基于PI3K/Akt/mTOR 信號通路研究南葶藶子水提液對心力衰竭模型大鼠心室重構(gòu)的影響

楊 明 董竹琴 羅 穎 孫志強 林冬銘 黃抒偉

心力衰竭是各種心臟結(jié)構(gòu)或功能性疾病導(dǎo)致心室充盈及（或）射血能力受損而引起的一組臨床綜合征，常表現(xiàn)為呼吸困難、乏力和體液潴留[1]，屬中醫(yī)“心悸”、“痰飲”、“水腫”等范疇。南葶藶子為十字花科 植 物 播 娘 蒿Descurainia sophia （L.）Webb. ex Prantl.（DSW）的干燥成熟種子，具有強心、利尿、止咳和抑制炎癥滲出等作用[2]。既往研究表明，南葶藶子水提液能改善壓力后負(fù)荷所致的心室重構(gòu)從而改善心功能[3]，但具體機制尚不明確，可能與抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）和交感神經(jīng)激活有關(guān)[4-5]。我們通過大鼠心超等前期實驗也證實，南葶藶子水提液具有抑制心室重構(gòu)、改善心功能的作用[6]。本實驗延續(xù)腹主動脈不完全結(jié)扎制造大鼠慢性心衰模型，基于PI3K/Akt/mTOR 信號通路進(jìn)一步探討南葶藶子水提液改善心衰大鼠心室重構(gòu)的相關(guān)機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級雄性SD 大鼠15 只，體質(zhì)量（220±10）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心提供，動物生產(chǎn)單位為上海西普爾必凱實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2013-0016。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度為18～29℃，日溫差≤3℃，相對濕度達(dá)40%～70%，新鮮空氣換氣次數(shù)10 次/h，氣流速度≤0.18m/s，壓差25Pa，潔凈度一萬級，噪音≤60dB，照度150～300Lux。試驗中所有實驗動物飼養(yǎng)、使用和操作均按3R 原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要藥物和試劑 南葶藶子由浙江中醫(yī)藥大學(xué)提供，取南葶藶子200g，8 倍量70℃水浴提取3 次，每次1h，合并濾液濃縮至100mL 備用，每1mL 相當(dāng)于2g 原生藥。廣譜磷酸酶抑制劑混合物（貨號AR1183）和熒光二抗（貨號BA1020）均購自博士德生物工程有限公司；Cleaved-caspase-3 抗體（貨號9662S）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（貨號5174S）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 蛋白（Bcl-2）抗體（貨號3498S）、Bcl-2 相關(guān)x 蛋白（Bax）抗體（貨號2774S）、蛋白激酶B（Akt）抗體（貨號9272S）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）抗體（貨號4685S）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抗體（貨號2971S）、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）抗體（貨號2972S）均購自Cell Signaling Technology 公司；超敏化學(xué)發(fā)光（Ultra ECL）試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司（批號A8262103V）。

1.3 動物分組和模型建立 15 只SD 大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組和南葶藶子組，每組5只。正常組及模型組大鼠給予5mL·kg-1·d-1生理鹽水灌胃，葶藶子組大鼠給予南葶藶子水提液10g·kg-1·d-1灌胃，SD 大鼠動物模型建立后各灌胃4 周。SD 大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉，劍突下腹正中偏左0.5cm切口，打開腹腔，鈍性游離腹主動脈，將一個去掉針尖的8 號注射針頭緊貼腹主動脈平行放置并用4 號線一起結(jié)扎，輕輕抽出針頭，使腹主動脈截面積縮窄為原來的50%～60%，撒少許青霉素粉后關(guān)腹，分層縫合。

1.4 檢測指標(biāo)及方法

1.4.1 心室肥厚指數(shù) 大鼠處死后，打開胸腔，迅速分離大鼠心臟，剪去心室底部血管及心房組織，用生理鹽水沖洗心腔內(nèi)殘留血液，濾紙吸干水分，電子分析天平秤取心室重量，計算心室肥厚指數(shù)。心室肥厚指數(shù)=心室質(zhì)量（g）/大鼠體質(zhì)量（g）。

