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    不同產(chǎn)地赤芝藥材的HPLC指紋圖譜建立及聚類分析△

    2019-07-03 01:52:12段曉穎陳霄馬秋瑩牛曉靜翟海容
    中國現(xiàn)代中藥 2019年5期
    關(guān)鍵詞:號峰靈芝產(chǎn)地

    段曉穎,陳霄,馬秋瑩,牛曉靜,翟海容

    1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實驗室,河南 鄭州 450000;2.河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,河南 鄭州 450000;3.商丘市中醫(yī)院,河南 商丘 476000;4.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實驗室,河南 鄭州 450000;5.江蘇正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司,江蘇 南京 210000

    中藥現(xiàn)代化研究的重要任務(wù)之一就是建立一套客觀的質(zhì)量控制方法用以規(guī)范、指導(dǎo)中藥材的炮制加工和中成藥的生產(chǎn)。建立中藥指紋圖譜的目的就在于將中藥質(zhì)量控制模式與化學(xué)藥品區(qū)別開來,充分體現(xiàn)中藥的整體效應(yīng)。中藥指紋圖譜是中藥材經(jīng)適當(dāng)處理后,采用一定的分析手段和儀器測得的、能夠標(biāo)識該中藥材各種組分群體特性的共有峰的圖譜,是借用DNA指紋圖譜發(fā)展而來的概念[1]。該技術(shù)是中藥質(zhì)量控制的有效解決方案,其中相似度的計算被認為是能夠客觀、全面地反映中藥色譜指紋圖譜之間相似情況的一種有效評價手段,計算相似度可以定量地衡量兩指紋圖譜之間的相似程度。本實驗通過建立指紋圖譜結(jié)合聚類分析法對10個產(chǎn)地的赤芝藥材的不同指標(biāo)變量進行分析,從而比較各個變量之間的相關(guān)性,將相似的變量提取出來,減少了分析變量的個數(shù),使其更適用于各個變量間的相關(guān)分析[2-5]。

    靈芝含有多種化學(xué)成分,如三萜類化合物、靈芝多糖、生物堿、核苷等有效成分,其中三萜類化合物為靈芝主要的有效成分,具有多種生理活性[6-7]。《中國人民共和國藥典》2015版一部收載靈芝藥材項下包括赤芝和紫芝兩個品種,靈芝大部分為栽培品種且多為赤芝,該品種為多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.的干燥子實體。據(jù)報道,紫芝與赤芝的指紋圖譜共有模式存在很大區(qū)別,在紫芝中未檢測到靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C2、赤芝酸A、靈芝酸G、靈芝酸E 6種成分[8]。有報道稱紫芝中含三萜酸的量明顯比赤芝少[9],筆者在研究中也發(fā)現(xiàn),赤芝中總?cè)瞥煞指哂谧现?,因此確定赤芝這一品種作為研究對象。本文采用高效液相色譜法對不同產(chǎn)地赤芝藥材進行分析,利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件得到能夠體現(xiàn)赤芝藥材質(zhì)量的指紋圖譜,并進行聚類分析,為不同產(chǎn)地赤芝藥材的鑒別和質(zhì)量控制提供依據(jù)[10-12]。

    1 材料

    1.1 儀器

    Aglient 1260高效液相色譜儀;AEL-200電子天平(日本島津公司);Sartorius CP225D電子天平;HK250科導(dǎo)臺式超聲波清洗器(上海漢克科學(xué)儀器有限公司)。

    1.2 試藥

    靈芝酸A(140324)、靈芝酸G(140504)(成都普菲德生物技術(shù)有限公司);乙腈、甲醇、磷酸為色譜純;其他試劑均為分析純。

    赤芝藥材經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院陳天朝主任藥師鑒定為多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.的干燥子實體。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 10批赤芝藥材來源及含量測定

    按照2015版《中華人民共和國藥典》一部靈芝項下方法測定10批不同來源赤芝中三萜及甾醇含量,見表1。

    表1 10批赤芝藥材批號、產(chǎn)地與三萜及甾醇含量 %

    結(jié)果表明,三萜及甾醇含量符合《中華人民共和國藥典》2015版規(guī)定(不得少于0.5%)。

    2.2 色譜條件

    色譜柱:ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相:A乙腈-B 0.2%磷酸水,檢測波長:254 nm;柱溫:30 ℃;進樣量:10 uL;流速:1.0 mL·min-1;信號采集時間:90 min,梯度洗脫程序:0~30 min,33%~34%A;30~60 min,34%~80%A;60~70 min,80%~100%A;70~75 min,100%~33%A;75~90 min,33%A[10]。

