4種檢測(cè)方法在隱球菌性腦膜炎中的診斷價(jià)值

張江峰，張亞麗，王山梅，馬 冰，李 軼△

(1.河南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,鄭州 450003；2.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化疾病研究所，鄭州 450014)

新型隱球菌感染引起的隱球菌性腦膜炎是一種嚴(yán)重的真菌性腦膜炎，具有高患病率和高病死率。人類免疫缺陷病毒(HIV)感染和免疫功能受損是其主要風(fēng)險(xiǎn)因素。全球每年約有100萬(wàn)HIV感染患者罹患隱球菌性腦膜炎，其中死亡患者至少有10萬(wàn)人[1-2]。另外，隱球菌性腦膜炎也可發(fā)生于HIV陰性的免疫功能低下患者甚至免疫功能正常的患者。美國(guó)一項(xiàng)研究[2]顯示，約50%HIV陰性的隱球菌感染患者有中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累。我國(guó)有研究[3]顯示，HIV陰性的隱球菌性腦膜炎患者病死率高達(dá)28.7%。隱球菌性腦膜炎早期缺少特異性的臨床表現(xiàn)，誤診率較高。因此，隱球菌性腦膜炎的快速檢測(cè)及早期診斷是控制感染和預(yù)防并發(fā)癥的關(guān)鍵。本研究應(yīng)用臨床實(shí)驗(yàn)室常用的4種隱球菌性腦膜炎的檢測(cè)方法(墨汁染色法、培養(yǎng)法、膠體金法和乳膠凝集法)進(jìn)行樣本檢測(cè)，旨在探討4種方法在隱球菌性腦膜炎中的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 病例組為31例經(jīng)病原學(xué)檢查(墨汁染色、培養(yǎng)陽(yáng)性)確診為隱球菌性腦膜炎病例，均為2014年1月至2018年5月河南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科和感染科的住院患者，其中男19例，女12例，年齡22～67歲。對(duì)照組為同期40例非隱球菌性腦膜炎中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者，確診為結(jié)核性腦膜炎、細(xì)菌性腦膜炎或病毒性腦膜炎。對(duì)照組男23例，女17例，年齡12～71歲。所有的腦脊液標(biāo)本均為抗真菌藥物使用前采集。

1.2儀器與試劑 Bactec FX全自動(dòng)血培養(yǎng)儀器(美國(guó)BD公司)，印度墨汁(北京華越洋DM0103)，CX22顯微鏡(奧林巴斯)，沙氏培養(yǎng)基(鄭州安圖公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(日本松下)，隱球菌抗原檢測(cè)試劑盒(膠體金免疫層析法，美國(guó)Immy公司)，隱球菌抗原測(cè)定試劑盒(乳膠凝集法，美國(guó)Immy公司)，質(zhì)譜儀[布魯克(北京)科技有限公司]。

1.3方法

1.3.1直接鏡檢 墨汁染色選用印度墨汁，將1 mL以上的腦脊液標(biāo)本3 000 r/min離心10 min，棄去上清液，取沉渣與墨汁混勻后，加蓋蓋玻片直接鏡檢。在黑色背景下，新型隱球菌可見(jiàn)寬厚透亮的莢膜，細(xì)胞壁明顯，有時(shí)有出芽現(xiàn)象。

1.3.2培養(yǎng)及鑒定 將腦脊液接種于BD真菌血培養(yǎng)瓶，置于Bactec FX全自動(dòng)血培養(yǎng)儀進(jìn)行培養(yǎng)，陽(yáng)性培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)種沙氏培養(yǎng)基(SDA)37 ℃培養(yǎng)，采用質(zhì)譜儀進(jìn)行種的鑒定。

1.3.3乳膠凝集試驗(yàn) 取100 μL的腦脊液樣本于100 ℃溫箱中孵育5 min，取25 μL的隱球菌抗原陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和預(yù)處理的腦脊液標(biāo)本加在環(huán)狀玻片的分離環(huán)中，并各加入25 μL的隱球菌乳膠進(jìn)行混合，于室溫下手動(dòng)輕搖5 min后立即觀察結(jié)果。