1.4.2 病理組織形態(tài)學(xué)檢測 取左心室心肌標(biāo)本，置于4%甲醛中固定24h，經(jīng)取材、脫水、石蠟包埋處理后，沿左心室長軸線取4μm 厚度切片，HE 染色后光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化。

1.4.3 電鏡觀察 取左心室心肌組織，4℃下用2.5%戊二醛固定過夜，然后用磷酸鹽緩沖液洗滌3 次，用1%四氧化鋨固定2h。使用未涂布的銅網(wǎng)格上的超小型標(biāo)準(zhǔn)程序獲得3 個超薄切片，并用0.2%檸檬酸鉛/1%乙酸鈾酰染色。通過透射電子顯微鏡（JOEL-1400EX，日本東京）記錄圖像，放大倍數(shù)20000×觀察。

1.4.4 Western Blot 法檢測 取大鼠左心室心肌組織標(biāo)本液氮研碎，加入裂解液，經(jīng)勻漿離心后，取上清液用BCA 法測定蛋白濃度，變性后-20℃保存。取各組樣本50μg，進(jìn)行12%SDS-PAGE 并濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，用3%BSA 室溫?fù)u床封閉2h，加入3%封閉液稀釋的抗體（1：1000 稀釋），4℃冷庫搖床過夜，用TBST 洗滌15min×3 次。然后，加入二抗（1：2000 稀釋），室溫下?lián)u床孵育2h 后，用TBST 洗滌15min×3次。ECL 發(fā)光液顯色，膠片掃描后用Imgae J 軟件進(jìn)行圖像分析，以GAPDH（1：1000 稀釋）作為內(nèi)參照對比，比值結(jié)果表示其蛋白的相對含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況比較 模型組大鼠造模后出現(xiàn)活動量下降，呼吸稍急促，4 周后體質(zhì)量較正常組明顯下降（P＜0.05），南葶藶子組大鼠體質(zhì)量較模型組有所增加（P＜0.05）。4 周后，模型組大鼠較正常組心室增重，心室肥厚指數(shù)升高，南葶藶子組大鼠心室重量、心室肥厚指數(shù)較模型組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 心室組織病理結(jié)果 正常組大鼠心肌纖維組織排列規(guī)則，心肌纖維無明顯斷裂。模型組大鼠心肌纖維排列不規(guī)則，且出現(xiàn)纖維斷裂、肥厚現(xiàn)象，組織間隙伴有炎性細(xì)胞浸潤。南葶藶子組與模型組比較，上述情況明顯改善。見插頁圖1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、心室質(zhì)量及心室肥厚指數(shù)比較（±s）

表1 各組大鼠體質(zhì)量、心室質(zhì)量及心室肥厚指數(shù)比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；正常組及模型組大鼠給予生理鹽水灌胃，南葶藶子組大鼠給予南葶藶子水提液灌胃

組別正常組模型組南葶藶子組鼠數(shù)555體質(zhì)量（g）313.70±7.57 285.03±5.39*295.13±5.39△心室質(zhì)量（g）0.92±0.28 1.07±0.05*0.96±0.09△心室肥厚指數(shù)0.0029±0.0001 0.0037±0.0001*0.0033±0.0002△

2.3 心室組織電鏡結(jié)果 正常組大鼠心肌纖維排列整齊，z 線清晰均勻，線粒體嵴緊密有序。模型組大鼠心肌纖維排列紊亂，z 線消失，甚至破裂；線粒體數(shù)量增加，但形態(tài)不一，膜結(jié)構(gòu)不清、融合甚至消失；可觀察到線粒體空泡化和腫脹。南葶藶子組與模型組比較，這些病理改變明顯改善。見插頁圖2。

