石藝婷,何英杰,3,陳蕓,唐其,4*,譚海燕,劉東波,2,4,謝紅旗,2,3,4*
1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410128;2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局 亞健康干預(yù)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長(zhǎng)沙 410128;3.湖南省中獸藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長(zhǎng)沙 410128;4.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心,湖南 長(zhǎng)沙 410128
枳殼為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí),是國(guó)家規(guī)定的114種可用于中藥類保健食品原料之一,主要分布于四川、重慶、湖南、江西等省,其中屬“湘枳殼”產(chǎn)量較大,為大宗中藥材[1-2]。枳殼性微寒,味酸苦,歸脾胃經(jīng),用于胸脅氣滯、脹滿疼痛、食積不化、臟器下垂等,具有調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力、抗氧化、利膽排石及抗抑郁等多種功效[3-5]。
枳殼中有效成分主要有黃酮、三萜、多糖、多酚、少量揮發(fā)油及生物堿等[6-7]。黃酮類化合物主要為二氫黃酮,如柚皮苷、新橙皮苷等,具有抗氧化、抗炎、抗癌抑菌等作用[8-10];三萜類成分以檸檬苦素為代表,具有抗腫瘤、保護(hù)神經(jīng)等生物活性[11-12];多糖主要由阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖構(gòu)成,能有效促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞的增殖,具有一定免疫增強(qiáng)活性[13-15];多酚類物質(zhì)具有良好的生物活性,主要表現(xiàn)在抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病、抑制肥胖等方面,是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一,而目前關(guān)于枳殼多酚的報(bào)道較少[6,16-17],但同屬中藥枳實(shí)中多酚具有一定的抗氧化活性,并能抑制脂肪酶和葡萄糖苷酶活力[18]。
中藥類保健食品的研究開(kāi)發(fā)主要包括配方、工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),其中質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究為基礎(chǔ)保障[19]。而關(guān)于枳殼的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制一般以《中華人民共和國(guó)藥典》為準(zhǔn),即以柚皮苷和新橙皮苷的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),由于控制指標(biāo)少,不能全面真實(shí)反映產(chǎn)品的質(zhì)量?;谝延械难芯浚疚倪x擇枳殼的特征性成分柚皮苷、新橙皮苷、多酚、三萜以及多糖的含量為質(zhì)量指標(biāo),通過(guò)Criteria Importance Through Inter-criteria Correlation法,即CRITIC客觀賦值法,建立枳殼綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)體系,分析并比較了以湘枳殼為主的12個(gè)枳殼樣品的品質(zhì),旨在構(gòu)建一種客觀的評(píng)價(jià)體系來(lái)反映枳殼的藥材質(zhì)量,為今后枳殼在中藥保健品等領(lǐng)域的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考。
DHG-9246A烘箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);YS-20粉碎機(jī)(北京燕山正德機(jī)械設(shè)備有限公司);XS205分析天平(德國(guó)METTLER TOLEDO公司);KM5200DV超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);2-16R高速離心機(jī)(恒諾儀器公司);UV-1800紫外分光光度計(jì)(日本島津公司);1260高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)。
