CO2激光處理對(duì)燈盞花種子萌發(fā)的影響研究

(西雙版納職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 景洪 66100)

燈盞花學(xué)名短葶飛蓬(Erigeronbreviscapus(Vant.) Hand. -Mazz.)，為菊科飛蓬屬(Erigeron)植物，以全草入藥稱燈盞細(xì)辛，為云南省優(yōu)勢道地藥材之一[1]。由于燈盞花中的黃酮類和酚酸類化學(xué)成分在治療心腦血管疾病方面有特效，所以被廣泛的用作益脈康片、燈盞花素片、燈盞細(xì)辛注射液等藥品的原料，藥材年需求量約為3 100 t，而且市場需求量在逐年遞增[2]。為滿足燈盞花原料的需求，國內(nèi)廣泛開展了相關(guān)的遺傳育種和規(guī)范種植的研究工作。盡管燈盞花優(yōu)質(zhì)品種的選育和栽培研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但目前以種子育苗移栽仍為燈盞花繁殖的主要技術(shù)手段之一[3-5]。然而燈盞花種子繁殖系數(shù)低，難以滿足市場需求[6]。 提高燈盞花種子的繁殖系數(shù)，對(duì)于燈盞花的人工種植具有積極地意義。

激光可以通過光、電、熱、壓力和磁效應(yīng)的綜合作用產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，從而影響植物的生理生化和遺傳效應(yīng)，廣泛應(yīng)用于遺傳育種和生物刺激效應(yīng)的研究[7]。已有學(xué)者嘗試使用激光處理燈盞花，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，He-Ne激光可以增加種子發(fā)芽率，保護(hù)愈傷組織的細(xì)胞膜，提高出愈率及愈傷組織誘導(dǎo)芽和生根效果；CO2激光可明顯影響種子化學(xué)成分[8-9]。但關(guān)于CO2激光對(duì)燈盞花種子發(fā)芽效果及移栽后幼苗生理特征的影響并未考察。本研究主要觀察了CO2激光對(duì)燈盞花種子萌發(fā)及幼苗生長特征的干預(yù)作用，以期為燈盞花的培育種植提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材料和試劑

燈盞花種子購于云南瀘西，手工去除其中不飽滿種子和絨毛。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

CWQ 600型CO2激光器，南京來創(chuàng)激光科技有限公司，波長1 060 mm；Vega數(shù)字激光功率計(jì)，北京時(shí)陽電子科技公司； DDB-303 A電導(dǎo)儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；UV-2700紫外可見分光光度計(jì)，日本島津。

2 方 法

2.1 種子的激光輻照處理

選取大小均一的種子，100粒為1組，溫水浸泡2 h后進(jìn)行輻照。所用的CO2激光擴(kuò)束后光斑直徑為25 mm，照射距離30 cm，功率密度3 mW·mm-2。輻照時(shí)間分別為0，10，20，30，40，50 s (0 s作為對(duì)照組)。

2.2 發(fā)芽率和發(fā)芽勢的測定

激光輻照后，將種子置于放有2層濕潤濾紙的發(fā)芽皿中培養(yǎng)，置于恒溫箱內(nèi)，25 ℃下暗培養(yǎng)，定時(shí)換水并清理濾紙，觀察種子萌發(fā)情況。以胚根伸出等于或者超過種子長度視為發(fā)芽，第4天種子開始發(fā)芽，第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢。每天記錄發(fā)芽種子數(shù)量至12 d[10]結(jié)束。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均發(fā)芽率和發(fā)芽勢。

2.3 種子萌發(fā)過程中相關(guān)生理指標(biāo)的測定

每3天測定子葉的細(xì)胞膜透性、可溶性糖、可溶性蛋白以及丙二醛(MDA)含量。采用電導(dǎo)儀測定法測定細(xì)胞膜透性[11]，蒽酮比色法測定可溶性糖含量[12]，考馬斯亮藍(lán) G-250 法測定可溶性蛋白含量[12]。

表3 CO2激光輻照對(duì)燈盞花種子細(xì)胞膜透性的影響

輻照時(shí)間/s相對(duì)細(xì)胞膜透性/%0d3d6d9d12d011.86±1.1712.01±1.0712.16±1.3912.16±1.0212.09±1.051012.31±1.0411.68±1.6811.95±2.1812.19±1.1412.36±1.132012.51±1.8812.20±1.1212.06±1.5012.29±2.1311.79±1.123012.13±1.2512.29±1.9412.21±1.1111.99±1.0311.60±1.064039.22±4.39??45.55±4.32??50.70±5.78??54.60±5.48??59.91±7.29??5039.17±3.62??43.03±4.02??55.22±7.32??59.24±6.72??61.48±5.17??

