響應(yīng)面法優(yōu)化黃芩莖葉對照提取物純化工藝及其特征圖譜研究△

張雅蓉，徐犇，李納，劉吉爽，徐文慧，陳新

長春中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，吉林 長春 130117

黃芩莖葉為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥莖葉，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效[1]。主要含野黃芩苷、芹菜素苷等黃酮類化合物[2]，有效部位為黃芩莖葉總黃酮，現(xiàn)已有“倒掛品種[3]”黃芩莖葉解毒膠囊上市銷售，用于治療上呼吸道感染疾病。

以中藥對照提取物為代表的質(zhì)量控制方法已成為一種新的研究思路和模式，近幾年，多種藥材的對照提取物[4-7]研究均取得了初步成效，不僅可用于藥材的薄層定性鑒別，也可以標(biāo)示多個單體成分的含量[8]。本實驗通過研究黃芩莖葉總黃酮純化工藝以及特征圖譜，為制備黃芩莖葉對照提取物提供參考，將有助于改善檢驗工作時使用化學(xué)對照品(中藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))檢驗信息單一、價格高昂，制備對照藥材溶液過程繁瑣的狀況，有利于質(zhì)檢工作高效進行。

1 材料

1.1 儀器

1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；WondaSil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本島津公司)；AB265-S十萬分之一分析天平(瑞士梅特勒托利多公司)；GZX-9240MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司設(shè)備廠)；UV-1810紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 試劑

野黃芩苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，純度：91.7%，批號：110842-201709)；野黃芩素對照品(上海源葉生物科技有限公司，純度>98%，批號：YY91209-20)；甲醇[上海西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，色譜純]；甲酸(天津市光復(fù)精細化工研究所，色譜純)；純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)；大孔吸附樹脂D101(東鴻化工有限公司)；AB-8(天津市光復(fù)精細化工研究所)；DM130(北京索來寶化工有限公司)；ADS-7(天津鴻博美化工科技有限公司)；XDA-1(西安藍曉科技新材料有限公司)；其他試劑均為分析純。

1.3 試藥

本次共收集樣品11批，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)張景龍教授鑒定，均為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi。樣品經(jīng)自然風(fēng)干后，切段，50 ℃干燥，粉碎，過二號篩，備用。樣品詳情見表1。

表1 樣品信息

注：HQJY為黃芩莖葉拼音首字母縮寫。

2 方法與結(jié)果

2.1 粗提物制備

取干燥黃芩莖葉適量，加入8倍量的70%乙醇溶液，回流2次，各1 h，過濾，回收乙醇，干燥(60 ℃)，即得。

2.2 對照提取物純化

精密稱取粗提物適量，加水配制成質(zhì)量濃度為30.0 mg·mL-1的溶液，加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH為2～3，放置12 h[9]，離心，沉淀備用，上清液作為上樣液，大孔吸附樹脂吸附2 h，6 BV水洗至中性，再用不同濃度乙醇以相應(yīng)流速洗脫，收集洗脫液。上述沉淀用水洗至中性，再用乙醇溶解，與洗脫乙醇液混合，回收乙醇，干燥，即為對照提取物。

2.3 總黃酮的含量測定方法

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取野黃芩苷對照品10.0 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容，搖勻，即為對照品溶液。精密吸取上述溶液0.4、0.8、1.2、1.8、2.4 mL至10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻線，以甲醇作空白，在波長為285 nm處測定野黃芩苷的吸光度(A)值。以野黃芩苷濃度(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，吸光度(A值)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=15.082X+0.044 3(r=0.998 2)，野黃芩苷在0.007 3～0.044 0 mg·mL-1線性良好。

2.3.2 供試品溶液制備 取黃芩莖葉對照提取物干燥粉末20 mg，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加甲醇超聲處理20 min后，定容至刻線，搖勻，再取1.0 mL至100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，即得。

2.3.3 精密度試驗 取2.3.1項下野黃芩苷對照品溶液，連續(xù)測定6次吸光度(A)值，RSD為0.26%，表明本方法所用儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 按照2.3.2項下方法得樣品溶液，測定10、20、30、40、50、60 min時吸光度(A)值，RSD為0.42%，表明溶液穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗 取同一批黃芩莖葉對照提取物干燥粉末6份，各20 mg，按2.3.2項下方法得樣品溶液，測定各樣品吸光度值(A)，RSD為0.77%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 準(zhǔn)確度試驗 精密稱定黃芩莖葉對照提取物(總黃酮質(zhì)量分數(shù)56.49%)6份，各10 mg，分別置于100 mL量瓶中，加入一定量野黃芩苷對照品，再照2.3.2方法制備樣品溶液，測定吸光度(A)值，計算回收率，結(jié)果見表2，總黃酮平均回收率為97.66%，RSD為0.82%，準(zhǔn)確度符合要求。

