大鼠脊髓突觸體的制備及神經遞質的定性和定量分析

劉正，王靜，沈偉，趙舒煊，袁文華，馮曉飛，周海宇

1.蘭州大學第二醫(yī)院骨科，甘肅蘭州市730030；2.甘肅省骨關節(jié)疾病研究重點實驗室，甘肅蘭州市730030；3.解放軍第九四三醫(yī)院特診科，甘肅武威市733000

突觸是神經元相互接觸的部位，是神經元之間在功能上發(fā)生聯(lián)系的部位，也是信息傳遞的關鍵部位。突觸體最早由Whittaker等[1]命名，是指具有突觸區(qū)完整形態(tài)結構的封閉顆粒，某種意義上可被認為是功能完整的活細胞[2]，但與細胞又有很大區(qū)別。

在中樞神經系統(tǒng)(central nervous system,CNS)中，突觸傳遞最重要的方式是神經化學傳遞。神經遞質是指神經末梢釋放的特殊化學物質，它能作用于支配的神經元或效應細胞膜上的受體，從而完成信息傳遞功能[3]。

神經遞質分為四類，即生物原胺類、氨基酸類、肽類和其他類。生物原胺類神經遞質是最先發(fā)現(xiàn)的一類，包括多巴胺(dopamine,DA)、腎上腺素(epinephrine,E)、去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)、5-羥色胺(serotonin,5-HT)及其相關代謝產物高香草酸(high vanillic acid,HVA)、3,4-二羥基苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylacetic acid,DOPAC)、5-羥基吲哚乙酸(5-hydroxyindoleacetic acid,5-HIAA)、左旋多巴(levodopa,L-DOPA)[4]等。氨基酸類神經遞質包括γ-氨基丁酸(γaminobutyric acid,GABA)、甘氨酸(glycine,Gly)、 谷氨酸(glutamate,Glu)、組胺(histamine,His)、乙酰膽堿(acetylcholine,Ach)等。這些神經遞質在中樞神經系統(tǒng)中起著重要的作用，參與機體多種生理過程，其含量與人體健康密切相關[5]。例如，阿爾茨海默病[6]、抑郁癥[7]、帕金森病[8]、尿毒癥[9]、嗜鉻細胞瘤[10]、白內障[11]等都與其中的神經遞質有密切聯(lián)系。

目前，有多種方法用于測定神經遞質，如熒光檢測液相色譜法[12]、電化學分析法、熒光法[12]、氣相色譜-質譜法[13]和生物法[14]等，多用于測定和研究大腦部分區(qū)域的神經遞質。本研究旨在制備大鼠脊髓突觸體，并建立一種測定方法，去檢測大鼠脊髓突觸體中含有哪些神經遞質，對神經遞質進行定性和定量分析。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性Sprague-Dawley大鼠32只，標準體質量，由蘭州大學醫(yī)學院實驗動物中心提供；實驗動物生產許可證號SCXY(甘)2009-0004；使用許可證號SYXK(甘)2009-0005。本實驗經蘭州大學第二醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 主要儀器與設備

Thermo Ultimate 3000超高效液相色譜系統(tǒng)、Thermo Q Exactive四級桿靜電場軌道阱高分辨質譜、Allegra 64R超高速離心機：美國賽默飛世爾科技公司。SIGMA3-30k離心機：北京五洲東方科技發(fā)展有限公司。300 kV高分辨率電鏡Tecnai、F30透射電鏡：荷蘭Philips-FEI公司。CentriVap型Labconco離心濃縮系統(tǒng)、超純水儀：英國ELGA公司。BP1215分析天平：德國SATORIUS公司。

1.3 主要試劑與配制

DA、HVA標準品：日本東京化成工業(yè)。NE、5-HT、DOPAC、5-HIAA、GABA、3-甲氧酪胺(3-methoxytyramine,3-MT)、 色 氨 酸 (tryptophan,TRP)、 犬尿氨酸(kynurenine,KYN)、3-羥基犬尿氨酸(3-hydroxy kynurenine,3-HK)、3-羥基-2-氨基苯甲酸(3-hydroxy-2-aminobenzoic acid,3-HAA)標準品：美國密蘇里州SIGMA-ALDRICH公司。E標準品：加拿大多倫多研究化學公司。

內標GABA、甲酸、甲醇、乙腈、丙酮(色譜純)：德國達姆施塔特默克公司。其他同位素內標：加拿大TORONTO RESEARCH CHEMCALS公司。丹磺酰氯：日本東京化成工業(yè)。Percoll分層液：美國GE HEALTHCARE公司。實驗用水為超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm)。

標準溶液和質控溶液的配制：準確稱取適量標準品和同位素內標，用甲醇溶液溶解并配置成1 mg/ml的各單標儲備溶液；進而用甲醇梯度稀釋配置為10 μg/ml的混合標準應用液，混合內標應用液200 ng/ml；所有溶液儲存于-20℃冰箱備用；工作標準系列用標準應用液梯度稀釋而成。10點校正曲線覆蓋線性范圍0.02～20 ng(0.02 ng，0.05 ng，0.1 ng，0.2 ng，0.5 ng，1 ng，2 ng，5 ng，10 ng，20 ng)；質控溶液用同樣的方法配置，質控濃度為 1 ng(低)，2 ng(中)，5 ng(高)。

