西瓜遺傳圖譜構(gòu)建和基因定位研究進(jìn)展

李兵兵　劉文革

摘 ? ?要： 西瓜是一種在世界范圍內(nèi)廣泛種植的園藝作物，中國是世界上最大的西瓜生產(chǎn)國和消費(fèi)國，對(duì)西瓜遺傳育種的研究具有重要意義。遺傳圖譜是進(jìn)行基因定位、圖位克隆、分子標(biāo)記輔助育種的重要工具，并為分子生物學(xué)的深入研究提供了基礎(chǔ)。近年來，隨著高通量測序技術(shù)和分子標(biāo)記的發(fā)展，西瓜遺傳圖譜研究取得了很大進(jìn)展，基于不同遺傳背景的西瓜遺傳圖譜陸續(xù)發(fā)表，極大地促進(jìn)了西瓜基因組學(xué)和分子遺傳育種的發(fā)展。筆者總結(jié)了近年來國內(nèi)外西瓜遺傳圖譜構(gòu)建和基因定位的研究進(jìn)展及應(yīng)用，并探討了目前西瓜遺傳圖譜構(gòu)建方面存在的主要問題及今后的研究趨勢。

關(guān)鍵詞： 西瓜; 遺傳圖譜; 基因定位

Research progress on genetic map construction and gene mapping for watermelon

LI Bingbing， LIU Wenge

（Zhengzhou Fruit Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450009， Henan， China）

Abstract：Watermelon is a horticultural crop widely cultivated around the world. China is the largest producer and consumer of watermelon. The genetic breeding research of watermelon is of great significance. Genetic map is an important tool for gene mapping， map cloning， molecular marker-assisted breeding， and provides a basis for further research in molecular biology. In recent years， with the development of high-throughput sequencing technology and molecular markers， the research on watermelon genetic map has made great progress. Many genetic maps based on different genetic background have been constructed， which greatly promoted the development of watermelon genomics. This paper reviewed the research progress and application of watermelon genetic map construction and gene mapping in recent years， and discussed the main problems and future research trends of watermelon genetic map construction.

Key words： Watermelon; Genetic map; Gene mapping

西瓜（Citrullus lanatus）原產(chǎn)于非洲，是一種重要的葫蘆科（Cucurbitaceae）作物，其果實(shí)營養(yǎng)豐富，甘甜多汁，具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在世界主要農(nóng)業(yè)產(chǎn)區(qū)廣泛種植。中國是世界最大的西瓜生產(chǎn)國和消費(fèi)國（FAO，http：//faostat.fao.org），2016 年我國西瓜種植面積達(dá)189萬hm2[1]。西瓜的染色體數(shù)為2n=2x=22，基因組大小為425 Mb，遺傳背景較狹窄、遺傳多樣性水平低，且由于長期的人工選擇，栽培西瓜的遺傳基礎(chǔ)越來越狹窄，限制了多態(tài)性位點(diǎn)的獲得，使得西瓜品種改良和分子標(biāo)記輔助育種發(fā)展緩慢。通過構(gòu)建西瓜高密度遺傳圖譜可進(jìn)行基因定位，挖掘重要性狀相關(guān)的優(yōu)異基因，開發(fā)連鎖標(biāo)記，為品種改良或新品種選育工作提供快捷準(zhǔn)確的輔助工具。

隨著高通量測序等技術(shù)的快速發(fā)展及西瓜參考基因組的組裝完成，可獲得大量多態(tài)性分子標(biāo)記，滿足了構(gòu)建高密度遺傳圖譜的需求。通過構(gòu)建高密度遺傳圖譜可定位與重要農(nóng)藝性狀相關(guān)的位點(diǎn)，以獲得與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，促進(jìn)了分子標(biāo)記輔助育種的發(fā)展。因此，近年來西瓜遺傳圖譜的構(gòu)建和分子標(biāo)記輔助育種成為研究熱點(diǎn)。筆者對(duì)近年來西瓜遺傳圖譜構(gòu)建、重要農(nóng)藝性狀基因定位的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為分子標(biāo)記輔助育種提供參考，加快西瓜遺傳背景研究和育種進(jìn)程。

1 西瓜遺傳圖譜構(gòu)建

遺傳圖譜是以摩爾根的染色體重組與交換定律為理論基礎(chǔ)，根據(jù)不同遺傳標(biāo)記間的重組率及其所提供的遺傳信息進(jìn)行分析，獲得遺傳標(biāo)記在染色體上相對(duì)位置的線性排列圖[2-3]。構(gòu)建具有大量遺傳標(biāo)記的高密度遺傳圖譜在了解基因組結(jié)構(gòu)與功能、解釋基因重組規(guī)律與進(jìn)化、基因定位與克隆、作物遺傳育種等研究中起到了重要作用[4]。

