一個中國Alport綜合征家系中剪接突變及致病性分析

呂 幸，吳維青，崔英霞，陳芳芳，孫 寧，姚新月，夏正坤，劉志紅，李曉軍

0 引 言

Alport綜合征（Alport Syndrome，AS）作為常見的遺傳性腎小球疾病，臨床主要表現(xiàn)為血尿伴或不伴蛋白尿和進行性腎功能衰竭，部分患者還患有感音神經(jīng)性耳聾或眼部異常［1-2］。AS由于編碼Ⅳ型膠原α鏈的基因——COL4A5、COL4A4、COL4A3發(fā)生突變引起，根據(jù)遺傳方式的不同可以分為X連鎖顯性遺傳Alport綜合征（XLAS，OMIM no.301050），常染色體隱性遺傳Alport綜合征（ARAS OMIM no.104200）以及常染色體顯性遺傳Alport綜合征（ADAS OMIM no.203780）［3-4］。COL4A5 基因突變造成的 XLAS 是最常見的Alport綜合征，約占總發(fā)病率的85%［5-6］。

目前超過1168種COL4A5基因突變已被發(fā)現(xiàn)，其中剪接突變約占20%［7］。研究認為，實際的剪接突變遠不止如此，大多數(shù)已報道的突變未在RNA水平進行分析，一些錯義突變、無義突變，甚至同義突變也可能影響pre-mRNA的剪接過程［8-10］。對AS患者的可疑基因變異進行功能性分析有助于闡明其發(fā)病的分子機制。

本研究通過目標序列捕獲聯(lián)合高通量測序技術對一個中國Alport家系進行基因檢測，發(fā)現(xiàn)一個新的COL4A5基因突變，體外Minigene實驗證明此突變影響pre-mRNA的剪接過程。

1 資料與方法

1.1 研究對象先證者，女，9歲，因血尿伴蛋白尿50天就診于我院兒科。常規(guī)檢查示：尿紅細胞計數(shù)859.3/μL↑、尿蛋白定量3.34 g/24h↑。聽力及眼底檢查未發(fā)現(xiàn)異常。腎穿刺活檢術光鏡下15個腎小球中2個節(jié)段硬化，余腎小球偶見系膜區(qū)輕度增寬，囊壁節(jié)段增厚。腎小管間質(zhì)輕度慢性病變，多灶性萎縮、基膜增厚，腎小管上皮細胞細顆粒變性，間質(zhì)纖維化伴少量單個核細胞浸潤，見大量泡沫細胞多灶性分布。電鏡下顯示腎小球系膜區(qū)偶見增寬，基膜偏?。?0%～70%）。厚度 130～250 nm，較厚處250～460 nm，基膜致密層未見撕裂分層。腎小球足細胞足突廣泛融合（50%～60%）。免疫熒光檢查見腎小球IgM+彌漫分布，呈顆粒狀沉積于系膜區(qū)。腎組織冰凍切片Ⅳ型膠原檢查：α3、α5鏈均節(jié)段缺失。根據(jù)患者臨床表現(xiàn)及病理檢查結果，該患兒高度疑診為Alport綜合征。臨床建議行基因檢測明確診斷。

1.2 家系調(diào)查和樣本收集對患兒3代以內(nèi)的親屬進行家系調(diào)查，包括年齡、性別、患病情況等，繪制家系圖。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準（批準文號：2015NZKY-007-004），獲得患兒及家屬知情同意后采集家系內(nèi)共8人外周靜脈血。

1.3 高通量測序及家系驗證按照血液基因組DNA提取試劑盒說明書提取患兒及家屬全基因組DNA。本實驗前期設計并制定了包含78個常見遺傳性腎病相關致病基因的液相探針捕獲芯片，包括COL4A3、COL4A4、COL4A5基因在內(nèi)［11］。應用此目標序列捕獲芯片聯(lián)合高通量測序技術檢測78個相關基因外顯子是否存在可疑致病突變，檢出的可突變與千人數(shù)據(jù)庫、dbSNP數(shù)據(jù)庫、ESP外顯子數(shù)據(jù)庫及華大本地數(shù)據(jù)庫進行比對。應用PolyPhen-2、SIFT和MutationTaster軟件進行突變功能預測。Phylop軟件用于SNPs保守性預測。對8位家系成員進行Sanger測序。針對檢測出的變異位點設計特異引物進行PCR擴增，見表1。擴增產(chǎn)物采用ABI3730xl DNA測序儀進行雙端測序，并比對分析測序結果。

