鹿茸復(fù)方對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝和骨鈣磷含量的影響△

王雪華，趙海平，孫偉麗，姚夢杰，李春義*，李海濤*

1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以全身骨量減少、骨密度損失及骨組織微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，并引起骨強度降低、骨脆性增加、骨折危險性增大的全身代謝性疾病[1]。臨床以周身疼痛、身高降低、駝背、脆性骨折及呼吸系統(tǒng)受影響等為主要表現(xiàn)[2]。原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥屬于高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥，常發(fā)于老年人及絕經(jīng)后婦女[3]。中醫(yī)理論中依據(jù)其臨床癥狀及病因病機，多將其歸屬為“骨痿”的范疇，臨床普遍認同腎虛是主要病機，肝脾不足、血瘀痰濁等也與之密切相關(guān)[4]。由于原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥屬于發(fā)病率高的慢性疾病，所以保健費用消耗比較大，并且嚴重影響老年人的健康和生活質(zhì)量，已經(jīng)成為一個世界范圍的健康問題。

鹿茸為鹿科動物馬鹿CervuselaphusLinnaeus和梅花鹿CervusnipponTemminck的雄鹿頭上未骨化密生茸毛的幼角，始載于漢代的《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有壯腎陽、益精血、調(diào)充任的功效，用于腎陽不足、經(jīng)血虧虛、陽痿滑精、宮冷不孕、眩暈耳鳴、耳聾等[5]。據(jù)我國古籍記載：“壯骨”為鹿茸的最主要功效[6]。中醫(yī)臨床研究顯示，作為補腎中藥的鹿茸可以促進骨形成和骨量增加，提升骨密度，從而達到治療骨質(zhì)疏松的目的[7-8]。鹿血有養(yǎng)血益精、活血祛瘀的功效[9]和治療骨質(zhì)疏松的作用，據(jù)研究，鹿血可以增加去卵巢骨質(zhì)疏松型大鼠的椎骨與股骨的強度，修復(fù)破壞的骨小梁。煅牡蠣由牡蠣加工炮制而成，兩者均有抗骨質(zhì)疏松的效果[10-11]。

本研究取鹿茸上段為君藥，鹿血為臣，牡蠣為佐，在復(fù)方組成上不同于以往的研究。對3月齡Wistar雌性大鼠切除卵巢可以手術(shù)構(gòu)建絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型動物，給藥12周后，通過檢測大鼠體質(zhì)量、子宮質(zhì)量、血清指標(biāo)、骨質(zhì)量、骨鈣含量、骨磷含量、骨組織染色和骨小梁面積等指標(biāo)評估鹿茸復(fù)方對大鼠骨質(zhì)疏松模型的防治作用，為中藥復(fù)方治療骨質(zhì)疏松的研究提供理論參考。

1 材料

1.1 動物

SPF級Wistar雌性大鼠，3月齡未經(jīng)產(chǎn)，32只，體質(zhì)量為(260±20)g，購于遼寧長生生物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK(遼)2015-0001，飼養(yǎng)溫度為(22±3)℃，濕度50%～75%，自然光源，標(biāo)準營養(yǎng)顆粒飼料喂養(yǎng)(購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司)，自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后用于實驗。

1.2 藥材

鹿茸為采集新鮮梅花鹿茸，按照NY/T 1162-2006中描述的方法，將鹿茸的蠟片和粉片取出作為上段，處理后粉碎。鹿血為采集梅花鹿新鮮血液，按照DB21/T 1465-2006描述的方法，將鹿血制成粉末。煅牡蠣購于康美藥業(yè)有限公司(批號：170901611)。鹿茸經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所孫紅梅博士鑒定為梅花鹿C.Temminck三杈茸；鹿血為梅花鹿C.Temminck膛血；煅牡蠣購于康美藥業(yè)有限公司(批號：170901611)，為牡蠣科動物大連灣牡蠣Ostreatalienwhanensis。