構(gòu)建遺傳圖譜主要包括以下幾個(gè)方面：（1）選擇合適的作圖親本;（2）構(gòu)建符合研究要求的作圖群體;（3）選擇合適的多態(tài)性分子標(biāo)記，用于對(duì)群體基因型鑒定分析;（4）根據(jù)重組率利用相關(guān)作圖軟件計(jì)算分子標(biāo)記間的連鎖排序和遺傳距離以構(gòu)建連鎖圖譜。其中選擇合適的作圖群體和分子標(biāo)記是構(gòu)建高質(zhì)量遺傳圖譜和進(jìn)行相關(guān)遺傳分析的基礎(chǔ)。

早在20世紀(jì)80年代，Navot等[5]就利用同工酶等生化標(biāo)記第1次構(gòu)建了含有4個(gè)連鎖群的西瓜連鎖圖譜，通過對(duì)回交群體進(jìn)行遺傳分析確定了19種編碼蛋白基因的連鎖關(guān)系。但是早期的形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記等多態(tài)性較差，穩(wěn)定性不好，檢測方法復(fù)雜，直到日本學(xué)者Hashizume等[6]利用RAPD、RFLP、同工酶等標(biāo)記構(gòu)建了第1張真正意義上的西瓜分子遺傳圖譜，之后陸續(xù)發(fā)布了多張西瓜遺傳連鎖圖譜，這些圖譜主要基于RFLP、RAPD、AFLP、SRAP、SSR等分子標(biāo)記[7-8]，但以上圖譜大都含有不止11條染色體，標(biāo)記飽和度低且分布不均。表1中列出了到目前為止已發(fā)表的西瓜遺傳圖譜。

直到2012年，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展和西瓜參考基因組的發(fā)布，通過全基因組重測序技術(shù)發(fā)掘分子標(biāo)記以構(gòu)建高密度遺傳圖譜成為了可能[28]。Ren等[20]基于全基因組測序數(shù)據(jù)，利用來自‘97103和‘296341-FR的重組自交系（103株），構(gòu)建了第1張西瓜高密度遺傳圖譜，該遺傳圖譜有11個(gè)連鎖群，包含698個(gè)SSR、219個(gè)InDel和36個(gè)SV標(biāo)記，圖譜總長度約800 cM，平均圖距為0.8 cM。Sandlin等[29]構(gòu)建了世界上第1張以SNP為作圖標(biāo)記的西瓜遺傳圖譜，該圖譜包含378個(gè)SNP標(biāo)記，平均圖距為5.1 cM。但此圖譜僅含有378個(gè)SNP標(biāo)記，圖譜飽和度低，且包含的連鎖群大于11個(gè)，圖譜中存在較大的間隙，圖譜質(zhì)量較差。為了進(jìn)一步提高圖譜飽和度，Ren等[7]整合2個(gè)實(shí)驗(yàn)室基于4個(gè)遺傳群體（親本包含祖先種 C. lanatus subsp. lanatus L.、半野生種C. lanatus subsp. mucosospermus L.、栽培種C. lanatus subsp. vulgaris L.）的遺傳圖譜和分子標(biāo)記（SSR、Indel、SV、SNP），構(gòu)建了1張一致性整合圖譜。該整合圖譜共包含標(biāo)記1 339個(gè)，其中包括689個(gè)SSR標(biāo)記，219個(gè)Indel標(biāo)記，386個(gè)SNP標(biāo)記，圖譜總長度798 cM，平均圖距0.6 cM。該整合圖譜提高了西瓜遺傳圖譜的飽和度，但對(duì)于實(shí)現(xiàn)基因精確定位和基因克隆等目的還是不夠[22]。

