基于藥效學(xué)和化學(xué)方法的金蕾復(fù)方醇提工藝優(yōu)選

張旭東 柳娜 蘆彥兆 趙慧巧 寇亮 陳暉 景明

摘要：目的 ?優(yōu)選金蕾復(fù)方醇提工藝條件。方法 ?以金蕾復(fù)方藥液對膽汁淤積小鼠模型的干預(yù)效果為指標(biāo)篩選最佳提取溶媒，以當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷含量及干膏率為綜合考察指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗對料液比、提取時間、提取次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，篩選最佳提取工藝參數(shù)。結(jié)果 ?金蕾復(fù)方醇提最佳工藝條件為：以70%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶8，提取時間為1 h，提取次數(shù)為2次。結(jié)論 ?本試驗優(yōu)選的提取工藝保證了金蕾復(fù)方的藥效，簡單合理、穩(wěn)定可行，可用于該制劑的工業(yè)化生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：金蕾復(fù)方;正交設(shè)計;藥效學(xué);提取工藝

中圖分類號：R283.5 ???文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）05-0073-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.05.016 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： Objective To optimize the conditions for the ethanol extraction of Jinlei Compound. Methods The optimal extraction solvent was selected by the intervention effect of Jinlei Compound liquid on the cholestasis model of mice. With composite score of the contents of swertisin and swertianolin and dry extract yiled as indexes， effects of the amount of water， extraction time and times on extraction process were investigated by L9（34） orthogonal test， then the optimum extraction process parameters were obtained. Results The optimum conditions for the ethanol extraction of Jinlei Compound was as follows： 70% ethanol as the extraction solvent， extracting 2 times with 8 times the amount of water， 1 hour each time. Conclusion The optimized extraction process not only ensures the efficacy of Jinlei Compound， but also is simple， reasonable， stable and feasible， which is suitable for industrial production of the preparation.

Keywords： Jinlei Compound; orthogonal design; pharmacodynamics; extraction process

膽囊炎是發(fā)生于膽囊部位的急慢性炎癥，隨著人們飲食結(jié)構(gòu)和習(xí)慣的改變，其發(fā)病率逐年升高。金蕾復(fù)方是甘肅省名中醫(yī)張銀川主任中醫(yī)師的臨床經(jīng)驗方，由濕生扁蕾和金錢草兩味藥組成。濕生扁蕾為藏藥，性寒味苦，清熱解毒、消炎利膽，藏醫(yī)常用于治療膽囊炎、腸胃炎等消化系統(tǒng)疾病[1];金錢草性寒味甘，清利濕熱、利尿排石，有“石淋要藥”之稱[2]。兩味藥君臣搭配，對膽囊炎具有較好的療效。本研究通過藥效學(xué)方法對金蕾復(fù)方提取溶媒進(jìn)行篩選，并進(jìn)一步采用正交試驗優(yōu)選最佳提取工藝，以期尋求一種既能保證藥效又方便可行的工藝，為該復(fù)方制劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供切實的依據(jù)。

1 ?儀器、試藥與動物

Agilent 1260高相液相色譜儀（DAD檢測器），美國安捷倫公司;XPE105型分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;MH-2000型電熱套，北京科偉永興儀器有限公司;Lab Tech EV型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，美國萊博泰科公司;SB5200D型超聲波清洗儀，寧波新芝生物科技股份有限公司;HGZF-9203型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;DZF-6020型真空干燥箱，上海博遠(yuǎn)實業(yè)有限公司;GFL3033型氣浴恒溫?fù)u床，德國GFL;BX51-32H01系統(tǒng)顯微鏡，日本Olympus;10705型Benchmark Plus連續(xù)波長酶標(biāo)儀，美國BIO-RAD。