1.3 試劑與器材

1.3.1 試劑 青霉素注射液、鏈霉素注射液(哈藥集團獸藥有限公司)，4%多聚甲醛、10%水合氯醛(諾和諾德公司)，羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，β-雌二醇，EDTA，釩鉬酸，EDTA-Na2(長春華益生物科技有限公司)，乙醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，二甲苯(北京化工廠)，蘇木精染液、伊紅染液(天津市光復(fù)精細化工研究所)，堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(BGP)、甲狀旁腺激素(PTH)、降鈣素(CT)的ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，硝酸、濃鹽酸、濃硫酸(國藥集團)，鈣離子標(biāo)準溶液、磷離子標(biāo)準溶液(國家有色金屬及電子材料分析測試中心)。

1.3.2 儀器 BFM-6BI型貝利微粉機(濟南倍力粉技術(shù)工程有限公司)，BSA224S型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，SCMF-3000自動灰(揮發(fā))分儀(長春實誠科技有限公司)，BSA8201型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，SDW-1型微機控制三點彎曲試驗機(濟南時代新光儀器有限公司)，火焰光度計6400A(上海傲譜分析儀器有限公司)，5810R型離心機(凱特實驗儀器有限公司)，2255型LEICA切片機(德國徠卡公司)，1150 H型LEICA包埋機(德國徠卡公司)，90i正置熒光顯微鏡(尼康公司)。

2 方法

2.1 動物模型建立

用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3 mL·kg-1)，麻醉后仰臥固定，于最末肋骨下，距脊椎柱外側(cè)約2 cm處去毛，先后用碘伏和75%乙醇消毒，縱行切開皮膚約2 cm，剝離肌肉組織，結(jié)扎兩側(cè)輸卵管，摘除兩側(cè)卵巢，將子宮角送回腹腔中，注入雙抗(40萬U·kg-1)，縫合切口，75%乙醇擦拭消毒。再取同批次大鼠8只，將大鼠用10%水合氯醛麻醉，麻醉后仰臥固定，在最末肋骨下，距脊椎柱外側(cè)約2 cm處去毛消毒，縱行切開皮膚約2 cm后縫合，75%乙醇擦拭消毒。

2.2 分組與給藥

將去卵巢大鼠隨機分為3組，分別為模型組(OVX)，雌激素組(E2)，復(fù)方組(F)；沒去卵巢的為對照組(Sham)，每組8只。根據(jù)《藥理實驗方法學(xué)》中“人和動物按體表面積折算的等效劑量比值表”進行給藥劑量計算，Wistar大鼠給藥劑量為人的6.3倍。鹿茸根據(jù)《中華人民共和國藥典》給人的劑量為每天2 g·(60kg)-1，給大鼠的劑量為每天0.21 g·kg-1，復(fù)方(鹿茸-鹿血-牡蠣比例為4∶1∶1)給藥總量為每天0.315 g·kg-1。

Sham組：CMC-Na與蒸餾水配制成質(zhì)量分數(shù)為0.5%，以1 mL·d-1的劑量給大鼠灌胃，給藥12周。

OVX組：CMC-Na與蒸餾水配制成質(zhì)量分數(shù)為0.5%，以1 mL·d-1的劑量給大鼠灌胃，給藥12周。

E2組：β-雌二醇以0.5% CMC-Na作為溶劑制成混懸液，以每天2.5 μg·kg-1的劑量給大鼠灌胃，給藥12周。

F組：鹿茸復(fù)方以0.5% CMC-Na作為溶劑制成混懸液，以每天0.315 g·kg-1的劑量給大鼠灌胃，給藥12周。

2.3 大鼠各生理樣本的收集與處理

2.3.1 血液 將大鼠麻醉后固定，心臟取血。將全血分別轉(zhuǎn)移至帶標(biāo)記離心管中，4 ℃靜置30 min后，以4000 r·min-1，4 ℃離心15 min，移液器吸取上層血清分裝于1.5 mL離心管，放入-80 ℃中，避免反復(fù)凍融。用ELISA試劑盒檢測血清ALP、BGP、PTH和CT水平，原子吸收法測定血清Ca和血清P的含量，委托上海雙贏生物科技有限公司檢測。