2.4 大孔吸附樹脂型號篩選

取預(yù)處理好的D101(非極性)、AB-8(弱極性)、DM130(中極性)、ADS-7(強極性)及XDA-1(極性)大孔樹脂各25 mL，分別裝于5根樹脂柱(20 cm×1.5 cm)中，加入上樣液8.0 mL，流速為1 mL·min-1，用6 BV水洗除去提取物中的水溶性多糖、無機鹽離子等雜質(zhì)，再用4 BV的95%乙醇洗脫，流速為1 mL·min-1，合并洗脫液。按照2.2項下方法測定總黃酮含量，計算吸附率和解吸率。計算結(jié)果見圖1。AB-8型大孔吸附樹脂的吸附效果和解吸效果明顯優(yōu)于其他型號，且更為經(jīng)濟，因此，選擇AB-8型大孔吸附樹脂對黃芩莖葉對照提取物進行純化。公式如下。

(1)

(2)

C0：上樣液總黃酮的濃度，V0：上樣液體積；

C1：水洗液總黃酮的濃度，V1：水洗液體積；

C2：洗脫液總黃酮的濃度，V2：洗脫液體積。

圖1 吸附率和解吸率實驗結(jié)果(n=2)

2.5 泄漏曲線

取黃芩莖葉上樣液150.0 mL，上樣至裝有AB-8大孔吸附樹脂25 mL的樹脂柱(20 cm×1.5 cm)中，流速為1 mL·min-1，流出液每10 mL收集一份，收集15份停止，測定黃芩莖葉總黃酮含量，以收集次數(shù)為橫坐標(biāo)，總黃酮含量為縱坐標(biāo)，繪制泄漏曲線，見圖2。當(dāng)收集到第5份，即約為2倍柱體積時，總黃酮開始大量泄漏，故確定泄漏點為50 mL，即每1 mLAB-8型大孔樹脂的上樣量最多不能超過2 mL。

圖2 泄漏曲線(AB-8型)

表2 準(zhǔn)確度試驗結(jié)果(n=6)

2.6 單因素考察

2.6.1 上樣流速 取黃芩莖葉上樣液50.0 mL至裝有AB-8大孔吸附樹脂25 mL的樹脂柱(20 cm×1.5 cm)中，以流速0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL·min-1分別上樣，上樣完成后吸附2 h，6 BV水除雜，流速為2 mL·min-1，95%乙醇洗脫，流速為4 mL·min-1，6 BV體積洗脫。收集洗脫液，測定總黃酮含量，結(jié)果見圖3。總黃酮含量最高時，流速為1.5 mL·min-1，因此，上樣流速應(yīng)當(dāng)控制在1.5 mL·min-1。

圖3 上樣流速選擇

2.6.2 洗脫溶劑 取黃芩莖葉上樣液50.0 mL至裝有AB-8大孔吸附樹脂25 mL的樹脂柱(20 cm×1.5 cm)中，以流速1.5 mL·min-1上樣，上樣完成后吸附2 h，6 BV水除雜，流速為2 mL·min-1，繼續(xù)分別以30%、50%、60%、70%、80%、95%乙醇洗脫，流速為4 mL·min-1，洗脫6 BV體積。收集洗脫液，測定總黃酮含量，結(jié)果見圖4。總黃酮含量較高的是60%～95%乙醇洗脫液，綜合考慮以70%乙醇進行洗脫純化。

圖4 洗脫溶劑選擇

2.6.3 洗脫體積 取黃芩莖葉上樣液50.0 mL至裝有AB-8大孔吸附樹脂25 mL的樹脂柱(20 cm×1.5 cm)中，以流速1.5 mL·min-1上樣，上樣完成后吸附2 h，6 BV水除雜，流速為2 mL·min-1，然后用70%乙醇洗脫，流速為3 mL·min-1，洗脫體積分別為2、3、4、5、6、7 BV。收集洗脫液，測定總黃酮含量，結(jié)果如圖5，總黃酮含量隨著洗脫體積的增大而不斷變化，當(dāng)洗脫流速超過5 BV后，再增大洗脫體積，總黃酮含量增幅不大，由此，洗脫體積控制在5 BV最佳。

