青蛤多肽的酶法制備及對(duì)前列腺癌DU-145細(xì)胞的抑制活性

張亞茹，閆海強(qiáng)，楊最素，余方苗，丁國芳,3，龔戩芳,*

（1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術(shù)研究中心，浙江 舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué)東海科學(xué)技術(shù)學(xué)院，浙江 舟山 316004；3.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316022）

前列腺癌發(fā)病率在男性惡性腫瘤發(fā)病率中位居首位，易發(fā)于老年男性。在世界范圍內(nèi)，前列腺癌的發(fā)病率因環(huán)境、基因、飲食等因素不同而有很大差異[1-3]。在我國，前列腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢，居泌尿系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率的首位，嚴(yán)重威脅老年男性的健康[4-5]。傳統(tǒng)治療方法如手術(shù)、放療和冷凍治療等效果并不理想，復(fù)發(fā)率較高，并且當(dāng)復(fù)發(fā)的前列腺癌轉(zhuǎn)化為非雄激素依賴性時(shí)將更難治療；而化療藥物產(chǎn)生耐藥性后療效更差且毒副作用明顯。因此，尋找抗前列腺癌藥物成為學(xué)者們研究的熱點(diǎn)。海洋是發(fā)現(xiàn)新型抗癌藥物的豐富的資源寶庫，其中，海洋多肽類物質(zhì)因其分子質(zhì)量小、活性高、毒性低等優(yōu)點(diǎn)日益成為國內(nèi)外學(xué)者研究的焦點(diǎn)。從雙殼貝類中提取的文蛤多肽Mere15、菲律賓蛤仔寡肽對(duì)人慢性骨髓性白血病K562細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞具有增殖抑制作用，并能夠濃度依賴性地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6-7]。

青蛤（Cyclina sinensis）屬于軟體動(dòng)物門鰓瓣綱異齒亞綱簾蛤目簾蛤科，含有高含量的蛋白和不飽和脂肪酸，味道鮮美，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值[8-10]。青蛤在民間具有悠久的入藥歷史，是一種重要的海洋藥物，具有軟堅(jiān)散結(jié)、清熱燥濕及鎮(zhèn)咳的作用[11-13]。目前，已證實(shí)青蛤中富含的蛋白質(zhì)、多糖和脂類具有良好的生物學(xué)活性，如抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗炎等[14-18]。Jiang Changxing等[19-21]從青蛤中提取出的多糖具有抗氧化和保肝活性，對(duì)人胃癌BGC-823細(xì)胞的生長具有強(qiáng)烈的抑制作用。趙莎莎等[22]利用堿性蛋白酶酶解青蛤內(nèi)臟獲得的水解物具有較好的體外抗氧化能力。葉盛旺等[23]發(fā)現(xiàn)青蛤肉經(jīng)酶解法制備的青蛤多肽對(duì)RAW 264.7巨噬細(xì)胞有較好的免疫調(diào)節(jié)作用，認(rèn)為其具有激活巨噬細(xì)胞、增強(qiáng)機(jī)體免疫力的潛在作用。酶法提取生物活性肽具有特異性強(qiáng)、效果好、副反應(yīng)少、能耗低、易于被人體吸收等優(yōu)點(diǎn)，并且酶法水解蛋白還因具有安全性高、價(jià)廉、易于推廣等特性而成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。然而，目前關(guān)于提取青蛤抗腫瘤活性多肽的報(bào)道并不多，本研究采用蛋白酶酶解青蛤內(nèi)臟，采用正交試驗(yàn)方法獲得最佳酶解條件，經(jīng)分離純化篩選出活性多肽，探討其體外抗人前列腺癌DU-145細(xì)胞的活性，以期為青蛤活性多肽的制備及其抗癌作用研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青蛤購于舟山市菜市場，經(jīng)浙江海洋大學(xué)趙盛龍教授鑒定為青蛤。人前列腺癌DU-145細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院生化細(xì)胞所，由浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術(shù)研究中心傳代保存。

堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶 北京亞太恒信生物科技有限公司；F12培養(yǎng)基 美國Gibco公司；胎牛血清 杭州四季青生物工程公司；噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、胰蛋白酶美國Sigma公司；吖啶橙/溴化乙錠（acridine orange/ethidium bromide，AO/EB） 杭州昊天生物技術(shù)有限公司；JC-1細(xì)胞線粒體膜電位試劑盒 上海貝博生物公司；非轉(zhuǎn)移性克隆23型（nm23H1）單克隆抗體（工作濃度按體積比1:100稀釋） 美國Santa Cruz Biotechnology公司；免疫組織化學(xué)試劑盒 丹麥DAKO有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CF16RXⅡ型高速低溫離心機(jī)、H-7650透射電子顯微鏡 日本日立公司；Forma3111 CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo Scientific公司；Cogent u Scale超濾系統(tǒng) 德國默克密理博公司；Apurifier UPC 100快速蛋白液相色譜系統(tǒng) GE醫(yī)療生命科學(xué)有限公司；1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀美國安捷倫公司；超凈工作臺(tái) 上海智城分析儀器制造有限公司；CKX4倒置顯微鏡、BX2-FLB3熒光顯微鏡、CCD-NC6051顯微攝像儀 日本Olympus公司；酶標(biāo)儀美國Bio-Rad公司；easy Cyte6 HT-2L流式細(xì)胞儀 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將DU-145細(xì)胞培養(yǎng)在含雙抗（100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素）和質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的F12培養(yǎng)液中，放置在37 ℃、含有體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%以上時(shí)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 青蛤內(nèi)臟酶解液的制備

1.3.2.1 最佳酶種類的選擇

分別取10.0 g勻漿青蛤內(nèi)臟，以堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶這5 種酶為供試酶，在各自最適酶解溫度及pH值條件（表1）下，加1 200 U/g、保溫6 h進(jìn)行酶解。隨后滅活15 min，于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取其上清液，采用甲醛電位滴定法測定氨基氮（amino nitrogen，ANN）含量。

表1 5 種蛋白酶的最適酶解溫度和pH值Table 1 Optimum temperature and pH of proteases

1.3.2.2 酶解條件的優(yōu)化

在初步確定酶種類的基礎(chǔ)上，以對(duì)DU-145細(xì)胞的增殖抑制率（IR）為指標(biāo)，以料液比、pH值、加酶量、溫度、時(shí)間5 個(gè)因素進(jìn)行L16（45）正交試驗(yàn)（表2），確定最優(yōu)酶解條件。

表2 木瓜蛋白酶酶解青蛤內(nèi)臟正交試驗(yàn)因素水平Table 2 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for orthogonal array design

1.3.3 酶解多肽的分離純化

1.3.3.1 超濾

取最佳酶及最優(yōu)酶解條件下的上清液，用截留分子質(zhì)量為8 kDa的超濾膜在Cogent u Scale超濾系統(tǒng)上進(jìn)行超濾，得到小于8 kDa和大于8 kDa的兩種超濾液。再用截留分子質(zhì)量為5 kDa的超濾膜對(duì)小于8 kDa的部分超濾，截留獲得大于5 kDa且小于8 kDa和小于5 kDa的兩種超濾液。換用截留分子質(zhì)量為3 kDa的超濾膜對(duì)小于5 kDa的部分超濾，截留獲得大于3 kDa且小于5 kDa和小于3 kDa的兩種超濾液。分別取不同分子段酶解液冷凍干燥樣品配制成質(zhì)量濃度15 mg/mL進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，篩選出對(duì)DU-145細(xì)胞抑制率最高的超濾組分備用。

1.3.3.2 瓊脂糖凝膠層析

取1.3.3.1節(jié)的超濾組分進(jìn)行瓊脂糖凝膠層析分離，酶解液質(zhì)量濃度為0.05 g/mL，離心后取上清液過0.22 μm濾膜，在Apurifier UPC 100快速蛋白色譜系統(tǒng)上進(jìn)行洗脫。色譜柱規(guī)格：300 mm×10 mm；色譜柱填料：瓊脂糖凝膠；色譜柱料顆粒尺寸：（10±2）μm；上樣量：500 μL；流動(dòng)相：超純水；洗脫液流速：0.5 mL/min；檢測波長：280 nm；自動(dòng)收集體積：3.2 mL/管。收集各峰溶液進(jìn)行冷凍干燥，采用MTT法檢測抑制率最高的峰組分。

1.3.3.3 HPLC法分離制備及純度檢測

取1.3.3.2節(jié)抑制率最高的峰組分通過HPLC進(jìn)一步分離，其質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL。色譜柱：ZORBAX SB-C18分析型色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長：214、280 nm；流速：0.8 mL/min；流動(dòng)相A為乙腈（含0.05%三氟乙酸），流動(dòng)相B為超純水（含0.06%三氟乙酸），采用梯度洗脫方式：0%（體積分?jǐn)?shù)，下同）流動(dòng)相B，4 min；0%～100%流動(dòng)相B，25 min；100%流動(dòng)相B，6 min，柱溫：25 ℃；自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量：100 μL。收集MTT法檢測抑制率最高的峰組分，冷凍干燥，即得到青蛤多肽（Cyclina sinensis peptides，CSP）。