為了增加標(biāo)記密度、豐富西瓜標(biāo)記資源，Ren 等[22]利用基于高通量測序技術(shù)的DArTseqTM方法，以西瓜栽培種‘K3與野生種質(zhì)資源‘PI 189225的雜交后代F2群體（144株）為作圖群體構(gòu)建了1張西瓜高密度遺傳圖譜。該圖譜總長度1 099.2 cM，包含11個(gè)連鎖群，由1 161個(gè)bin 標(biāo)記組成，上圖SNP有3 465個(gè)，平均圖距為1.0 cM。Lamble等[30]利用266個(gè)SNP構(gòu)建了1張覆蓋11個(gè)連鎖群的遺傳圖譜。Nimmakayala等[21]利用282個(gè)多態(tài)性標(biāo)記（232個(gè)SNP和20個(gè)SSR標(biāo)記）構(gòu)建了1張總長度924.72 cM的遺傳圖譜，包含11個(gè)連鎖群，平均圖距3.28 cM。Liu等[23]利用親本‘COS和‘LSM的全基因組重測序數(shù)據(jù)，以‘COS和‘LSW-177的雜交后代F2群體（352株）為作圖群體，構(gòu)建了1張總長度1 836.51 cM覆蓋11個(gè)連鎖群的遺傳圖譜，包含264個(gè)CAPS和37個(gè)SSR標(biāo)記，平均圖距為6.1 cM。Cheng等[24]以包含145個(gè)單株的F2∶3分離群體為作圖群體，構(gòu)建1張由125個(gè)多態(tài)性標(biāo)記組成的遺傳連鎖圖譜，含有14個(gè)連鎖群，總長度為1 244.5 cM，包含82個(gè)CAPS、43個(gè)SSR標(biāo)記，平均圖距為9.96 cM。Shang等[4]利用簡化基因組測序技術(shù)（SLAF-seq）以西瓜栽培種‘ZXG01478和‘14CB11的雜交后代F2（93株）為作圖群體構(gòu)建了1張西瓜高密度遺傳圖譜，該圖譜總長度為1 906.31 cM，包含2 634個(gè)SNP標(biāo)記，覆蓋11個(gè)連鎖群，平均圖距為0.72 cM。遲瑩瑩等[25]利用全基因重測序數(shù)據(jù)，以西瓜栽培種‘W1-1和黏籽西瓜‘PI 186490為親本雜交獲得的BC1P1群體（225株）為作圖群體，構(gòu)建了1張包含11個(gè)連鎖群的遺傳圖譜，覆蓋長度為1 376.95 cM，包含200個(gè)CAPS標(biāo)記，標(biāo)記間的平均圖距為6.88 cM。Zhang等[26]以相同的群體材料構(gòu)建了另1張遺傳圖譜，覆蓋長度1 468.09 cM，包含11個(gè)連鎖群和186個(gè)CAPS標(biāo)記。以上圖譜大都基于簡化基因組測序或只對(duì)親本進(jìn)行了重測序，得到的可用SNP標(biāo)記較少，限制了圖譜清晰度的進(jìn)一步提高和QTL定位等研究的進(jìn)展。Li等[27]基于全基因組重測序技術(shù)，以‘9904和‘Handel雜交得到的重組自交系為作圖群體，對(duì)126個(gè)重組自交系單株和2個(gè)親本進(jìn)行了重測序，親本間共檢測到178 762個(gè)適用于RILs且深度不低于4X的SNP標(biāo)記，其中上圖的SNP共103 029個(gè)。構(gòu)建的遺傳圖譜包括11個(gè)連鎖群，總圖距為 1 508.94 cM，包含2 132個(gè)Bin標(biāo)記，平均圖距為0.74 cM。到目前為止，已報(bào)道20多張西瓜遺傳圖譜，促進(jìn)了西瓜重要農(nóng)藝性狀基因定位和分子標(biāo)記輔助育種的發(fā)展（表1）。

2 重要農(nóng)藝性狀基因定位

西瓜重要農(nóng)藝性狀的基因定位研究主要集中在果實(shí)品質(zhì)、外觀等相關(guān)性狀中，如含糖量、皮色、瓤色、果形等。通過對(duì)這些農(nóng)藝性狀的定位研究，為實(shí)現(xiàn)相關(guān)基因的克隆、開展分子標(biāo)記輔助育種、進(jìn)行基因功能驗(yàn)證和闡明其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