2.3.2 子宮與骨骼 大鼠經(jīng)心臟抽血至死亡后，仰臥固定，縱行切開腹部皮膚取出兩側(cè)子宮放入PBS中清洗至無血，濾紙吸干水分，稱質(zhì)量。沿著大鼠關(guān)節(jié)解剖取下其左側(cè)和右側(cè)股骨剔凈附著的肌肉及結(jié)締組織，左側(cè)股骨65 ℃恒溫箱中烘干備用，右側(cè)股骨置于4%的多聚甲醛中固定、備用。

2.3.3骨鈣和骨磷檢測 取左側(cè)股骨，65 ℃恒溫箱中烘干，稱質(zhì)量，分裝于坩堝中，碳化至不冒黑煙為止，550 ℃馬弗爐高溫灰化4 h，灰化后取出，干燥器中冷卻至室溫后稱質(zhì)量，計算灰分。每個樣品加入10 mL鹽酸(6 mol·L-1)加熱溶解樣品，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度。取2 mL樣品溶液至三角瓶中，依次加入蒸餾水50 mL、淀粉10 mL(1 g·L-1)、三乙醇胺2 mL、乙二胺1 mL混勻后，加入孔雀綠一滴，鹽酸羥胺少許，混勻后，加入氫氧化鉀10 mL(200 g·L-1)，混勻后加少許鈣黃素指示劑，混勻后待測樣品呈綠色，進行EDTA滴定，讀取刻度后計算骨鈣濃度。從100 mL容量瓶取1 mL樣品至50 mL容量瓶中，加入10 mL釩鉬酸銨，混勻20 min后蒸餾水定容至刻度，混勻，每個樣取300 μL至96孔板中，全自動酶標(biāo)儀450 nm的波長下檢測吸光值，計算骨磷的濃度。

2.3.4 HE染色 取小鼠右側(cè)股骨組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定，EDTA-Na2溶液脫鈣21 d，取股骨遠端1/3處干骺端縱切，自來水水洗過夜，乙醇逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚度為5 μm，于64 ℃恒溫烘箱烤片3 h左右，蘇木精-伊紅染液染色，透明2次后中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下(4×10)觀察各組小鼠股骨組織片HE染色情況，并用Image Pro Plus 6.0軟件手動對大鼠股骨組織切片面積進行計算，每組選取4張切片，每張切片40倍視野下隨機選取2個視野，每組共8個視野，計算40倍視野下骨小梁面積所占總面積比值。

2.4 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 體質(zhì)量

與Sham組比較，OVX組大鼠的體質(zhì)量增長率明顯升高(P<0.01)；與OVX組比較，E2組大鼠體質(zhì)量增長率無明顯變化，F(xiàn)組大鼠體質(zhì)量增長率明顯降低(P<0.05)；與E2組比較，F(xiàn)組大鼠體質(zhì)量增長率無明顯變化，見表1。

表1 各組大鼠實驗前后體質(zhì)量變化

注：與Sham組比較，**P<0.001；與OVX組比較，#P<0.05。

3.2 大鼠子宮質(zhì)量與臟器指數(shù)

與Sham組比較，OVX組大鼠的子宮質(zhì)量明顯降低(P<0.001)；與OVX組比較，E2組大鼠子宮質(zhì)量明顯升高(P<0.001)，而F組大鼠子宮質(zhì)量沒有明顯變化；與E2組比較，F(xiàn)組大鼠子宮質(zhì)量明顯降低(P<0.001)，子宮臟器指數(shù)同子宮質(zhì)量，見表2。

表2 各組大鼠子宮臟器指數(shù)

注：與Sham組比較，***P<0.001；與OVX組比較，###P<0.001；與E2組比較，△△△P<0.001。

3.3 血清指標(biāo)