柚皮苷對(duì)照品(Naringin,上海源葉生物有限公司,批號(hào):B12594)、檸檬苦素對(duì)照品(Limonin,上海源葉生物有限公司,批號(hào):B20911)、新橙皮苷對(duì)照品(Neohesperidin,上海源葉生物有限公司,批號(hào):B21390);一水合沒(méi)食子酸、葡萄糖(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司);甲醇、乙醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸、碳酸鈉、福林酚、三氯化鋁、蒽酮、硫酸(上海國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司,分析純)。
枳殼樣品經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物學(xué)專業(yè)王智老師鑒定為正品,具體信息見(jiàn)表1。
表1 枳殼樣品信息
將枳殼干樣置60 ℃烘箱中,烘干24 h,然后取適量藥材置植物粉碎機(jī)中粉碎,再過(guò)80目篩,即得。
2.2.1 色譜條件 參考《中華人民共和國(guó)藥典》(2015版)及相關(guān)研究[3,20]中的方法稍作改進(jìn)。采用Agilent-ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),以0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)為流動(dòng)相,梯度洗脫程序:0~5 min,10%~15%B;5~10 min,15%~18%B;10~15 min,18%~20%B;15~20 min,20%~22%B;20~25 min,22%B;25~30 min,22%~25%B;檢測(cè)波長(zhǎng)為284 nm;色譜柱溫度為30 ℃;流動(dòng)相流速為0.7 mL·min-1;進(jìn)樣體積為10 μL。
2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品柚皮苷0.44 mg、新橙皮苷0.40 mg,用甲醇溶解并定容到1.0 mL,制成混合對(duì)照品儲(chǔ)備液,分別取儲(chǔ)備液稀釋到質(zhì)量濃度為0.43~225 μg·mL-1,過(guò)0.45 μm濾膜后進(jìn)行色譜分析,并以相應(yīng)對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y)。
2.2.3 供試品溶液的制備 稱取干燥的枳殼粉末(AF-1~AF-12)50.00 mg置于錐形瓶中,按料液比1∶100,分別加入50.0 mL甲醇,密封后稱質(zhì)量,超聲提取30 min后再稱質(zhì)量,再用甲醇補(bǔ)足質(zhì)量,抽濾,取濾液于4 ℃貯存,備用。
2.2.4 柚皮苷、新橙皮苷含量測(cè)定 取2.2.3制備的供試品溶液過(guò)0.45 μm濾膜后,按照2.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行定量分析。
2.3.1 枳殼樣品處理 按2.2.3的方法操作。
2.3.2 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 采用福林酚顯色法,參考文獻(xiàn)[21-22]方法。稱取一水合沒(méi)食子酸對(duì)照品110.00 mg,用蒸餾水配成質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1的沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液;分別移取適量溶液配制成10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。分別移取各濃度的對(duì)照品溶液0.5 mL于試管中,依次加入蒸餾水2.5 mL、福林酚試劑0.5 mL和7.5%碳酸鈉溶液1.5 mL,室溫下顯色2 h,以沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液為參比溶液,用紫外分光光度計(jì)于760 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,以沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.3.3 多酚含量測(cè)定 取各樣品溶液10.0 μL,加甲醇至0.5 mL,并用甲醇溶液作參比溶液,按照2.3.2的方法進(jìn)行測(cè)定。
2.4.1 供試品溶液制備 按照2.2.3方法,制備供試品溶液后將其稀釋3倍,備用。