1.3.4 DU-145細(xì)胞抑制活性檢測

1.3.4.1 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)

將DU-145單細(xì)胞懸液以1×104個(gè)/mL的密度每孔200 μL接種至96 孔板。24 h后棄去培養(yǎng)液，設(shè)置空白對(duì)照組（正常培養(yǎng)基培養(yǎng)）及加藥組（CSP質(zhì)量濃度分別為2、4、8、12、15 mg/mL），每組設(shè)5 個(gè)平行孔。培養(yǎng)24 h后去培養(yǎng)液，每孔加含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% MTT的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）200 μL，繼續(xù)孵育4 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后棄去孔中液體，每孔加二甲基亞砜150 μL，充分振蕩10 min。采用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定各孔的OD值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。按下式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率并計(jì)算其半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.3.4.2 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

將經(jīng)泡酸、消毒處理后的蓋玻片置于6 孔板內(nèi)，接種密度為1×105個(gè)/mL的DU-145細(xì)胞懸液，常規(guī)孵育24 h，棄去孔中液體，設(shè)空白對(duì)照組（正常培養(yǎng)基培養(yǎng)）和加藥組（CSP質(zhì)量濃度分別為2、8、12 mg/mL），培養(yǎng)24 h，于倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。

1.3.4.3 Hoechst 33258熒光染色觀察

細(xì)胞接種密度、實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理同1.3.4.2節(jié)方法。24 h后終止培養(yǎng)，棄去各孔中液體并用體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛固定20 min，pH 7.2 PBS洗2 次，0.5 μg/mL Hoechst 33258熒光染液室溫染色15 min，然后用PBS洗2 次，于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3.4.4 ROS檢測

活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測中細(xì)胞接種密度、實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理同1.3.4.2節(jié)方法。培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞用胰酶消化并進(jìn)行離心收集（1 000 r/min、6 min），按照體積比1:1 000用無血清的F12營養(yǎng)液和2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）均勻懸浮細(xì)胞，濃度約為2×106個(gè)/mL。于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，為了使探針和細(xì)胞更充分地接觸，每隔3～5 min將離心管上下顛倒混勻。孵育結(jié)束后用不含有血清的F12營養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次，用來充分除去沒有進(jìn)入細(xì)胞中的DCFH-DA。于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4.5 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞微觀形態(tài)

DU-145細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，設(shè)空白對(duì)照組（正常培養(yǎng)基培養(yǎng)）和加藥組（CSP質(zhì)量濃度分別為2、8 mg/mL）。培養(yǎng)24 h，取消化后的細(xì)胞懸液以體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛及鋨酸雙重固定，丙酮梯度脫水，中性618樹脂包埋。超薄切片機(jī)切片，于透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞線粒體膜電位變化

細(xì)胞接種密度、實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理同1.3.4.2節(jié)方法。取消化的細(xì)胞懸液，于2 000 r/min離心5 min，PBS洗2 次。按試劑盒說明書操作，取1 μL JC-1試劑加入500 μL 1×Incubation Buffer混勻，10 000 r/min離心1 min，上清液即JC-1工作液；取500 μL JC-1工作液懸浮細(xì)胞并孵育20 min，室溫下2 000 r/min離心5 min，并用1×Incubation Buffer洗細(xì)胞，重復(fù)2 次?；靹驊腋〖?xì)胞并過200 目篩，于流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.3.4.7 免疫組織化學(xué)法檢測DU-145細(xì)胞nm23H1蛋白的表達(dá)

細(xì)胞接種密度、實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理同1.3.4.2節(jié)方法。取出蓋玻片，用丙酮固定20 min。加入體積比1:100的單克隆抗體4 ℃過夜；滴加EnVision液室溫孵育30 min；使用二氨基聯(lián)苯胺進(jìn)行顯色，光學(xué)顯微鏡下觀察控制顯色時(shí)間，自來水沖洗；蘇木精復(fù)染5 min后用乙醇梯度脫水、二甲苯透明，并用中性樹膠封片。于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以 ±s表示，數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分，P＜0.05表示差異有顯著性。采用Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解條件的優(yōu)化