2.1 含糖量相關(guān)基因定位

西瓜果實(shí)含糖量一直是西瓜最重要的商品性狀之一。2012年，Guo等[28，31]發(fā)布了西瓜參考基因組序列，在基因組水平上對(duì)可能影響糖分積累有關(guān)的基因進(jìn)行了描述，包含76個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、62個(gè)糖代謝基因，其中14個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和13個(gè)糖代謝基因在西瓜果實(shí)糖分積累過程中存在差異表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)193個(gè)在果實(shí)不同發(fā)育期存在差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。這些研究為確定與糖分積累相關(guān)的候選基因提供了基礎(chǔ)。Ren等[32]將58個(gè)已發(fā)表的與糖分積累有關(guān)的QTL和12個(gè)新發(fā)現(xiàn)的QTL整合到1張遺傳圖譜中，發(fā)現(xiàn)QBTX2-1、QBRIX2-2及QBRIX2-3可以在不同的遺傳背景下被檢測到，并通過后續(xù)試驗(yàn)確定ClTST2為影響含糖量的候選基因，具有單糖和二糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能。Cheng等[24]通過構(gòu)建遺傳圖譜確定了4個(gè)與果實(shí)含糖量有關(guān)的QTL（FCR10.1 10、SCE1.1 1、GCE1.1 1、BCC2.1 2）。遲瑩瑩等[25]通過構(gòu)建西瓜遺傳圖譜檢測到3個(gè)與中心可溶性固形物含量相關(guān)的QTL（CTSS2.1、CTSS2.2、CTSS8.1）和1個(gè)與邊緣可溶性固形物含量相關(guān)的QTL（ETSS2.1）。Liu等[23]通過構(gòu)建CAPS和SSR遺傳圖譜檢測到3個(gè)與糖含量有關(guān)的QTL（BCC2.1、BCE2.1、BCE4.1）。

2.2 果皮顏色相關(guān)基因定位

果皮顏色是影響西瓜商品價(jià)值的重要因素，目前關(guān)于西瓜皮色相關(guān)的遺傳定位報(bào)道較少。PARK等[33]通過構(gòu)建遺傳圖譜，定位到3個(gè)獨(dú)立位點(diǎn)，S位點(diǎn)控制果皮條紋（有條紋vs無條紋），D位點(diǎn)控制果皮顏色深度（墨綠vs淺綠），Dgo位點(diǎn)控制果皮顏色類型（綠色vs黃色）。其中S位點(diǎn)定位到6號(hào)染色體25 767 kb后的區(qū)域內(nèi)，D位點(diǎn)定位到8號(hào)染色體的末端，Dgo位點(diǎn)定位到4號(hào)染色體前150 kb區(qū)間內(nèi)。Dou等[34]通過BSA關(guān)聯(lián)分析將與黃色果皮相關(guān)的位點(diǎn)定位到4號(hào)染色體1 bp～7 Mb范圍內(nèi)，并通過后續(xù)試驗(yàn)將候選區(qū)間縮小到1 bp～58.8 kb。Li等[27]通過構(gòu)建高密度遺傳圖譜將控制墨綠色和淺綠色果皮的位點(diǎn)定位到8號(hào)染色體 142.7～154.7 cM范圍內(nèi)。

2.3 果肉顏色相關(guān)基因定位

據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，西瓜果肉顏色的變化主要是由于番茄紅素、類胡蘿卜素等組分和含量差異引起的[35-36]。Bang等[37]報(bào)道，西瓜果肉黃色對(duì)紅色為顯性，番茄紅素β-環(huán)化酶基因（LCYB）是影響西瓜紅色或黃色果肉形成的主要因素，并設(shè)計(jì)了一個(gè)與LCYB基因緊密連鎖的CAPS標(biāo)記。Zhang等[26]通過構(gòu)建遺傳圖譜定位到一個(gè)與紅色果肉有關(guān)的顯著性QTL，位于4號(hào)染色體1.07 Mb范圍內(nèi)。Liu等[23]利用不同作圖群體在4號(hào)染色體的相似位置定位到一個(gè)顯著性QTL。Zhang等[38]通過轉(zhuǎn)錄組分析證明候選基因Cla017962的表達(dá)量會(huì)影響果肉中類胡蘿卜素的含量，進(jìn)而影響西瓜果肉顏色，并通過一系列后續(xù)試驗(yàn)找到了2個(gè)調(diào)控Cla017962基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子（ClbZIP1、ClbZIP2）。

2.4 果形相關(guān)基因定位

Weetman等[39]提出西瓜果實(shí)形狀表現(xiàn)為不完全顯性的單基因控制，即OO為長瓜，Oo為橢圓瓜，oo為圓形瓜。Sandlin等[29]通過構(gòu)建遺傳圖譜定位到10個(gè)與西瓜果實(shí)長度有關(guān)的QTL。Ren等[7]通過構(gòu)建西瓜整合遺傳圖譜定位到多個(gè)與西瓜果形（果實(shí)長度、果實(shí)寬度、果形指數(shù)、果實(shí)質(zhì)量）有關(guān)的QTL。Cheng等[24]通過構(gòu)建遺傳圖譜定位到6個(gè)與果實(shí)形狀有關(guān)的QTL。Liu等[23]通過構(gòu)建遺傳圖譜定位到8個(gè)與果實(shí)長度、果實(shí)寬度、果形指數(shù)有關(guān)的QTL。Dou等[40]通過BSA-seq和GWAS分析將控制西瓜果實(shí)形狀的基因定位在3號(hào)染色體上，并通過后續(xù)精細(xì)定位確定ClFS1（Cla011257）為控制果實(shí)形狀的候選基因。