2.4.2 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線 參考文獻(xiàn)[23-24]的方法,精密稱量檸檬苦素對(duì)照品1.20 mg,用甲醇定容至5.0 mL。分別移取0.10、0.20、0.40、0.60、0.70 mL檸檬苦素溶液于試管中,用甲醇補(bǔ)足到1.00 mL,依次加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.40 mL、高氯酸1.0 mL,搖勻,60 ℃水浴加熱15 min后冰水浴冷卻,再加入5.00 mL冰醋酸,室溫靜置15 min后于548 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.4.3 三萜含量測(cè)定 取各樣品溶液0.10 mL,加甲醇至1.00 mL,以甲醇溶液為參比,按照2.4.2的方法進(jìn)行測(cè)定。
2.5.1 供試品溶液制備 稱取各枳殼樣品1.00 g分別加入20.0 mL甲醇,超聲脫脂30 min后抽濾,繼續(xù)加入20.0 mL甲醇溶液,重復(fù)上述操作,得濾渣,置通風(fēng)櫥中吹干,再往濾渣中加入30.0 mL蒸餾水,沸水加熱提取30 min,重復(fù)操作兩次后合并濾液,減壓濃縮至一定體積,加入適量乙醇,4 ℃過(guò)夜保存后高速離心10 min,棄上清液,得多糖沉淀,加蒸餾水溶解后定容至50.0 mL。
2.5.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 采用蒽酮-硫酸法[15,25],精密稱取干燥的葡萄糖對(duì)照品10.00 mg,加蒸餾水定容得質(zhì)量濃度為0.10 mg·mL-1葡萄糖對(duì)照品溶液。分別精密量取0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL上述溶液于試管中,用蒸餾水補(bǔ)足到2.0 mL,再往各試管加入0.1%蒽酮-硫酸溶液6.0 mL,迅速搖勻,室溫反應(yīng)15 min后冰水浴15 min;以2.0 mL蒸餾水作參比溶液,于625 nm處測(cè)定吸光度。以葡萄糖溶液濃度為橫坐標(biāo),吸光度A為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.5.3 多糖含量測(cè)定 依照2.5.2的方法并計(jì)算出多糖含量。
對(duì)所得數(shù)據(jù)通過(guò)Excel 2010軟件進(jìn)行處理。
3.1.1 線性回歸方程 按實(shí)驗(yàn)方法操作,以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),各對(duì)照品溶液的峰面積或吸光度A為縱坐標(biāo)(Y),得到柚皮苷、新橙皮苷、沒(méi)食子酸、檸檬苦素、葡萄糖對(duì)照品的線性回歸方程,見(jiàn)表2。結(jié)果表明,各對(duì)照品的質(zhì)量濃度與吸光度的線性關(guān)系良好。
表2 各對(duì)照品線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)
3.1.2 含量測(cè)定結(jié)果 通過(guò)高效液相色譜法和紫外分光光度法,測(cè)定不同產(chǎn)地枳殼有效組分的含量,將各樣品3次測(cè)定結(jié)果的平均值列于表3。由表3可知,以《中國(guó)人民共和國(guó)藥典》(2015版)為指導(dǎo),即枳殼中柚皮苷含量不能低于4.0%,各樣品均符合要求;新橙皮苷含量不能低于3.0%,除AF-1、AF-4和AF-10外其余樣品均符合要求。
表3 枳殼5個(gè)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果(n=3) mg·g-1
3.2.1 CRITIC法原理 CRITIC法是一種與主觀權(quán)重賦值法相比更為科學(xué)可靠的客觀賦值法。它是通過(guò)各指標(biāo)間的對(duì)比強(qiáng)度和沖突性來(lái)綜合衡量其客觀權(quán)重[26-28]。對(duì)比強(qiáng)度表示同一指標(biāo)各個(gè)類別之間取值差距的大小,以標(biāo)準(zhǔn)差的形式表現(xiàn)出來(lái),用σj表示,即σj越大則同一指標(biāo)內(nèi)各類別之間的差距越大。各指標(biāo)間的沖突性以指標(biāo)之間的相關(guān)性為基礎(chǔ),通常用Rj表示,如果指標(biāo)之間具有較強(qiáng)的正相關(guān),說(shuō)明這兩個(gè)指標(biāo)的沖突性較低,則表明這兩個(gè)指標(biāo)反映的信息較為相似。
設(shè)Cj為第j個(gè)指標(biāo)所包含的信息量,Cj越大,則第j個(gè)指標(biāo)所包含的信息量越大,該指標(biāo)的相對(duì)重要性越大,客觀權(quán)重Wj就越大。
(1)
Cj=σjRj
(2)
(3)
其中,rij為指標(biāo)i與j之間的相關(guān)系數(shù)。