1.3.4膠體金法 將腦脊液標(biāo)本3 000 r/min離心10 min，在反應(yīng)試管中滴加1滴樣本稀釋液，取40 μL腦脊液樣本加入反應(yīng)試管中，隨后將膠體金試紙條插入反應(yīng)試管中，室溫孵育10 min后進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1傳統(tǒng)方法(墨汁染色法和培養(yǎng)法)檢測(cè)隱球菌的結(jié)果比較 將病例組和對(duì)照組患者的腦脊液標(biāo)本分別采用墨汁染色法直接鏡檢和直接接種培養(yǎng)法進(jìn)行檢測(cè)，病例組腦膜炎患者腦脊液標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果顯示：墨汁染色法陽(yáng)性15例，陽(yáng)性率為48.4%；培養(yǎng)法陽(yáng)性25例，6例腦脊液樣本培養(yǎng)結(jié)果為陰性，陽(yáng)性率為80.6%。對(duì)照組腦膜炎患者腦脊液標(biāo)本采用兩種方法檢測(cè)結(jié)果均為陰性。兩種傳統(tǒng)方法的陽(yáng)性檢出率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.045，P=0.008<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 4種檢測(cè)方法在各組中的檢測(cè)結(jié)果(n)

2.2隱球菌莢膜多糖抗原檢測(cè)方法(膠體金法和乳膠凝集法)檢測(cè)結(jié)果比較 病例組膠體金法共檢出陽(yáng)性27例對(duì)照組，陰性4例，陽(yáng)性率為87.1%；乳膠凝集法共檢出陽(yáng)性30例，陰性1例，陽(yáng)性率為96.8%。采用膠體金法有2例腦脊液樣本出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，其余均為陰性結(jié)果，采用乳膠凝集法有1例腦脊液樣本出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，其余均為陰性結(jié)果。兩種隱球菌莢膜多糖抗原檢測(cè)方法的陽(yáng)性檢出率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.958，P=0.354>0.05)，見(jiàn)表1。

2.3不同檢測(cè)方法的靈敏度和特異性比較 墨汁染色法、培養(yǎng)法、膠體金法和乳膠凝集法的靈敏度分別為48.3%、80.6%、87.1%、和96.8%，特異度分別為100.0%、100.0%、95.0%、和97.5%。比較4種方法的方法學(xué)指標(biāo)(靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值)，結(jié)果顯示隱球菌莢膜多糖抗原檢測(cè)方法靈敏度和陰性預(yù)測(cè)值顯著高于傳統(tǒng)墨汁染色法和培養(yǎng)法(均P<0.05)，但是，傳統(tǒng)方法(墨汁染色法和培養(yǎng)法)特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值高于隱球菌莢膜多糖抗原檢測(cè)(膠體金法和乳膠凝集法)方法(均P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 4種檢測(cè)方法的靈敏度和特異性比較(%)

表3 4種方法對(duì)隱球菌性腦膜炎的檢測(cè)結(jié)果比較

2.4不同檢測(cè)方法對(duì)隱球菌性腦膜炎的檢測(cè)結(jié)果比較 墨汁染色法與其他3種檢測(cè)方法比較，檢測(cè)結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，培養(yǎng)法與膠體金法和乳膠凝集法比較，檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見(jiàn)表3。

3 討 論

新型隱球菌廣泛存在于土壤與鴿糞中，在組織中呈圓形或卵圓形，革蘭染色陽(yáng)性，菌體被寬厚的莢膜所包裹，適宜的培養(yǎng)溫度為37 ℃，菌落呈乳白色，日久呈黏液狀，根據(jù)其莢膜抗原性的不同可分為A、AD、D、B和C 5個(gè)血清型[4]。新型隱球菌是一種機(jī)會(huì)性致病真菌。隱球菌性腦膜炎是最常見(jiàn)的肺外感染，其高病死率引起全球的特別關(guān)注。據(jù)報(bào)道，2014年在低收入國(guó)家隱球菌性腦膜炎患者病死率高達(dá)70%，中等收入國(guó)家其病死率高達(dá)40%，歐美國(guó)家其病死率約20%～30%[5]。傳統(tǒng)的隱球菌性腦膜炎的檢測(cè)主要是以墨汁染色直接鏡檢法和培養(yǎng)法為主，這是基礎(chǔ)和經(jīng)典的方法。目前，臨床常用的方法還有以隱球菌莢膜多糖抗原為檢測(cè)靶標(biāo)的血清學(xué)診斷技術(shù)，比如：新型隱球菌莢膜抗原乳膠凝集法、膠體金法等以及其他如影像學(xué)、分子技術(shù)和病理組織學(xué)檢查等診斷方法。