濕生扁蕾采自甘肅省渭源縣亂柴溝地域，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)陳垣教授鑒定為龍膽科扁蕾屬植物濕生扁蕾Gentianopsis Paludosa（Munro）Ma.的干燥全草;金錢草購自甘肅省蘭州市黃河中藥材市場，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)陳垣教授鑒定為報春花科珍珠菜屬植物過路黃Lysimachia christinae Hance.的干燥全草。兩味藥材均粉碎，過80目篩，備用。1-萘異硫氰酸酯（ANIT），批號N814658，麥克林生化科技有限公司;花生油，批號XA20170601，山東魯花集團有限公司;總膽紅素（TBil）試劑盒、直接膽紅素（DBil）試劑盒、總膽汁酸（TBA）試劑盒，南京建成生物科技有限公司;當(dāng)藥黃素對照品（批號140525）、當(dāng)藥醇苷對照品（批號140521），HPLC純度均大于98%，成都普菲德生物科技有限公司;甲醇（色譜純）、乙醇（分析純），批號均為20170801，天津市大茂化學(xué)試劑廠;磷酸（分析純），天津歐博凱化工有限公司，批號20100618。

SPF級昆明種小鼠60只，體質(zhì)量18～22 g，鼠齡30 d，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，生產(chǎn)許可證號SCXK（甘）2015-0002，使用許可證號SYXK（甘）2015-0005。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理實驗室，環(huán)境溫度（22±2）℃，相對濕度50%～60%。根據(jù)實驗分組分籠喂養(yǎng)，自由攝食飲水。

2 ?方法與結(jié)果

2.1 ?提取溶媒單因素考察

2.1.1 ?不同溶媒提取物的制備

金蕾復(fù)方提取液由濕生扁蕾和金錢草按一定比例配伍，分別用水及不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液（60%、70%、80%）作溶媒提取。料液比為1∶8，提取時間為2 h，提取次數(shù)為2次，提取結(jié)束后合并2次濾液，沉淀過夜，次日取上清液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上回收乙醇，濃縮藥液。分別制得金蕾復(fù)方水提液（水提液）、金蕾復(fù)方60%乙醇提取液（60%醇提液）、金蕾復(fù)方70%乙醇提取液（70%醇提液）、金蕾復(fù)方80%乙醇提取液（80%醇提液），均相當(dāng)于原藥材1.5 g/mL，備用。

2.1.2 ?造模及給藥

取昆明種小鼠60只，隨機分為正常組、模型組、水提組、60%醇提組、70%醇提組、80%醇提組，每組10只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。金蕾復(fù)方的成人（70 kg）每日用量為原藥材60 g，按比表面積等效劑量換算，小鼠給藥劑量為成人的9.0倍[3]，即每1 kg體質(zhì)量小鼠給予含原藥材7.8 g的藥液灌胃。各給藥組按小鼠體質(zhì)量分別給予相應(yīng)金蕾復(fù)方提取液5.2 mL/kg灌胃，正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)14 d。參照羅琳等[4]的造模方法，除正常組外，其余各組給予10 mL/kg的ANIT溶液（溶劑為花生油，濃度11.21 mg/mL）灌胃造成小鼠膽汁淤積模型，正常組給予相應(yīng)劑量花生油灌胃。造模結(jié)束后禁食不禁水12 h，各組小鼠股動脈取血，離心，取上層血清，ELISA檢測血清TBil、DBil、TBA含量;摘取膽囊，測量膽汁量（完整膽囊質(zhì)量-吸除膽汁后的膽囊質(zhì)量）[5];摘取肝臟，取匯管區(qū)部位，4%甲醛固定，HE染色切片，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理變化。

2.1.3 ?統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料用 ±s表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.1.4 ?提取溶媒單因素考察結(jié)果

生化檢測結(jié)果顯示，模型組小鼠TBil、DBil、TBA含量及膽汁量明顯高于正常組（P<0.05），表明該膽汁淤積模型成功。與模型組比較，各給藥組小鼠TBil、DBil和TBA含量均有降低趨勢，表明金蕾復(fù)方提取物在一定程度上具有緩解膽汁淤積的作用，其中70%醇提組各指標(biāo)降低趨勢更明顯，與水提組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。肝組織HE染色結(jié)果顯示：對照組小鼠肝細(xì)胞排列整齊，幾無變性壞死，無炎性細(xì)胞滲出，無膽管增生;模型組肝細(xì)胞可見大片點、灶狀變性壞死，肝索排列紊亂，部分毛細(xì)膽管內(nèi)膽汁淤積，匯管區(qū)膽管增生，有大量炎性細(xì)胞浸潤;水提組小鼠仍見有肝細(xì)胞壞死，以膽管周圍尤為明顯，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，匯管區(qū)有炎性細(xì)胞浸潤;3個醇提組與模型組比較，肝細(xì)胞損傷有明顯好轉(zhuǎn)，其中70醇提組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)，偶見炎性細(xì)胞滲出，點、灶狀壞死不明顯。見圖1。