2.4 各組大鼠左心室心肌組織蛋白表達(dá)比較 與正常組比較，模型組大鼠心肌組織Bax 和Caspase-3 蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2 蛋白表達(dá)下調(diào)；與模型組比較，南葶藶子組大鼠心肌組織Bcl-2/Bax 表達(dá)上調(diào)，caspase-3 蛋白表達(dá)下調(diào)（P 均＜0.05）；與模型組比較，南葶藶子組大鼠心肌組織p-Akt/Akt 和p-mTOR/mTOR 蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。見表2、插頁圖3。

3 討 論

研究表明，高血壓的主要靶器官（心、腦、腎）中均存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象[7]，且心肌細(xì)胞凋亡已被證明可發(fā)生在心力衰竭心臟中[8]，許多心衰進(jìn)展的病理生理因素，如兒茶酚胺、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）、炎癥因子和機械壓力等均可促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[9]。南葶藶子含有?；撬岢煞?，具有抗氧化、調(diào)節(jié)兒茶酚胺及AngⅡ的水平[10]，改善心臟能量代謝的作用[11]。南葶藶子亦可通過利尿排泄腎臟毒性物質(zhì)（如硫酸鹽）間接抑制心肌細(xì)胞凋亡和改善心室肥厚[2]。

細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡[12]，Bcl-2 家族和caspase 家族在細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著非常重要的調(diào)節(jié)作用，尤其是在線粒體途徑中。Bcl-2 和Bax 基因家族是線粒體膜通透性改變的重要調(diào)節(jié)基因，其過表達(dá)可以控制上游cyt-c 的釋放和下游caspase-3 蛋白酶的活化并介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。本研究通過電鏡證實南葶藶子組心肌細(xì)胞線粒體損傷減輕。Western blot 結(jié)果顯示，與模型組比較，南葶藶子組大鼠心肌組織Bcl-2/Bax 蛋白表達(dá)上調(diào)，caspase-3蛋白表達(dá)下調(diào)，說明南葶藶子水提液可能是通過Bcl-2/Bax 介導(dǎo)的線粒體凋亡信號傳導(dǎo)途徑抑制心肌凋亡。

表2 各組大鼠心肌組織蛋白灰度值比較（x±s）

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian aarget of rapamycin，mTOR）是一種進(jìn)化上相對保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可通過磷酸化其下游的靶蛋白，參與基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響凋亡等生物活性。而相關(guān)細(xì)胞因子又可通過受體酪氨酸激酶激活PI3K，活化的PI3K 催化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為PIP3，并在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）的協(xié)同下磷酸化Akt 使其激活?；罨腁kt 磷酸化TSC2，而被磷酸化的TSC2 將阻止其對小G 蛋白Rheb 的負(fù)調(diào)控，從而正向調(diào)控mTOR 活性[14]。本研究結(jié)果證實，隨著壓力后負(fù)荷性心衰模型的進(jìn)展，南葶藶子組較模型組p-Akt/Akt 和p-mTOR/mTOR 蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），凋亡蛋白caspases-3表達(dá)下調(diào)，說明南葶藶子提取液抑制心肌細(xì)胞凋亡可能與激活PI3K/Akt/mTOR 信號通路有關(guān)。

綜上所述，本研究證實南葶藶子能有效改善壓力負(fù)荷性心衰大鼠心室重構(gòu)，作用機制可能與激活PI3K/Akt/mTOR 信號通路抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究的局限性在于缺乏原代心肌細(xì)胞實驗，未使用mTOR 抑制劑雷帕霉素反向驗證南葶藶子抑制心肌細(xì)胞凋亡是通過PI3K/Akt/mTOR 信號通路介導(dǎo)。另外，由于本研究樣本量較小，為了驗證本研究結(jié)論的準(zhǔn)確性，可能需要進(jìn)一步擴大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步研究。