表4 CO2激光輻照對(duì)燈盞花種子可溶性糖含量的影響

輻照時(shí)間/s可溶性糖含量/(mg·g-1)0d3d6d9d12d017.73±1.4915.80±1.7312.73±1.4811.32±1.959.64±1.711017.46±1.5116.35±1.8913.23±1.1711.14±2.258.90±1.572018.58±0.8412.14±1.05??11.55±1.629.17±2.386.44±1.31??3017.45±1.2513.17±1.18??11.31±1.709.53±1.905.99±1.03??4018.19±1.0314.85±1.8213.78±2.0512.80±1.5311.14±1.745017.43±1.5715.36±1.0114.09±1.1413.15±1.3611.18±1.27

2.4 燈盞花幼苗形態(tài)的觀察

每組種子中隨機(jī)選20株萌發(fā)12 d的幼苗移栽到Hoagland營養(yǎng)液[13]中進(jìn)行水培。溫度10～25 ℃。每天補(bǔ)充蒸餾水保持培養(yǎng)液體積不變，并且觀察幼苗的生長情況。每5 d換1次營養(yǎng)液，30 d后測定株高、基葉長、基葉寬。營養(yǎng)液配方見表1。

表1 水培養(yǎng)用Hoagland營養(yǎng)液配方

成分含量/(mg·L-1)K2SO4607(NH4)2·HPO4115MgSO4493EDTA鐵鈉鹽20FeSO42.86Na2B4O5(OH)44.5MnSO42.13CuSO40.05ZnSO40.22(NH4)2SO40.02CaN2O6945

2.5 數(shù)據(jù)分析

使用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表制作，組間比較采用LSD檢驗(yàn)方法。

3 結(jié) 果

3.1 CO2激光輻照對(duì)燈盞花種子萌發(fā)指標(biāo)的影響

經(jīng)過CO2激光處理后，燈盞花種子萌發(fā)受到了明顯的影響。照射時(shí)間為20 s，30 s的種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢明顯高于對(duì)照組；而照射時(shí)間超過40 s后，種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢開始降低。

3.2 CO2激光輻照對(duì)燈盞花種子細(xì)胞膜透性的影響

CO2激光輻照10 s，20 s，30 s，對(duì)于細(xì)胞膜透性的影響不明顯；輻照 40 s，50 s細(xì)胞膜透性明顯升高，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞膜透性逐漸升高。

表2 不同波長激光對(duì)燈盞花種子發(fā)芽率的影響

時(shí)間/s發(fā)芽率/%發(fā)芽勢/%047.00±1.6324.33±1.251049.00±1.6323.00±0.272055.33±2.05?31.33±1.25??3064.33±2.05??35.67±1.25??4030.67±1.70??12.66±1.70??5021.67±1.70??9.33±1.25??

注：與對(duì)照組比較，*p<0.05，**p<0.01。下同。

3.3 CO2激光輻照對(duì)燈盞花種子可溶性糖含量的影響

可溶性糖是種子萌發(fā)早期重要的能量物質(zhì)，對(duì)幼胚的初期生長具有重要的作用。CO2激光對(duì)子葉中可溶性糖總量影響不大，但是CO2激光輻照20～30 s后，3 d時(shí)糖消耗速度明顯加快，到12 d可溶性糖含量低于對(duì)照組。輻照40 s，50 s可溶性糖消耗速度明顯降低，說明CO2激光可以提高可溶性糖的利用效率，從而促進(jìn)種胚的生長發(fā)育。