2.1.1 5 種蛋白酶的酶解結(jié)果

表3 5 種蛋白酶酶解青蛤內(nèi)臟的ANN含量Table 3 Comparison of amino nitrogen contents of Cyclina sinensis hydrolysates produced using five proteases

每種酶在其最適的酶解溫度、pH值條件下可以得到最好的酶解效果，即以最少的投料使酶解產(chǎn)物含量最大化，使水解徹底。ANN含量與水解度成正相關(guān)，在各自最適酶解條件下，如表3所示，木瓜蛋白酶酶解物的ANN含量最高，達(dá)到了（7.00±0.35）mg/g，堿性蛋白酶次之。說明木瓜蛋白酶對(duì)青蛤內(nèi)臟的水解效果最好，故選定木瓜蛋白酶為本實(shí)驗(yàn)最佳酶。

2.1.2 木瓜蛋白酶酶解青蛤內(nèi)臟的正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 木瓜蛋白酶酶解青蛤內(nèi)臟正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal array design with experimental results

如表4所示，從抑制率大小可知，5 個(gè)因素對(duì)酶解效果皆有影響，由極差（R）大小得D（溫度）＞B（pH值）＞E（時(shí)間）＞A（料液比）＞C（加酶量），且A4B4C4D1E2組合效果最好，即料液比1:4、pH 7.0、加酶量1 500 U/g、溫度45.0 ℃、酶解時(shí)間4 h。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，所得結(jié)果均為此組合效果最佳，即正交試驗(yàn)結(jié)果具有可靠性。

2.2 酶解液的分離純化結(jié)果

2.2.1 超濾截留結(jié)果

圖1 酶解液的超濾截留組分對(duì)DU-145細(xì)胞的增殖抑制作用Fig. 1 Inhibitory effect of hydrolysate fractions obtained by ultrafiltration on DU-145 cells

如圖1所示，小于3 kDa的酶解液對(duì)DU-145細(xì)胞的抑制率最高，達(dá)到（89.46±4.47）%。故選定小于3 kDa酶解液進(jìn)行下步分離純化。

2.2.2 Superose 12 10/300 GL層析分離純化結(jié)果

取小于3 kDa冷凍干燥樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠層析，于280 nm波長處出現(xiàn)3 個(gè)峰，即峰1、峰2和峰3，如圖2所示。MTT法顯示峰1對(duì)DU-145細(xì)胞的抑制活性最高。

圖2 瓊脂糖凝膠柱洗脫峰Fig. 2 Elution peaks on agarose gel column

2.2.3 HPLC法分離制備及純度檢測結(jié)果

圖3 峰1組分及保留時(shí)間12 min時(shí)峰組分的高效液相色譜圖Fig. 3 High performance liquid chromatography of peak 1 and the peak of retention time 12 min

選取圖3a中保留時(shí)間約為12 min的峰組分（峰面積16.32，峰高1 999.79）進(jìn)行收集，經(jīng)N端測序得出該肽的氨基酸序列為：Ile-Leu-Tyr-Met-Pro，分子質(zhì)量635.82 Da，命名為CSP。收集12 min時(shí)峰純品再次采用HPLC法檢測純度，在280 nm波長處約7 min時(shí)出現(xiàn)主要單一峰，如圖3b所示。

2.3 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 CSP對(duì)DU-145細(xì)胞的增殖抑制作用Fig. 4 Antiproliferative effect of CSP on DU-145 cells

如圖4所示，隨CSP質(zhì)量濃度的增加和作用時(shí)間的延長對(duì)DU-145細(xì)胞的增殖抑制率明顯上升。當(dāng)CSP質(zhì)量濃度為2 mg/mL、作用時(shí)間為24 h時(shí)抑制率為（9.89±0.49）%；而當(dāng)CSP質(zhì)量濃度為15 mg/mL、作用時(shí)間72 h時(shí)抑制率達(dá)到（84.17±4.21）%，IC50為（5.36±0.27）mg/mL，與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）。

2.4 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)果

圖5 倒置顯微鏡下DU-145細(xì)胞的形態(tài)變化（×200）Fig. 5 Morphologic changes of DU-145 cells under inverted microscope (× 200)

如圖5所示，對(duì)照組DU-145細(xì)胞形態(tài)飽滿、生長良好，視野下細(xì)胞數(shù)目較多（圖5A）；2 mg/mL組細(xì)胞間隙增大、輪廓模糊（圖5B）；而高質(zhì)量濃度（12 mg/mL）組細(xì)胞變圓、變亮，形態(tài)更加不規(guī)則，細(xì)胞數(shù)目明顯少于對(duì)照組，同時(shí)可見較多懸浮在培養(yǎng)液中的死細(xì)胞（圖5D）。