    2.3 對照品溶液的制備

    精密稱取靈芝酸A、靈芝酸G對照品適量,加甲醇制成每1 mL含靈芝酸A 80.48 μg、靈芝酸G 86.40 μg的對照品溶液。

    2.4 供試品溶液的制備

    稱取赤芝藥材粉末約1 g,精密稱定,精密加入無水乙醇50 mL,稱定質(zhì)量,回流60 min,放冷,稱質(zhì)量,用無水乙醇補足質(zhì)量。濾過,取續(xù)濾液,用0.22 μm微孔濾膜濾過,備用[11]。

    2.5 測定法

    以靈芝酸A、靈芝酸G為參照物,照上述色譜條件測定并記錄色譜圖,利用“中藥色譜指紋圖譜相似性評價系統(tǒng)(2004A版)”軟件構(gòu)建10批樣品色譜圖,見圖1~2。

    注:1.靈芝酸G對照品;2.靈芝酸A對照品。圖1 混合對照品HPLC圖

    圖2 赤芝HPLC指紋圖譜

    圖3 10批赤芝藥材HPLC圖

    2.6 方法學(xué)考察

    2.6.1 精密度試驗 取批號為140304-1赤芝藥材制備的供試品溶液,連續(xù)進樣5次,記錄各共有色譜峰的保留時間和峰面積,各主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積比值無明顯變化,RSD分別為0.01%~0.28%和00.06%~2.74%,說明精密度良好[12]。

    2.6.2 重復(fù)性試驗 取批號為140304-1赤芝藥材5份,分別制備成供試品溶液,進樣測定,記錄各共有峰的保留時間和峰面積,各主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積比值無明顯變化,RSD分別為0.01%~0.45%和0.14%~2.86%,結(jié)果表明重復(fù)性良好。

    2.6.3 穩(wěn)定性試驗 取上述赤芝藥材制備的供試品溶液,分別在0、6、12、18、24、30 h進樣,記錄各共有峰的保留時間和峰面積,結(jié)果表明,各主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積比值無明顯變化,RSD分別為0.01%~0.19%和0.35%~5.31%,結(jié)果表明穩(wěn)定性良好。

    2.7 不同產(chǎn)地赤芝藥材指紋圖譜的構(gòu)建和相關(guān)技術(shù)參數(shù)

    在上述條件下,共測定了10批赤芝藥材,標(biāo)定出31個共有峰,見圖1~2。其中10批樣品共有峰面積占總峰面積比值平均值為71.77%,非共有峰面積占28.23%,對比混合對照品的各色譜峰保留時間,確定2個主成分色譜峰[13]。在31個共有峰中,5號峰為靈芝酸G,6號峰為靈芝酸A。其中6號峰在10批樣品中的峰面積和保留時間均較穩(wěn)定,且分離較好,故選擇6號峰為參照峰S,計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積[14],見表2~3。

    表2 10批赤芝藥材指紋圖譜共有峰相對保留時間

    續(xù)表2

    表3 10批赤芝藥材指紋圖譜共有峰相對峰面積

    續(xù)表3

    2.8 數(shù)據(jù)處理

    2.8.1 不同產(chǎn)地赤芝藥材相似度分析 利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版)”軟件,將實驗數(shù)據(jù)導(dǎo)入,以相關(guān)系數(shù)(中位數(shù)和平均數(shù))代表其相似度,10批赤芝藥材的相似度結(jié)果見表4。

    表4 10批赤芝藥材指紋圖譜相似度結(jié)果

    由表3可知,不同方法所得相似度結(jié)果趨于一致,10批樣品之間相似度均在0.9以上,符合中藥色譜指紋圖譜相似度技術(shù)要求。

    2.8.2 不同產(chǎn)地赤芝藥材聚類分析 對10批不同產(chǎn)地、不同批號的赤芝做指紋圖譜分析,獲得了包括靈芝酸G(5號峰)、靈芝酸A(6號峰)在內(nèi)的31個共有色譜峰[15],將各共有色譜峰相對于參比峰的峰面積進行量化,得到10×31階原始數(shù)據(jù)矩陣,代入SPASS20.0統(tǒng)計軟件,采用系統(tǒng)聚類法,以歐式距離為測度[16],對10批赤芝藥材各共有峰的峰面積進行分析,生成平均聯(lián)接組間樹狀圖,見圖4,聚類分析將10批藥材分成4類,其中3、4、5、6、7、9號樣品聚為第一類,該類樣品均為安徽產(chǎn)赤芝藥材[17];1號和10號樣品聚為第二類,2號樣品單獨聚為第三類,1、2、10號樣品均為山東產(chǎn)赤芝藥材,但聚類分析并未聚為一類,可能因為2號樣品的16號、17號峰的相對峰面積與1、10號樣品有一定差距;8號樣品為湖南產(chǎn)赤芝藥材,聚為第四類,從相對峰面積可以看出8號樣品的5、16、17、19、27、30、31號峰均與其他批號的產(chǎn)品峰面積相差較大,因此將其單獨聚為一類[18]。該聚類分析說明不同產(chǎn)地靈芝藥材中所含三萜類成分相差較大,產(chǎn)地之間有顯著性差異。