圖5 洗脫體積選擇

2.6.4 洗脫流速 取黃芩莖葉上樣液50.0 mL至裝有AB-8大孔吸附樹脂25 mL的樹脂柱(20 cm×1.5 cm)中，以流速1.5 mL·min-1上樣，上樣完成后吸附2 h，用6 BV水除雜，流速為2 mL·min-1，繼續(xù)用70%乙醇洗脫，流速為1、2、3、4、5、6 mL·min-1，5 BV體積洗脫。收集洗脫液，測定總黃酮的含量，結(jié)果如圖6?？傸S酮含量隨著洗脫流速的增大在不斷變化，當(dāng)洗脫流速為4 mL·min-1時，總黃酮含量最高，由此，洗脫流速控制在4 mL·min-1最佳。

圖6 洗脫流速選擇

2.7 響應(yīng)面法優(yōu)化黃芩莖葉總黃酮純化工藝

2.7.1 試驗設(shè)計方法 在單因素試驗基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Benhnken(中心組合)試驗設(shè)計原理，以A(乙醇濃度)、B(上樣流速)、C(洗脫體積)、D(洗脫流速)為自變量，Y(總黃酮含量)為評價指標(biāo)進行設(shè)計，見表3～4。

表3 響應(yīng)面試驗因素水平表

表4 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果 %

2.7.2 模型建立與顯著性分析 采用Design-Expert 10.0.3軟件對數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，建立二次多元回歸方程Y=65.58+1.68A+0.84B+1.55C+0.44D-0.16AB-1.12AC-0.58 AD+0.62BC-0.067BD+0.30CD+0.52A2-1.46B2-1.25C2-1.47D2，數(shù)據(jù)模型方差分析結(jié)果見表5。

由F值可知，4個因素對總黃酮含量顯著性影響的順序為A>C>B>D。由P值可知，模型一次項A、B、C，交互項AC，二次項B2、C2、D2為極顯著項(P<0.01)，模型一次項D，二次項A2為顯著項(0.010.05)。

根據(jù)上述回歸方程，繪制各因素交互作用的三維響應(yīng)曲面圖及等高線圖，見圖7～8。響應(yīng)曲面較陡和橢圓形等高線說明兩試驗因素交互作用顯著，響應(yīng)曲面較平和圓形等高線說明交互作用不顯著[10]。因此，黃芩莖葉總黃酮含量受A(乙醇濃度)、B(上樣流速)、C(洗脫體積)、D(洗脫流速)四者的共同影響。首先，本實驗采用AB-8型(弱極性)大孔樹脂，黃芩莖葉所含黃酮成分為弱極性分子，故高濃度乙醇有利于該類成分洗脫，但當(dāng)乙醇濃度超過80%時，洗脫液中醇溶性雜質(zhì)逐漸增多，導(dǎo)致總黃酮含量下降。其次，上樣流速慢，不僅延長操作時間，還會使樹脂與黃酮類化合物產(chǎn)生死吸附，增加洗脫難度，降低收率。再次，洗脫體積量過小，導(dǎo)致洗脫成分未完全流出樹脂柱，降低收率；洗脫體積量過大，總黃酮含量變化增幅不明顯，溶劑消耗增加。最后，洗脫流速過大，導(dǎo)致洗脫成分未與大孔樹脂上的黃酮分子吸附就已隨洗脫劑流出，并且體積流量過小會延長洗脫工作時間，降低洗脫效率。

表5 方差分析結(jié)果

注：P<0.01表明差異有統(tǒng)計意義；“—”為差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.7.3 驗證性實驗 根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面實驗優(yōu)化結(jié)果，得到最佳方案為乙醇濃度76.527%，上樣流速1.703 mL·min-1，洗脫體積5.441 BV，洗脫流速4.129 mL·min-1。結(jié)合實際情況，確定純化條件為乙醇濃度80%，上樣流速1.5 mL·min-1，洗脫體積5 BV，洗脫流速4 mL·min-1。采用優(yōu)化后的方法對黃芩莖葉進行純化制得對照提取物，測得3批對照提取物總黃酮質(zhì)量分數(shù)分別為66.93%、66.86%、66.71%，平均值為66.83%，理論值為67.19%，RSD為0.38%，表明預(yù)測值與真實值接近，說明該實驗設(shè)計和數(shù)學(xué)模型合理可靠，可用于純化黃芩莖葉對照提取物。

圖7 各因素兩兩交互等高線圖

圖8 各因素兩兩交互響應(yīng)曲面圖

2.8 對照提取物特征圖譜的建立

2.8.1 色譜條件 色譜柱：島津WondaSil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，甲醇(A)-0.02%甲酸溶液(B)，梯度洗脫(0～40 min，34%～64.67%A)；檢測波長：335 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10 μL。