1.4 剪接突變預測采用在線分析軟件Human Splicing Finder3.0、MutPredSplice預測突變對剪接過程的影響。

1.5 Minigene技術

1.5.1 質(zhì)粒構建以患者或正常家系成員的基因組DNA為模板，根據(jù)基因變異位點設計特異性引物對COL4A5基因外顯子32、33，內(nèi)含子32及上下游側(cè)翼序列（1408bp）進行PCR擴增，見表1。在1.5%瓊脂糖凝膠上進行PCR產(chǎn)物純度檢測，并切膠純化得到目的片段。將PCAS2質(zhì)粒（中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所張學教授贈予）通過BamH1酶（酶切位點位于外顯子A、B之間）酶切后進行膠回收純化。然后將目的片段和酶切質(zhì)粒用連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，經(jīng)LB固體培養(yǎng)基增殖12 h后，挑選單克隆菌落并進行質(zhì)粒提取。經(jīng)測序驗證后，分別得到野生型質(zhì)粒PCAS2-WT和突變型質(zhì)粒PCAS2-MT。

1.5.2 細胞培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)染實驗將293T細胞在90%DMEM+10%FBS，37℃，5%CO2條件下進行培養(yǎng)，細胞在六孔板上培養(yǎng)至60%～85%后進行轉(zhuǎn)染。按照Jet Primer試劑說明書，分別將PCAS2-WT、PCAS2-MT轉(zhuǎn)染至293T細胞中，培養(yǎng)24 h。

表1 PCR擴增引物Table 1 Primer sequences of PCR amplification

1.5.3 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分析將轉(zhuǎn)染24 h后的293T細胞用TRIZOL提取RNA，置于-80℃保存。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。設計逆轉(zhuǎn)錄引物，以cDNA為模板進行RT-PCR，見表1。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，觀察PCAS2-WT、PCAS2-MT片段長度變化；并對產(chǎn)物進行Sanger測序，與參考序列進行比對分析。

2 結 果

2.1 家系調(diào)查該家系3代共10名成員，其中Ⅰ-2、Ⅱ-2、Ⅲ-1、Ⅲ-2均發(fā)現(xiàn)血尿，同時Ⅰ-2、Ⅲ-1合并有蛋白尿，家系成員血壓及腎功能均正常。家系內(nèi)否認近親結婚史。家系圖見圖1。

圖1 一個中國Alport綜合征家系系譜圖Figure 1 Pedigree diagram of the Chinese family with Alport syndrome

2.2 基因分析先證者（Ⅲ-1）檢測出一COL4A5基因雜合變異c.2767G＞T（p.Gly923Cys）。Sanger測序顯示此家系中所有患者（Ⅰ-2、Ⅱ-2、Ⅲ-1、Ⅲ-2）均攜帶c.2767G＞T雜合變異，而其他成員未檢出此變異，呈現(xiàn)家系共分離現(xiàn)象。生物信息學分析表明，COL4A5 c.2767G＞T為錯義突變，造成Ⅳ型膠原α5鏈第923位甘氨酸置換為半胱氨酸，該變異在千人數(shù)據(jù)庫，dbSNP數(shù)據(jù)庫，ESP6500數(shù)據(jù)庫及華大基因本地數(shù)據(jù)庫中均未檢出，SIFT、PolyPhen-2、Mutation-Taster預測均為有害變異，Phylop軟件預測此突變位點在靈長類、脊椎動物及哺乳動物分值分別為0.594、5.903、2.466，均為保守序列。根據(jù)ACMG標準，此變異屬于可能致病性變異［12］。經(jīng)檢索人類基因突變數(shù)據(jù)庫和文獻，此基因變異未見報道，為新發(fā)現(xiàn)的基因變異。

HSF3.0預測此突變可能通過破壞野生型供體剪接位點、外顯子剪接增強子或產(chǎn)生新的外顯子剪接沉默子等途徑影響剪接過程；MutPredSplice預測該錯義變異影響剪接分值為0.9分，可能為剪接變異。

2.3 Minigene實驗轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)電泳得到兩條不同長度的條帶，見圖2。PCAS2-WT轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與預期的長度450bp一致；而PCAS2-MT轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物條帶低于450bp，說明突變型質(zhì)粒發(fā)生了剪接變化，得到了不同的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

圖2 Minigene實驗RT-PCR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分析Figure 2 RT-PCR transcription products of minigene assay

測序結果與參考序列進行對比分析，發(fā)現(xiàn)PCAS2-WT轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物序列為外顯子A、外顯子32、33和外顯子B，而PCAS2-MT轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物序列為外顯子A、外顯子33和外顯子B，見圖3。因此，COL4A5基因上c.2767G＞T變異在293T細胞上造成32號外顯子缺失。

圖3 Minigene實驗RT-PCR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分析Figure 3 RT-PCR transcription products of minigene assay