    圖4 10批靈芝藥材聚類分析樹狀圖

    3 討論

    3.1 提取方式和提取溶劑的選擇

    本文首先考察了超聲和回流兩種提取方法,結(jié)果發(fā)現(xiàn),回流提取檢測出的色譜峰較多,故選擇回流提取方法;選用三氯甲烷、甲醇、乙醇3種溶劑進行提取,發(fā)現(xiàn)三氯甲烷提取時,僅有少量峰被檢測出來,甲醇回流提取時雜質(zhì)峰較多,靈芝酸A未能和其他峰達到較好分離,而無水乙醇提取時靈芝酸A能得到較好分離,因此選擇無水乙醇回流提取。

    3.2 流動相的確定

    本實驗分別采用了5個流動相系統(tǒng):乙腈-0.2%磷酸水;乙腈-0.03%磷酸水;乙腈-0.04%甲酸水;乙腈-0.1%甲酸水;乙腈-0.1%醋酸水。結(jié)果表明,乙腈-0.2%磷酸水系統(tǒng)為流動相,洗脫出色譜峰較多,且各色譜峰分離效果較好,因此選擇乙腈-0.2%磷酸水系統(tǒng)為流動相。

    3.3 柱溫的選擇

    柱溫的選擇是影響指紋圖譜的重要因素之一。本實驗首先在20 ℃柱溫下進行洗脫,結(jié)果發(fā)現(xiàn),該條件下基線漂移非常嚴(yán)重,而選擇30 ℃柱溫進行洗脫,基線基本平穩(wěn),各色譜峰也能較好地被洗脫出來。

    3.4 檢測波長的選擇

    采用Agilent 1260 DAD檢測器對樣品進行全波長掃描,綜合考慮參照峰(3、4)和其他成分的吸收,根據(jù)3D-plot圖譜,在254 nm處檢測的圖譜信息量較多,峰形較好,mAU值較大,溶劑干擾少,基線平穩(wěn),因此選擇檢測波長為254 nm。

    3.5 洗脫程序的優(yōu)化

    赤芝藥材成分復(fù)雜,報道分離出的三萜類成分就有150余種,且含量較低,等度洗脫很難在保證較好分離度的情況下完全洗脫出來,故采用梯度進行洗脫分離。分離時,初始乙腈比例為25%時,各成分峰的Rt較大,前45 min內(nèi)幾乎無峰,擴大有機相比例為33%時,各成分峰的Rt大大縮小,對照品靈芝酸G在15 min左右出峰,靈芝酸A在22 min左右出峰,洗脫90 min將絕大部分三萜類成分洗脫出來,因此以初始有機相33%的比例進行洗脫,篩選出最佳梯度:0~30 min,33%~34%乙腈;30~60 min,34%~80%乙腈;60~70 min,80%~100%乙腈;70~75 min,100%~33%乙腈;75~90 min,33%乙腈。

    4 總結(jié)

    本文分別用中位數(shù)和平均數(shù)計算了10批赤芝樣品的相似度,結(jié)果顯示,3個產(chǎn)地10批樣品之間相似度均較高,未將質(zhì)量區(qū)別開,但通過聚類分析發(fā)現(xiàn),赤芝質(zhì)量與產(chǎn)地具有較高相關(guān)性,基本上同一產(chǎn)地可以聚為一類,不同產(chǎn)地之間質(zhì)量還是有差別的。聚類分析與相似度分析結(jié)果并不完全相同,說明僅靠相似度分析并不能作為赤芝藥材質(zhì)量鑒別的精細與科學(xué)的方法。本文利用相似度結(jié)合聚類分析,為赤芝藥材的質(zhì)量評價提供了可靠依據(jù),也為其質(zhì)量控制提供了更全面的信息。檢索多篇關(guān)于赤芝藥材指紋圖譜文獻,發(fā)現(xiàn)將指紋圖譜與聚類分析相結(jié)合對其產(chǎn)地進行分析和歸屬的報道較少,因此本文對赤芝不同產(chǎn)地的質(zhì)量研究具有一定的指導(dǎo)意義。

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