2.5 Hoechst 33258熒光染色結(jié)果

圖6 Hoechst 33258染色觀察DU-145細(xì)胞形態(tài)變化（×400）Fig. 6 Morphologic changes of DU-145 cells observed by Hoechst 33258 staining (× 400)

如圖6所示，對(duì)照組細(xì)胞核呈現(xiàn)出淡藍(lán)色熒光，且細(xì)胞形態(tài)規(guī)則；而CSP作用后可見個(gè)別細(xì)胞核皺縮呈亮藍(lán)色；隨著質(zhì)量濃度的增加，視野中細(xì)胞數(shù)減少，部分核呈碎片狀或點(diǎn)狀且形態(tài)不規(guī)則，藍(lán)色熒光增加，同時(shí)出現(xiàn)了凋亡小體。

2.6 ROS檢測結(jié)果

圖7 CSP誘導(dǎo)DU-145細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生Fig. 7 CSP induces ROS generation in DU-145 cells

如圖7所示，對(duì)照組出現(xiàn)極少量的綠色熒光；與對(duì)照組比較，經(jīng)CSP作用后熒光強(qiáng)度明顯增加，且隨著質(zhì)量濃度的增加熒光強(qiáng)度依次增強(qiáng)。這表明DU-145細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生量隨著CSP質(zhì)量濃度的增加呈明顯增加趨勢。

2.7 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞微觀形態(tài)結(jié)果

如圖8所示，對(duì)照組DU-145細(xì)胞培養(yǎng)24 h后可見細(xì)胞表面有微絨毛，胞核形態(tài)規(guī)則，具有完整的核膜，染色質(zhì)均勻分布，含有一個(gè)核仁。CSP處理后細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，染色質(zhì)電子密度增高并濃縮聚集至核膜邊緣，部分細(xì)胞膜有“出芽”現(xiàn)象，出現(xiàn)凋亡小體；隨著CSP質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞的微絨毛消失，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見大量空泡形成，并出現(xiàn)了大小不一的自噬體，細(xì)胞核固縮明顯，表現(xiàn)出凋亡細(xì)胞的特點(diǎn)。

圖8 CSP作用24 h后DU-145細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)（× 3 700）Fig. 8 Ultrastructural changes of DU-145 cells incubated with CSP for 24 h (× 3 700)

2.8 細(xì)胞線粒體膜電位變化結(jié)果

圖9 CSP對(duì)DU-145細(xì)胞線粒體膜電位的影響Fig. 9 Changes in mitochondrial membrane potential of DU-145 cells treated with CSP

從圖9可以看出，右上象限表示正常的膜電位比例，右下象限表示下降的膜電位比例。與對(duì)照組相比，2、8 mg/mL和12 mg/mL組膜電位下降率分別為12.12%、20.71%和25.07%。隨CSP質(zhì)量濃度的增大，線粒體膜電位下降率隨之增大，即發(fā)生細(xì)胞凋亡的細(xì)胞數(shù)呈顯著性增加趨勢。

2.9 免疫組織化學(xué)法檢測CSP對(duì)DU-145細(xì)胞nm23H1蛋白的陽性表達(dá)結(jié)果

圖10 CSP對(duì)DU-145細(xì)胞nm23H1蛋白表達(dá)的影響（×400）Fig. 10 Changes in expression of nm23H1 in DU-145 cells treated with CSP (× 400)

如圖10所示，nm23H1蛋白陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色結(jié)構(gòu)對(duì)照組大部分細(xì)胞胞漿內(nèi)呈淺棕色，個(gè)別細(xì)胞呈現(xiàn)陰性（圖10A）。隨著CSP質(zhì)量濃度的增加，視野下的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的陽性部位顏色逐漸加深，出現(xiàn)了巨核細(xì)胞，部分細(xì)胞核呈固縮狀態(tài)。

3 討 論

近年來研究發(fā)現(xiàn)海洋生物活性肽具有較好的抗腫瘤作用[24-26]，其體外抗腫瘤細(xì)胞活性常用MTT法進(jìn)行篩選[27]。本研究采用酶解法提取CSP，經(jīng)MTT法檢測，結(jié)果顯示，隨著CSP質(zhì)量濃度的增加和作用時(shí)間的延長，其對(duì)DU-145細(xì)胞的增殖抑制率明顯上升，且具有明顯的時(shí)間及劑量依賴性。當(dāng)CSP質(zhì)量濃度為15 mg/mL、作用72 h后，抑制率高達(dá)84.17%，IC50為5.36 mg/mL。同時(shí)DU-145細(xì)胞的形態(tài)也發(fā)生變化，表現(xiàn)為細(xì)胞間隙變大、形態(tài)不規(guī)則、核固縮、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡和形成凋亡小體，其中凋亡小體的形成表明CSP抑制DU-145細(xì)胞的增殖與細(xì)胞凋亡相關(guān)。