2.8.2 參照物溶液制備 取野黃芩苷、野黃芩素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含野黃芩苷0.10 mg的溶液，每1 mL含野黃芩素0.05 mg的溶液，即得。

2.8.3 供試品溶液制備 取黃芩莖葉對照提取物20 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇超聲處理30 min，用甲醇定容至刻線，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.8.4 共有峰模式和參照峰的確定 取11批黃芩莖葉藥材，按照響應(yīng)面法優(yōu)化的對照提取物純化工藝制得樣品(S1～S11)，并照2.8.1項下方法，依次進行高效液相分析，參照物色譜圖見圖9。在所有樣品圖譜中2號峰(野黃芩苷)分離度良好、峰面積較大且穩(wěn)定，所以確定2號峰為參照峰(S)，計算其他特征峰的相對保留時間和相對保留峰面積的RSD值，各共有峰的相對保留時間RSD值為0.12%～0.40%；相對峰面積RSD值為8.03%～36.05%，具有顯著差異。

2.8.5 重復(fù)性試驗 取同一批樣品(S1)，制備6份樣品溶液，按照2.8.1項下方法進樣，以野黃芩苷為參照峰，計算相對保留時間和相對峰面積，RSD值分別為0.97%、1.54%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.8.6 精密度試驗 取同一份樣品(S1)溶液，按照2.8.1項下方法，連續(xù)進樣6次，以野黃芩苷為參照峰，計算相對保留時間及相對峰面積，RSD值分別為0.39%、0.74%，表明該儀器精密度良好。

2.8.7 穩(wěn)定性試驗 取同一份樣品(S1)溶液，按照2.8.1項下方法，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，以野黃芩苷為參照峰，計算相對保留時間及相對峰面積，RSD值分別為0.86%、1.04%，說明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 相似度軟件數(shù)據(jù)處理與評價

使用2012版中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件對11批黃芩莖葉提取物樣品色譜圖的AIA文件格式進行處理，設(shè)定“中位數(shù)”法，時間窗寬度為0.10，多點校正，并進行自動匹配，結(jié)果顯示，黃芩莖葉對照提取物共有7個共有峰，特征圖譜疊加見圖10，對照特征圖譜(R)見圖11。以對照特征圖譜(R)為對照，計算11批黃芩莖葉對照提取物樣品相似度(0.957～0.989)，見表6。

注：1.為野黃芩苷；2.為野黃芩素圖9 參照物色譜圖

圖10 HQJY對照提取物樣品的特征圖譜

注：2.野黃芩苷；7.野黃芩素。圖11 黃芩莖葉對照提取物的對照特征圖譜

編號相似度編號相似度S10.988S70.973S20.982S80.989S30.966S90.982S40.974S100.980S50.979S110.985S60.957R1.000

3 討論

黃芩莖葉的主要成分為野黃芩苷、芹菜素苷等黃酮類化合物，具有酚羥基，在經(jīng)酸化處理后，易形成沉淀析出[11]，但因析出不完全，故采用大孔吸附樹脂法富集上清液中的黃酮類化合物，提高收率。另外，大孔吸附樹脂有吸附快、穩(wěn)定性好、洗脫率高和再生簡便的特點，已廣泛用于總黃酮的純化工藝研究[12-15]，Box-Behnken響應(yīng)面法可考察各因素之間的交互作用，高效地減少實驗次數(shù)。

本實驗首次以黃芩莖葉總黃酮為指標(biāo)，采用紫外分光光度法(UV)，先對黃芩莖葉醇提物進行酸化處理，再選用5種不同極性的大孔吸附樹脂，以單因素法考察樹脂型號、樹脂用量、上樣液濃度、洗脫劑濃度、洗脫劑用量等因素，并采用Box-Behnken響應(yīng)面法對黃芩莖葉對照提取物的純化工藝進行優(yōu)化。利用高效液相色譜建立了黃芩莖葉對照提取物特征圖譜的測定方法，11批樣品相似度均大于0.950，說明此次提取制得的黃芩莖葉提取物的質(zhì)量穩(wěn)定、可控。

本實驗通過對黃芩莖葉對照提取物工藝優(yōu)化及特征圖譜的研究，為對照提取物的質(zhì)量控制提供了實驗依據(jù)，高度體現(xiàn)了中藥質(zhì)量控制的整體性、特征性和系統(tǒng)性[16]，為黃芩莖葉對照提取物的開發(fā)和利用提供了參考。