3.2.2 相關(guān)性分析 采用Excel 2010軟件分析上述指標(biāo)間的相關(guān)性,結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知,柚皮苷含量與其他4個(gè)指標(biāo)均呈較好的相關(guān)性,其中與多糖含量的相關(guān)系數(shù)為0.550,與多酚含量的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.698;而新橙皮苷含量?jī)H與多酚含量有良好的相關(guān)性,為0.733;多酚含量與三萜含量之間也有較大的相關(guān)性;而多糖含量與三萜含量呈一定的負(fù)相關(guān)。
表4 各指標(biāo)間的相關(guān)性
注:—表示數(shù)據(jù)已有,不再重復(fù)。
3.2.3 CRITIC法分析 本實(shí)驗(yàn)采用CRITIC法對(duì)枳殼中柚皮苷、新橙皮苷、多酚、三萜以及多糖含量進(jìn)行權(quán)重賦值,并以此作為枳殼品質(zhì)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。首先按照標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)=(該次試驗(yàn)值-試驗(yàn)最小值)/(試驗(yàn)最大值-試驗(yàn)最小值),對(duì)表3的數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,然后根據(jù)3.2.1的公式計(jì)算各指標(biāo)的對(duì)比強(qiáng)度、沖突性、信息量和客觀權(quán)重,結(jié)果見(jiàn)表5。
表5 評(píng)價(jià)指標(biāo)的對(duì)比強(qiáng)度、沖突性、信息量和客觀權(quán)重
由上表可知,各指標(biāo)的客觀權(quán)重系數(shù)分別為0.115、0.194、0.171、0.237和0.284,故將加權(quán)得分公式設(shè)定如下。
Y=(柚皮苷含量/柚皮苷最大含量)×0.115×100+(新橙皮苷含量/新橙皮苷最大含量)×0.194×100+(多酚含量/多酚最大含量)×0.171×100+(三萜含量/三萜最大含量)×0.237×100+(多糖含量/多糖最大含量)×0.284×100
(4)
根據(jù)公式計(jì)算各枳殼樣品的得分和排序結(jié)果見(jiàn)表6。
表6 CRITIC法得分表
由上表可知,樣品的得分范圍為42.003~92.936。由表5可知,多糖含量的信息量、所占的客觀權(quán)重均較其他指標(biāo)大,因此它對(duì)加權(quán)公式的影響也最大;三萜含量的信息量和客觀權(quán)重僅次于多糖,對(duì)加權(quán)得分也有較大影響。
而由表3可知,多糖含量排在前3位的樣品編號(hào)依次是AF-5、AF-10、AF-11,三萜含量排在前3的分別是AF-7、AF-3、AF-5,而最終得分前3名為AF-7、AF-12、AF-5。由表3可知,AF-7各項(xiàng)指標(biāo)含量均比較高,尤其是柚皮苷、三萜及多酚的含量均位于第一,因而最終得分最高,品質(zhì)最好;AF-12雖然只有新橙皮苷含量最高,但其他指標(biāo)排名都比較靠前,得分也相應(yīng)較高。而AF-5有3項(xiàng)指標(biāo)位于前3,其中屬多糖含量最高,另外兩項(xiàng)得分雖相對(duì)靠后,但其對(duì)加權(quán)公式影響較小,最終得分依然較高。排名靠后的3個(gè)樣品的編號(hào)分別是AF-10、AF-1和AF-4,它們各指標(biāo)含量均比較靠后,尤其是AF-4,所有指標(biāo)值均在最后3名內(nèi),品質(zhì)較差。
從產(chǎn)區(qū)來(lái)看,產(chǎn)自三眼塘鎮(zhèn)的AF-5、AF-7得分高,排名靠前,較沅江其他產(chǎn)地品質(zhì)更佳;而同產(chǎn)于三眼塘鎮(zhèn)的AF-6各指標(biāo)值較低,排名相對(duì)靠后,推測(cè)與栽培技術(shù)、采收時(shí)間等有關(guān),具體原因還有待研究。在各產(chǎn)地中,屬沅江南咀鎮(zhèn)的樣品得分最低,品質(zhì)較差。
隨著中藥保健食品概念的推廣,人們逐漸開(kāi)始意識(shí)到防治未病的重要性,功能食品的保健功效也越來(lái)越受到重視,而枳殼作為一種常用的理氣藥,在保健品等領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)尚處于起步階段。枳殼中所含的黃酮類、多酚類、三萜以及多糖類化合物是其主要的有效活性成分,具有較強(qiáng)的藥理作用及保健功效,通過(guò)測(cè)定這些有效成分的含量,并基于CRITIC客觀賦值法建立可以客觀反映不同來(lái)源枳殼質(zhì)量的評(píng)價(jià)體系,為今后枳殼在功能產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用領(lǐng)域提供借鑒。