ROS是誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的一種重要因素，因其通過與細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體組織脂質(zhì)過氧化、DNA氧化損傷和細(xì)胞內(nèi)蛋白變性，對(duì)細(xì)胞造成損傷；ROS還可作為細(xì)胞內(nèi)信使，活化許多信號(hào)傳導(dǎo)通路如細(xì)胞凋亡通路，間接導(dǎo)致細(xì)胞損傷[28]，從而使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生更多ROS。在ROS積聚的情況下，除了主動(dòng)的細(xì)胞凋亡外，其能通過激活一系列信號(hào)通路來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡失調(diào)而使得細(xì)胞過度凋亡，引發(fā)自身免疫疾病和炎癥。本研究結(jié)果表明，CSP作用后DU-145細(xì)胞ROS的產(chǎn)生量明顯增加，且呈劑量依賴性。研究發(fā)現(xiàn)藥物抗腫瘤作用的機(jī)制與其作用于線粒體導(dǎo)致功能紊亂、抑制腫瘤細(xì)胞血管生成能力等相關(guān)[29]，而線粒體膜電位（線粒體膜通透性）的降低是細(xì)胞凋亡早期的不可逆事件。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，與對(duì)照組細(xì)胞相比，CSP作用后DU-145細(xì)胞的線粒體膜電位呈顯著性下降趨勢，隨著CSP質(zhì)量濃度增加，其膜電位下降率明顯增加，從4.22%增加到25.07%。因此推測CSP可能通過刺激DU-145細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS引起線粒體膜通透性改變，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。由此可見線粒體凋亡的信號(hào)通路在CSP所誘導(dǎo)的DU-145細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。

據(jù)報(bào)道，90%腫瘤病人最終的死亡原因都是腫瘤的復(fù)發(fā)、侵襲和轉(zhuǎn)移，因此防止腫瘤轉(zhuǎn)移的方法或藥物越來越受腫瘤臨床醫(yī)生及患者的重視，一些與腫瘤細(xì)胞發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)的分子靶點(diǎn)不斷被發(fā)現(xiàn)，靶向藥物的篩選成為當(dāng)前抗腫瘤藥物研究最為活躍的領(lǐng)域之一。nm23H1是目前研究較多的轉(zhuǎn)移抑制基因，其表達(dá)程度可作為判斷腫瘤有無轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)。前期的研究結(jié)果顯示，nm23H1蛋白的表達(dá)與前列腺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和生存率密切相關(guān)，且與前列腺癌患者的存活率呈正相關(guān)[30]。免疫組織化學(xué)法結(jié)果表明，對(duì)照組DU-145細(xì)胞中nm23H1蛋白的表達(dá)程度較低，CSP作用后表達(dá)量隨著CSP質(zhì)量濃度的增加逐漸增高。說明CSP能夠促進(jìn)nm23H1蛋白在DU-145細(xì)胞中表達(dá)，對(duì)于抑制其轉(zhuǎn)移具有重要的作用，nm23H1蛋白表達(dá)量可以成為篩選CSP活性的指標(biāo)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用木瓜蛋白酶，在料液比1:4、pH 7.0、加酶量1 500 U/g、溫度45.0 ℃、酶解時(shí)間4 h條件下對(duì)青蛤內(nèi)臟勻漿液進(jìn)行酶解，經(jīng)超濾截留、瓊脂糖凝膠層析、HPLC分離純化最終獲得CSP，經(jīng)氨基酸測序得到其氨基酸序列為Ile-Leu-Tyr-Met-Pro。研究結(jié)果表明，CSP能抑制DU-145細(xì)胞的增殖，且呈現(xiàn)時(shí)間與劑量依賴，并使細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)特征，其作用機(jī)制與DU-145細(xì)胞ROS、nm23H1蛋白表達(dá)量的增加以及線粒體膜電位的降低相關(guān)。至于其通過何種信號(hào)傳導(dǎo)通路引起凋亡的機(jī)制有待于后續(xù)研究證實(shí)。