3 討 論

19 世紀，F(xiàn)liter［1］和 Gregory等［13］分別提出了 AS的臨床診斷標準，通過臨床表現(xiàn)、家族史，結合腎組織病理檢查和Ⅳ型膠原α鏈染色，大多數(shù)病例可明確診斷。然而在實際的臨床工作中，幼年及女性AS患者常呈現(xiàn)不典型的腎組織病理改變，且部分患者缺乏腎外表現(xiàn)，故基因診斷是確診Alport綜合征的有效手段［14-15］。

AS是由于編碼Ⅳ型膠原α鏈的基因COL4An基因發(fā)生突變導致，COL4A3、COL4A4、COL4A5基因分別含有52、48、51個外顯子，基因龐大且無熱點突變，傳統(tǒng)的Sanger測序耗費人力、物力，因此目標序列捕獲測序技術應運而生，成為一種高效、低成本的基因診斷方法。此前，本課題組設計了包含78個遺傳性腎病相關基因的捕獲芯片，聯(lián)合高通量測序技術，對遺傳性腎病患者進行檢測，能在較短的周期內(nèi)發(fā)現(xiàn)大多數(shù)患者的基因突變［11，16］。本研究納入一個臨床疑似AS家系，先證者腎活檢電鏡缺乏典型表現(xiàn)，但腎組織膠原染色異常。為進一步確診，應用目標序列捕獲聯(lián)合高通量測序技術對先證者進行基因分析，結果發(fā)現(xiàn)一個雜合COL4A5基因變異c.2767G＞T（p.Gly923Cys）。

本研究中發(fā)現(xiàn)的COL4A5基因變異c.2767G＞T（p.Gly923Cys），通常認為此類變異是造成單個氨基酸替換的錯義突變。但考慮到該突變位于32號外顯子最后1位堿基，有可能影響RNA剪接過程。有文獻報道，外顯子上的錯義突變經(jīng)檢測mRNA后證實為剪接突變［17-19］。因此，本研究首先利用軟件預測，發(fā)現(xiàn)該變異可能影響pre-mRNA剪接。為進一步驗證其致病性，進行了體外Minigene實驗。結果表明，此突變導致COL4A5基因32號外顯子90個堿基完全缺失。COL4A5基因編碼產(chǎn)物為Ⅳ型膠原α5鏈，共有1685個氨基酸，其中富含甘氨酸三聯(lián)結構（Gly-X-Y）的中間膠原區(qū)對維持Ⅳ型膠原三螺旋結構的穩(wěn)定性有重要作用。c.2767G＞T突變位于膠原編碼區(qū)，造成了10個Gly-X-Y序列的缺失，可能產(chǎn)生不穩(wěn)定的Ⅳ型膠原并影響其正常功能。大多數(shù)遺傳性疾病的突變分析只在基因組DNA水平進行，少有突變通過實驗驗證其對mRNA表達及剪接過程的影響。在已經(jīng)DNA和RNA水平驗證的錯義突變中，約50%的突變被證實產(chǎn)生了異常剪接［20］。除經(jīng)典剪接位點外，內(nèi)含子上的分支位點、多聚嘧啶序列，以及外顯子和內(nèi)含子上的剪接增強子（ESE/ISE）和沉默子（ESS/ISS）發(fā)生突變均可能影響pre-mRNA剪接［21］。外顯子最后1位堿基發(fā)生突變可能通過影響臨近內(nèi)含子的5’剪接位點，使得剪接體錯誤識別，進而產(chǎn)生異常的剪接產(chǎn)物［22］。因此，對外顯子及深度內(nèi)含子上的可疑突變應同時進行DNA和RNA水平的分析，有助于理解疾病的分子發(fā)病機制。

確定一個特定的突變是否影響剪接，最直接有效的方法就是提取患者腎或者皮膚組織中的RNA進行分析，而組織提取為侵入性實驗。有研究者成功從AS患者的30根發(fā)根中提取出RNA進行轉(zhuǎn)錄分析［17，23］。遺憾的是，本例患者拒絕提供發(fā)根，而外周血中的RNA表達量極低，導致我們無法進行體內(nèi)RNA水平的分析。因此，本研究僅采用體外Minigene技術分析潛在的剪接突變［24-25］。此前，研究者對其他遺傳性腎病基因突變進行分析，發(fā)現(xiàn)Minigene實驗結果與患者體內(nèi)RNA表達基本一致，證實Minigene技術是一種簡單有效的剪接突變分析方法［26-27］。

總之，本研究通過目標序列捕獲芯片聯(lián)合高通量測序技術在一中國XLAS家系中發(fā)現(xiàn)了一個新的COL4A5基因c.2767G＞T外顯子雜合突變；并通過體外Minigene實驗發(fā)現(xiàn)此突變影響mRNA剪接過程，導致COL4A5基因32外顯子缺失。