2.2 ?正交試驗優(yōu)選醇提工藝

根據(jù)單因素溶媒考察結(jié)果，確定提取溶媒為70%乙醇溶液，設(shè)計如下正交試驗：取處方量的濕生扁蕾和金錢草細(xì)粉共50 g，以料液比、提取時間和提取次數(shù)3個因素作為考察對象，每因素選取3個水平（見表2），以提取物的干膏率（權(quán)重為60%）[6]、當(dāng)藥黃素含量（權(quán)重為20%）和當(dāng)藥醇苷含量（權(quán)重為20%）為指標(biāo)，選用L9（34）正交試驗表進(jìn)行試驗，計算綜合評分，篩選最佳提取工藝。綜合評分=干膏率÷最大干膏率×100×60%+當(dāng)藥黃素含量÷當(dāng)藥黃素最大含量×100×20%+當(dāng)藥醇苷含量÷當(dāng)藥醇苷最大含量×100×20%。

2.2.1 ?干膏率測定

取待測定的已知濃度為C g/mL的提取液V mL，置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中稱定質(zhì)量（M1），水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，移至干燥器，冷卻至室溫，迅速精密稱定質(zhì)量（M2），平行測定3次，計算干膏率。干膏率（%）=（M1-M2）÷（C×V）×100%。

2.2.2 ?當(dāng)藥黃素和當(dāng)藥醇苷含量測定

2.2.2.1 ?色譜條件及方法學(xué)考察

采用Agilent SB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 ?m）;流動相為0.10%磷酸水溶液（A）和甲醇（B），0～10 min為A∶B=70∶30～60∶40線性梯度洗脫，10～17 min為A∶B=60∶40～50∶50線性梯度洗脫，17～40 min為A∶B=50∶50～30∶70線性梯度洗脫，40～50 min為A∶B=30∶70等度洗脫;流速1.0 mL/min;檢測波長270 nm;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量5 ?L。

該色譜條件下，當(dāng)藥黃素在11.3 min處出峰，當(dāng)藥醇苷在16.3 min處出峰。當(dāng)藥黃素回歸方程為Y=3.283 9X-0.605 5，r2=0.999 9，當(dāng)藥黃素在48.6～340.5 ?g/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，精密度RSD=0.17%（n=5）;當(dāng)藥醇苷回歸方程為Y=4.190 6X+5.778 4，r2=0.999 9，當(dāng)藥醇苷在48.4～338.2 ?g/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，精密度RSD=0.21%（n=5）。在該色譜條件下，當(dāng)藥黃素和當(dāng)藥醇苷均具有良好的分離度，見圖2。

2.2.2.2 ?對照品溶液的制備

稱取當(dāng)藥黃素和當(dāng)藥醇苷對照品各15 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得當(dāng)藥黃素和當(dāng)藥醇苷的混合對照品溶液，其中當(dāng)藥黃素濃度為0.608 mg/mL，當(dāng)藥醇苷濃度為0.604 mg/mL。精密吸取混合對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，置2.5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配成當(dāng)藥黃素和當(dāng)藥醇苷的系列混合對照品溶液。

2.2.2.3 ?供試品溶液的制備

按含原藥材5 g的比例，稱取9次正交試驗所得干膏粉，并精密稱定，分別置于25 mL容量瓶中，加甲醇，超聲（功率250 W，頻率50 kHz）10 min溶解，并定容至刻度。

2.2.2.4 ?樣品含量測定

取“2.2.2.3”項下供試品溶液，進(jìn)樣量為5 ?L，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算當(dāng)藥黃素和當(dāng)藥醇苷的含量，并計算每克干膏粉中當(dāng)藥黃素和當(dāng)藥醇苷的量。