3.3.1 血清ALP和BGP含量 與Sham組比較，OVX組大鼠的血清ALP含量明顯升高(P<0.01)；與OVX組比較，E2組和F組大鼠血清ALP含量沒有明顯變化；與E2組比較，F(xiàn)組大鼠血清ALP含量沒有明顯變化。與Sham組比較，OVX組大鼠的血清BGP含量明顯升高(P<0.001)；與OVX組比較，E2組和F組大鼠血清BGP含量均明顯降低(P<0.001)；與E2組比較，F(xiàn)組大鼠血清BGP含量沒有明顯變化，見表3。

表3 各組大鼠血清ALP和BGP指標(biāo) ng·mL-1

注：與Sham組比較，**P<0.01，***P<0.001；與OVX組比較，###P<0.001。

3.3.2 血清PTH和CT含量 與Sham組比較，OVX組大鼠的血清PTH含量明顯升高(P<0.001)；與OVX組比較，E2組(P<0.05)和F組(P<0.01)大鼠血清PTH含量均顯著降低；與E2組比較，F(xiàn)組大鼠血清PTH含量無明顯變化。與Sham組比較，OVX組大鼠的血清CT顯著降低(P<0.01)；與OVX組比較，E2組和F組大鼠的血清CT含量均無明顯變化；與E2組比較，F(xiàn)組大鼠血清CT含量無明顯變化，見表4。

表4 各組大鼠血清PTH和CT指標(biāo) ng·mL-1

注：與Sham組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與OVX組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.3.3 血清Ca和P含量 與Sham組比較，OVX組大鼠血清Ca含量明顯降低(P<0.05)；與OVX組比較，E2組和F組大鼠血清Ca含量沒有明顯變化；與E2組比較，F(xiàn)組大鼠血清Ca含量沒有明顯變化。與Sham組比較，OVX組大鼠血清P含量顯著升高(P<0.05)；與OVX組比較，E2組(P<0.05)和F組(P<0.01)大鼠血清PTH含量均顯著降低；與E2組比較，F(xiàn)組大鼠血清P含量沒有明顯變化，見表5。

表5 各組大鼠血清Ca和P指標(biāo) mg·mL-1

注：與Sham組比較，*P<0.05；與OVX組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.4 大鼠股骨質(zhì)量與骨礦含量

與Sham組比較，OVX組大鼠股骨濕質(zhì)量明顯降低(P<0.01)；與OVX組比較，E2組和F組大鼠股骨濕質(zhì)量沒有明顯變化；與E2組比較，F(xiàn)組大鼠股骨濕質(zhì)量無明顯變化。與Sham組比較，OVX組大鼠股骨干質(zhì)量明顯降低(P<0.01)；與OVX組比較，E2組和F組大鼠股骨干質(zhì)量沒有明顯變化；與E2組比較，F(xiàn)組大鼠股骨干質(zhì)量無明顯變化。與Sham組比較，OVX組大鼠股骨灰分含量明顯降低(P<0.01)；與OVX組比較，E2組大鼠股骨灰分含量沒有明顯變化，F(xiàn)組大鼠股骨灰分含量顯著升高(P<0.05)；與E2組比較，F(xiàn)組大鼠股骨灰分含量無明顯變化。與Sham組比較，OVX組大鼠股骨骨鈣含量明顯降低(P<0.001)；與OVX組比較，E2組(P<0.05)和F組(P<0.001)大鼠股骨骨鈣含量均顯著升高；與E2組比較，F(xiàn)組大鼠股骨骨鈣含量無明顯變化。與Sham組比較，OVX組大鼠股骨骨磷含量明顯降低(P<0.001)；與OVX組比較，E2組(P<0.001)和F組(P<0.001)大鼠股骨骨磷含量均明顯升高；與E2組比較，F(xiàn)組大鼠股骨骨磷含量無明顯變化，見表6。