本研究中利用墨汁染色法、培養(yǎng)法、膠體金法和乳膠凝集法對(duì)31例臨床診斷隱球菌性腦膜炎患者和40例非隱球菌性腦膜炎患者腦脊液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示隱球菌莢膜多糖抗原檢測(cè)方法(膠體金法和乳膠凝集法)靈敏度和陰性預(yù)測(cè)值顯著高于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，尤以乳膠凝集法的靈敏度最高(96.8%)。但是傳統(tǒng)方法的特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值高于膠體金法和乳膠凝集法。傳統(tǒng)的墨汁染色法是最簡(jiǎn)便快速的診斷方法，但陽(yáng)性率最低(48.3%)，低于文獻(xiàn)[6]報(bào)道的陽(yáng)性率75.0%，主要因?yàn)樵摲椒ㄒ蕾嚇?biāo)本的采集時(shí)機(jī)、采集量和檢驗(yàn)人員的技能水平，感染早期病原菌數(shù)量少、采樣存在干擾因素或者檢驗(yàn)人員經(jīng)驗(yàn)不足均易導(dǎo)致誤診和漏診。培養(yǎng)法是隱球菌性腦膜炎診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但耗時(shí)且敏感性低，不能滿足對(duì)感染的早期診斷。本研究中培養(yǎng)法敏感性約為80.6%，有6例未培養(yǎng)出，可能是由于接種量過(guò)少或者患者處于感染早期，使得腦脊液中病原菌數(shù)量過(guò)少所致。

近年來(lái)，以乳膠凝集法和膠體金法為代表的隱球菌莢膜多糖抗原的檢測(cè)方法越來(lái)越多的應(yīng)用于臨床。膠體金法利用免疫層析技術(shù)，以膠體金標(biāo)記單克隆抗體，可檢測(cè)新型隱球菌的全部血清型[7]。該方法不需要昂貴的儀器設(shè)備，且簡(jiǎn)便易操作，檢測(cè)時(shí)間短，更適于床旁檢測(cè)。而且其靈敏度和特異度較傳統(tǒng)方法高，更適合用于隱球菌性腦膜炎的快速篩查。本研究中膠體金法的靈敏度與特異度分別為87.1%和95.0%，略低于文獻(xiàn)報(bào)道的91.7%和99.6%[7]。其中有4例標(biāo)本出現(xiàn)了假陰性結(jié)果，可能是由于患者在感染早期，抗原滴度較低，且該方法結(jié)果判定依賴主觀判斷所致。乳膠凝集法是4種方法中靈敏度和特異度最高的檢測(cè)方法，分別高達(dá)96.8%和97.5%，與文獻(xiàn)[8]報(bào)道一致。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者或者患者存在風(fēng)濕因子的情況下可出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，而在感染早期或者抗原滴度高等情況下,乳膠凝集法會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果[6,9-10]。

總之，傳統(tǒng)方法對(duì)隱球菌性腦膜炎檢測(cè)更直觀且更可靠，是臨床實(shí)驗(yàn)室最基本的檢測(cè)方法，尤以傳統(tǒng)培養(yǎng)法為輔助診斷隱球菌性腦膜炎的金標(biāo)準(zhǔn)。隱球菌莢膜多糖抗原檢測(cè)方法(膠體金法和乳膠凝集法)與傳統(tǒng)方法相比具有較高的靈敏度，可作為隱球菌性腦膜炎的早期診斷方法。其中膠體金法具有操作簡(jiǎn)單，報(bào)告迅速且可靠的特點(diǎn)，可用于臨床的快速篩查，對(duì)隱球菌性腦膜炎的輔助診斷具有十分重要的意義。