2.2.3 ?正交試驗結(jié)果與分析

正交試驗結(jié)果見表3，方差分析見表4。通過直觀分析可以看出，各因素對金蕾復(fù)方醇提工藝的影響為C>A>B，根據(jù)方差分析可知，C因素（提取次數(shù)）和A因素（料液比）對綜合評分有顯著影響，根據(jù)LSD兩兩比較方差分析并結(jié)合生產(chǎn)實際需要，確定最優(yōu)水平組合為A1B1C2，即料液比為1∶8，提取時間為1 h，提取次數(shù)為2次。

2.2.4 ?驗證試驗

稱取處方量濕生扁蕾和金錢草細(xì)粉50 g，按優(yōu)選出的提取工藝進(jìn)行3批驗證試驗。結(jié)果表明，該工藝穩(wěn)定可行，符合大生產(chǎn)要求，見表5。

3 ?討論

中醫(yī)自古就有方與法之說，方為藥方，法為藥方的炮制、煎煮、調(diào)配、服用等方法[7]。徐靈胎有言：“煎藥之法，最宜深講，藥之效與不效，全在乎此?！惫欧接涊d青蒿搗碎取汁液可治療瘧疾，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，青蒿（實為黃花蒿）只有用乙醚低溫提取才能得到具有較強抗瘧活性的青蒿素[8]?？梢?，提取方法不同，中藥的療效亦有差別，提取是確保中藥制劑質(zhì)量的關(guān)鍵性因素。目前，大生產(chǎn)中仍采用傳統(tǒng)提取方法，其原理為相似相溶性原理，故而提取所用溶媒在提取有效成分過程中具有很重要的作用。本研究先通過藥效學(xué)手段篩選出最佳提取溶媒，以確保后續(xù)提取工藝所得為具有藥理學(xué)活性的提取物。

藥理研究表明，金錢草和濕生扁蕾均具有鎮(zhèn)痛、抗炎、利膽等功效，且兩味藥都含有黃酮類、多糖類及苷類成分[9-11]。在不確定其主要藥效成分的前提下，為確保該處方療效，應(yīng)盡可能多提取其中的不同種類成分。本研究選擇采用不同濃度乙醇作為提取溶媒，原因有二：一是乙醇作溶媒無毒害，且醇提有助于藥物成分入血[7];二是黃酮類成分和多糖類成分都可以通過乙醇溶液提取出來。因此，本試驗篩選出70%乙醇提取物藥效結(jié)果最佳具有一定的科學(xué)依據(jù)。此外，在制劑的大生產(chǎn)中，提取物的出膏率是一個很重要的考察指標(biāo)。出膏率的多少影響制型的成形、輔料種類和用量的選擇，以及服用劑量等，因此將出膏率納入考察指標(biāo)具有一定的實際意義[12]。由于金蕾復(fù)方中當(dāng)藥黃素和當(dāng)藥醇苷是否為主要藥效成分尚不確定，不能通過有效成分含量來控制制劑的質(zhì)量，故采用傳統(tǒng)的以干膏率為主的質(zhì)量控制方法。此外，考慮到大生產(chǎn)的成本問題，出膏率高時，單位成本降低。因此，綜合評分選擇以出膏率權(quán)重占60%作為考察指標(biāo)符合生產(chǎn)及質(zhì)量要求[6]。

綜上，本研究通過藥效學(xué)結(jié)合化學(xué)方法有針對性地篩選出能夠確保藥效的提取工藝，具有一定的創(chuàng)新性和實用性。但仍然存在一些不足，如未考慮其他提取溶媒;正交試驗無法對未考察的參數(shù)進(jìn)行預(yù)測，篩選出的工藝參數(shù)不一定是極值;HPLC含量檢測為君藥中的成分，考察指標(biāo)可能不夠全面等。提示本研究還需進(jìn)行更全面、細(xì)化的工藝篩選，以取得最佳提取工藝，應(yīng)用于生產(chǎn)中。

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（收稿日期：2018-07-10）

（修回日期：2018-08-03;編輯：陳靜）