，促進(jìn)林蛙產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-10A型高效液相色譜儀、UV檢測(cè)器、N-2000工作站（日本島津公司）；KQ-250型超聲波處理器（昆山市超聲儀器有限公司）；CPA-225D型電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 材料

哈蟆油樣品、哈蟆卵樣品由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)姜大成教授鑒定為蛙科動(dòng)物中國(guó)林蛙（R.temporaria chensinensis David）的輸卵管和卵的干制品；1-甲基海因?qū)φ掌罚执髮W(xué)藥學(xué)院天然藥化實(shí)驗(yàn)室自制，純度＞99%）；甲醇（色譜純，美國(guó)Fisher公司）；水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；二氯甲烷（分析級(jí)，北京化工廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Venusil MP-C1（8 4.6 mm 150 mm，5m）；流動(dòng)相：水（100%）；檢測(cè)波長(zhǎng)：215nm；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5L；理論塔板數(shù)：＞3 000；分離度：＞1.5，符合《中國(guó)藥典》2015年版規(guī)定。

2.2 溶液配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 取1-甲基海因?qū)φ掌?mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度。精密量取0.2mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得0.019 4 mg/mL的1-甲基海因?qū)φ掌贰?/p>

2.2.2 供試品溶液的配制 哈蟆油供試品溶液的配制：稱(chēng)取哈蟆油供試品5.0g，置于錐形瓶中，加入二氯甲烷100 mL，超聲10 min，過(guò)濾。將濾渣倒回錐形瓶?jī)?nèi)，再加入二氯甲烷100mL，超聲10min，過(guò)濾。將濾液旋干，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移置5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得。

哈蟆卵供試品溶液的配制：稱(chēng)取哈蟆卵供試品5.0g，置于錐形瓶中，加入二氯甲烷100mL，超聲10min，過(guò)濾。將濾渣倒回錐形瓶?jī)?nèi)，再加入二氯甲烷100 mL，超聲10 min，過(guò)濾。將濾液旋干，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移置5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

圖1表明，供試品溶液均得到較好的分離，其色譜峰保留時(shí)間與對(duì)照品一致，陰性樣品溶液中未見(jiàn)此種成分的色譜峰。

圖1 1-甲基海因高效液相色譜圖Fig.1 1-Methyl hydantoin high performance liquid chromatography

2.4 方法學(xué)試驗(yàn)

2.4.1 線性關(guān)系試驗(yàn) 精密稱(chēng)取17.555 mg 1-甲基海因?qū)φ掌?，?0mL容量瓶中，加入適量甲醇溶解，定容至刻度，即為35.11g/mL的1-甲基海因線性母液。分別精密吸取 1.0、0.5、0.3、0.2、0.1 mL 線性母液，置10mL容量瓶中，即得濃度分別為3.511、1.756、1.053、0.702、0.351g/mL的線性溶液。依次將線性溶液和母液注入高效液相色譜儀中，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰面積。以對(duì)照品濃度（X）為橫坐標(biāo)、色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=2 271.8X+268.09（r=0.999 9），表明1-甲基海因在 35.110 0～0.351 1g/mL峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取1-甲基海因?qū)φ掌啡芤?、哈蟆油供試品溶液、哈蟆油卵供試品溶液?0L，注入高效液相色譜儀中，連續(xù)分析6次，計(jì)算峰面積的RSD值分別為0.31%、1.82%、1.10%，表明在此試驗(yàn)條件下精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取哈蟆油和哈蟆卵供試品溶液，分別在室溫放置0、2、4、6、8、12、24h，依法進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果RSD值分別為0.98%和1.22%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品各6份，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備哈蟆油和哈蟆卵供試品溶液，依法進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果RSD值分別為1.08%和1.63%，表明含量測(cè)定方法重復(fù)性良好。

表1 哈蟆油和哈蟆卵回收率結(jié)果Table 1 Results of recovery rate in oviductus ranae and wood frogs spawn

2.5 哈蟆油和哈蟆卵中1-甲基海因含量的測(cè)定

分別取不同批次哈蟆油樣品粉末和哈蟆卵樣品粉末，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依次注入高效液相色譜儀，進(jìn)行含量測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算1-甲基海因含量。結(jié)果（表2），哈蟆卵中1-甲基海因含量較哈蟆油高。

表2 哈蟆油和哈蟆卵中1-甲基海因含量Table 2 Contents of 1-methyl hydantoin in oviductus ranae and wood frogs spawn （g/g）

3 討論

本試驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定哈蟆油和哈蟆卵中1-甲基海因的含量。雖然《中國(guó)藥典》2015年版中明確了哈蟆油的鑒別方法就是以1-甲基海因作為標(biāo)志物采用HPLC法進(jìn)行鑒別，但是同為中國(guó)林蛙副產(chǎn)物的哈蟆卵中1-甲基海因的含量卻并沒(méi)有報(bào)道過(guò)[7-8]。

哈蟆卵具有抗焦慮、抗驚厥、抗疲勞、降血脂、抗氧化等藥理作用[9-15]，這一發(fā)現(xiàn)可以改變哈蟆卵作為廢棄物的現(xiàn)狀，隨之的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法就極為重要。本試驗(yàn)首次測(cè)定了哈蟆卵中1-甲基海因的含量，并與哈蟆油進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，哈蟆卵中同樣含有1-甲基海因，且含量較哈蟆油高，這不僅為哈蟆卵的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了方法，還為其今后的研究指明了方向。