3.4 CO2激光輻照對(duì)燈盞花種子可溶性蛋白含量的影響

CO2激光輻照40 s，50 s子葉中可溶性蛋白含量明顯降低；輻照10 s，20 s，30 s以下蛋白含量無明顯變化。培養(yǎng)6～9 d，輻照20 s，30 s可溶性蛋白消耗速度加快，輻照40 s可溶性蛋白消耗速度減慢。

表5 CO2激光輻照對(duì)燈盞花種子可溶性蛋白含量的影響

輻照時(shí)間/s可溶性蛋白含量/(mg·g-1)0d3d6d9d12d013.41±1.0810.89±1.158.39±1.296.26±1.033.62±0.861013.43±1.0910.95±0.898.35±1.256.14±0.943.36±0.582013.09±1.0511.34±1.056.06±0.84??3.54±0.71??3.06±0.703012.89±0.9410.20±1.186.21±0.80??3.47±0.66??3.25±0.80409.64±1.24??9.97±1.829.95±1.318.09±0.837.58±1.62??508.98±1.16??9.90±1.019.99±1.287.97±0.547.53±1.67??

3.5 CO2激光輻照對(duì)燈盞花幼苗生長的影響

對(duì)萌發(fā)后的幼苗進(jìn)行進(jìn)一步的觀察研究，比較記錄激光處理后的燈盞花幼苗生長情況。觀察30 d幼苗生長情況，并且對(duì)株高、基葉長、基葉寬、單株基生葉數(shù)等指標(biāo)進(jìn)行了記錄和統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表6。

經(jīng)過CO2激光輻照10，20，30 s后，株高、基葉長度、寬度并無顯著性差異；輻照40，50 s的種子幼苗株高、基葉長均明顯低于對(duì)照組，表明過度輻照會(huì)使幼苗生長速度減慢。

表6 激光處理對(duì)于燈盞花幼苗形態(tài)的影響

輻照時(shí)間/s株高/cm基葉長/cm基葉寬/cm09.66±0.625.36±0.661.57±0.24109.42±0.805.65±0.651.54±0.18209.23±0.975.52±0.591.52±0.18309.58±0.785.68±0.631.60±0.12407.41±0.66?4.55±0.70?1.48±0.18506.64±0.81??4.45±0.74?1.42±0.14

4 討 論

使用激光輻照作物種子以達(dá)到打破種子休眠狀態(tài)，提高發(fā)芽率、發(fā)芽勢，促進(jìn)幼苗生長及早熟高產(chǎn)，增強(qiáng)植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力等目的的研究主要集中于小麥、玉米、大豆等糧食作物[14]。激光刺激植物的機(jī)制主要是其可以通過電磁效應(yīng)、光效應(yīng)、熱效應(yīng)和壓力效應(yīng)等多種效應(yīng)誘發(fā)生物性狀及染色體的變異。

本研究中采用的CO2激光在較低功率下對(duì)植物產(chǎn)生的主要為光效應(yīng)和電磁效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CO2激光輻照20 s或30 s，燈盞花種子發(fā)芽率及發(fā)芽勢明顯提高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過處理的種子子葉中可溶性糖及蛋白降低速度加快，可能是激光引起對(duì)上述物質(zhì)的利用效率提高促進(jìn)了種子的萌發(fā)。CO2激光輻照40 s以上時(shí)，種子的萌發(fā)以及相關(guān)物質(zhì)的利用被抑制，并進(jìn)一步影響了幼苗的生長。

試驗(yàn)表明：適宜劑量的CO2激光輻照引起燈盞花種子內(nèi)酶原C-N鍵的斷裂，酶的活性被激活，加速了胚對(duì)可溶性糖、蛋白等營養(yǎng)成分的利用，增加了種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢，起到了促進(jìn)種子萌發(fā)的作用。CO2激光過度輻照則引起燈盞花種子內(nèi)蛋白變性，膜透性增加，酶的分子結(jié)構(gòu)破壞，抑制了種子的萌發(fā)[15]。本研究對(duì)比了CO2激光不同輻照時(shí)間對(duì)燈盞花種子萌發(fā)的影響，確定30 s為較優(yōu)的條件，為激光技術(shù)在燈盞花育種、種植方面的應(yīng)用提供參考。