2.5 西瓜其他農(nóng)藝性狀基因定位

Prothro等[41]通過構(gòu)建遺傳圖譜定位到9個(gè)與性別表達(dá)有關(guān)的QTL。Zhang等[26]在西瓜1號(hào)染色體W04-84～W04-94間定位到1個(gè)與果實(shí)苦味有關(guān)的位點(diǎn)。Dong等[42]通過BSA-seq技術(shù)及后續(xù)實(shí)驗(yàn)定位到一個(gè)與西瓜植株短蔓相關(guān)的候選基因Cla010726。Wei等[43]通過構(gòu)建分離群體并結(jié)合RNA-seq等方法，定位到控制西瓜裂葉的基因ClLL1，該基因部分序列的缺失影響了西瓜葉片的正常表現(xiàn)型。遲瑩瑩等[25]通過構(gòu)建遺傳圖譜檢測到5個(gè)與果實(shí)硬度相關(guān)的QTL，4個(gè)與種皮底色相關(guān)的QTL，2個(gè)與種子百粒重有關(guān)的QTL。Gao等[44-45]通過構(gòu)建分離群體結(jié)合轉(zhuǎn)錄組、BSA-seq分析等，將控制西瓜果肉硬度、果肉酸味的基因分別定位到6號(hào)染色體12 780 793～17 658 672 bp和4 529 126～4 855 093 bp區(qū)域內(nèi)。

隨著西瓜重要農(nóng)藝性狀相關(guān)QTL和基因的確定，推動(dòng)了相關(guān)分子遺傳機(jī)制的研究，并提供了大量可用于育種生產(chǎn)的分子標(biāo)記，加快了育種進(jìn)程。

3 問題與展望

構(gòu)建高密度遺傳圖譜是進(jìn)行重要農(nóng)藝性狀基因定位、圖位克隆及分子標(biāo)記輔助育種的重要工具。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展和西瓜參考基因組裝配的完成，在全基因組水平上開發(fā)分子標(biāo)記以構(gòu)建飽和度更高的遺傳圖譜成為可能。但與其他園藝作物相比，西瓜的分子生物學(xué)研究仍有不足之處，主要有以下3個(gè)方面：（1）目前相關(guān)性狀的基因定位主要集中在初期的QTL發(fā)掘上，相關(guān)精細(xì)定位和基因克隆等研究較少，不能很好地應(yīng)用于分子遺傳育種，需要進(jìn)一步提高西瓜遺傳圖譜飽和度;（2）目前作圖群體大多是臨時(shí)性分離群體且群體數(shù)目偏小，不能進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，影響相關(guān)基因定位工作的準(zhǔn)確性;（3）早期構(gòu)建的西瓜遺傳圖譜大多基于RAPD、AFLP等標(biāo)記，穩(wěn)定性較差，不利于不同圖譜的整合工作和分子標(biāo)記輔助育種等。

目前構(gòu)建遺傳圖譜的發(fā)展趨勢是高飽和度、高通用性等，因此建議在以下3個(gè)方面加強(qiáng)工作：（1）擴(kuò)大作圖群體，構(gòu)建穩(wěn)定的永久性作圖群體，構(gòu)建更高密度和標(biāo)記分布更均勻的遺傳連鎖圖譜，以滿足西瓜分子遺傳研究的要求;（2）對(duì)西瓜遺傳育種上具有重要價(jià)值的性狀基因進(jìn)行深入研究，促進(jìn)分子標(biāo)記輔助育種的發(fā)展，加快育種過程;（3）對(duì)現(xiàn)有的西瓜遺傳圖譜進(jìn)行整合，以提高西瓜遺傳圖譜的飽和度和通用性。通過構(gòu)建高密度遺傳圖譜，進(jìn)行相關(guān)性狀的基因定位以促進(jìn)分子標(biāo)記輔助育種，必將提高西瓜遺傳育種效率，加快育種進(jìn)展。

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