3.5 骨組織形態(tài)學(xué)檢測和骨小梁面積比值

與Sham組比較，OVX組大鼠骨小梁數(shù)目減少，間隙變大，骨小梁斷裂不相連接，結(jié)構(gòu)不完整，呈典型的骨質(zhì)疏松樣，并且骨小梁面積顯著降低(P<0.001)；與OVX組比較，E2組大鼠骨小梁數(shù)目較多，排列較緊密，連接成網(wǎng)狀，并且骨小梁面積顯著升高(P<0.001)；F組大鼠骨小梁排列較緊密，連接程度較高，骨小梁面積顯著升高(P<0.001)；與E2組比較，F(xiàn)組骨小梁間隙、結(jié)構(gòu)和面積均無明顯變化，見圖1和圖2。

4 討論

雌激素在機體內(nèi)參與骨代謝，有促進前體細胞向成骨細胞分化并減少脂肪細胞的生成，促進骨形成、抑制骨吸收等作用[12-13]，雌激素匱乏會導(dǎo)致機體骨代謝異常，骨轉(zhuǎn)換率升高、骨形成減弱、骨吸收增強、骨質(zhì)流失致使骨質(zhì)發(fā)生疏松[14]。ALP和BGP在礦化過程中起著重要作用，是骨轉(zhuǎn)換率的重要指標(biāo)[15-17]。PTH對骨代謝有雙向調(diào)節(jié)作用，高劑量有促進骨吸收、低劑量有促進骨形成的作用[18-19]，CT的主要作用是抑制骨吸收[20]。血清PTH和CT含量還與機體內(nèi)雌激素、血Ca和血P含量相關(guān)，雌激素缺乏、血清Ca含量降低、血清P含量升高時均會導(dǎo)致PTH分泌量增加、CT分泌下降[21]。本實驗采用去卵巢致大鼠骨質(zhì)疏松模型，可以在骨代謝方面較好地模擬人類絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥狀[22]。實驗結(jié)果顯示，與Sham組比較，OVX組大鼠在去除卵巢后，子宮質(zhì)量明顯降低，體質(zhì)量增長率增加，血清ALP、BGP和PTH含量均顯著升高，但是血清CT、骨質(zhì)量、骨鈣含量、骨磷含量和骨小梁完整性均顯著降低，說明大鼠切除卵巢后，雌激素分泌減少導(dǎo)致子宮萎縮，前體細胞向成骨細胞分化減少，同時血清Ca含量降低、血清P含量升高，三者同時導(dǎo)致PTH分泌增加、CT分泌減少，從而促進骨吸收，抑制骨形成，使大鼠骨鈣和骨磷含量降低，骨礦物質(zhì)流失顯著升高，骨小梁完整性遭到破壞，骨質(zhì)發(fā)生了疏松，造模成功。經(jīng)過雌激素和鹿茸復(fù)方治療之后，大鼠體質(zhì)量增長率、骨轉(zhuǎn)換率顯著降低，血清PTH含量降低和CT含量升高，骨質(zhì)量、骨鈣和骨磷含量和骨小梁完整性均有所升高，說明鹿茸復(fù)方和雌激素均可以減緩因雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松，并且兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與雌激素不同，鹿茸復(fù)方對大鼠子宮萎縮沒有明顯的抑制作用，但是雌性激素在治療絕經(jīng)期后骨質(zhì)疏松方面副作用較大，長期服用會有引發(fā)乳房腫痛、陰道出血、促凝血傾向及可能增加乳腺癌發(fā)生率的風(fēng)險[23]。鑒于本研究結(jié)果，我們推測，臨床上通過鹿茸組方來部分或者全部代替雌性激素，有可能在保證良好治療效果的同時，在一定程度上降低治療的不良反應(yīng)。

表6 各組大鼠股骨濕質(zhì)量、干質(zhì)量、灰分、骨鈣和骨磷指標(biāo)

注：與Sham組比較，*P<0.05，**P<0.001，***P<0.001；與OVX組比較，#P<0.05，###P<0.001。

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.雌激素組；D.復(fù)方組。圖1 大鼠股骨組織切片(HE染色，40×)

注：與Sham組比較，**P<0.01，***P<0.001；與OVX組比較，###P<0.001。圖2 各組大鼠股骨小梁面積比值