1.4 大鼠脊髓突觸體的制備

斷頭處死大鼠后在冰面上取出完整脊髓，將脊髓放入裝有4℃蔗糖緩沖液的燒杯中洗滌，去除雜質。從緩沖液中取出脊髓，用濾紙吸干后稱重，剪碎，然后將其放入預冷的研磨管，按1∶8(W/V)加入4℃蔗糖緩沖液，手動勻漿8次。然后將勻漿液裝入10 ml離心管中，用SIGMA 3k15離心機4℃、3600 r/min離心15 min。取上清液2 ml均勻緩慢平鋪于3%Percoll梯度層上，用SIGMA 3-30k離心機4℃、20 000 r/min離心6 min。抽取第三、四層，按1∶5(W/V)加入到4℃蔗糖緩沖液中稀釋，在燒杯中混勻，裝入10 ml離心管，4℃、15 000 r/min離心20 min。取出沉淀，4℃蔗糖緩沖液適當稀釋后，裝入1.5 ml EP離心管，4℃、12 000 r/min離心5 min，棄上清液，即得純化脊髓突觸體(圖1)。大鼠脊髓突觸體制備見圖2。

圖1 Percoll密度梯度離心分層

圖2 大鼠脊髓脊髓突觸體制備簡圖

1.5 透射電鏡觀察

將1.4節(jié)中離心后所得沉淀加入適量(約沉淀的10倍體積)2.5%戊二醛行前固定，4℃過夜，0.1 mol/L磷酸鹽漂洗3次后用1%鋨酸行后固定，再次漂洗后樹脂滲透包埋，常溫下固化1周，修塊，透射電鏡常規(guī)超薄切片，2%醋酸雙氧鈾染色20 min、檸檬酸鉛染色10 min，即可觀察。

1.6 神經遞質的測定

組織樣本置于1.5 ml EP離心管中；加入萃取液450 μl，水∶甲醇=1∶3(V/V)，加入混合內標應用液50 μl；以Tissuelyser儀器進行均質化。均質化條件：不銹鋼珠(直徑3 mm)1粒，振動頻率30 Hz，震動時間3 min，重復3次；15 000 r/min高速冷凍離心15 min；吸取上清，轉移至干凈1.5 ml EP離心管中，真空濃縮至干，進行衍生化反應。

衍生化反應：碳酸氫鈉(pH=11.0，0.2 mol/L)溶液50 μl和丹磺酰氯(2 mg/mL)溶液 50 μl加入揮干的樣品中，渦旋1 min；60℃水浴鍋中反應8 min。反應溶液18 000 r/min高速冷凍離心10 min，取上清80 μl轉移至帶玻璃內襯管的進樣小瓶中，進樣5 μl上機測定。

1.7 色譜條件

ThermoUltimate 3000超高效液相色譜系統(tǒng)；Acquity UPLC?BEH-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；柱溫35℃；流動相A為乙腈+0.1%甲酸；流動相B為純水+0.1%甲酸；流速為0.25 ml/min；進樣量5 μl。梯度條件見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

1.8 質譜條件

Thermo Q Exactive四級桿靜電場軌道阱高分辨質譜儀。離子源：HESI-II，正離子模式。源區(qū)條件：噴霧電壓3 kV，毛細管溫度350℃，加熱溫度425℃，S-lens RF水平50；鞘氣50，輔助氣13，反吹氣3。所有源區(qū)參數(shù)單位為儀器自設單位(arbitrary unit)。氮氣被用作HCD碰撞池的碰撞氣和C-trap的阻尼氣；掃描類型為Targeted-MS/MS；分辨率為17 500。儀器控制、數(shù)據(jù)采集和分析均使用Xcalibur 2.2軟件(美國賽默飛世爾科技)。質譜參數(shù)見表2。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 23.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以()表示，采用t檢驗。本實驗均采用雌性大鼠，故不考慮性別對實驗結果的影響。顯著性水平α1=0.05，非常顯著性水平α2=0.01。

2 結果

2.1 大鼠脊髓突觸體電鏡圖

大鼠脊髓突觸體是具有完整形態(tài)的橢圓形結構，突觸小泡、線粒體等包含在其中。見圖3。

2.2 神經遞質的測定

混合標準溶液的色譜圖見圖4，樣品色譜圖見圖5。

表2 UHPLC-MS/MS質譜參數(shù)

圖3 大鼠脊髓突觸體電鏡圖

圖4 標準品色譜圖

圖5 樣品色譜圖

準確量取適量標準品，將其定量混合并用標準品溶液稀釋，得到一系列質量濃度不同的溶液，按照1.7，1.8節(jié)色譜、質譜條件進樣分析，對上述系列濃度各測定6次后，取其峰面積的平均值，以進樣質量濃度X對峰面積Y作圖，繪制標準曲線。各神經遞質線性方程、相關系數(shù)見表3。

表3 各神經遞質的線性方程、相關系數(shù)

3 討論

生物樣品中神經遞質含量很低，通常在血液中僅為pmol/ml級[15]，且生物樣品本身基體復雜，內源性干擾因素很多，因此神經遞質的測定異常困難。本實驗目的是測定大鼠脊髓突觸體中所含有的神經遞質，并對其進行定性、定量分析。哺乳動物的不同組織，都存在神經遞質的合成和分泌過程[16]。國內外大多數(shù)關于神經遞質測定的研究都集中在大腦，鮮有在脊髓。因此我們從脊髓方向對神經遞質進行測定研究。

我們需要大鼠脊髓中的突觸體，不是所有脊髓成分，因此我們用不連續(xù)性Percoll密度梯度離心法[17]將大鼠脊髓突觸體提出，用超高效液相色譜-質譜聯(lián)用法[18]對脊髓突觸體進行檢測分析。本實驗檢測出大鼠脊髓突觸體中含有DA、NE、5-HT等單胺類神經遞質，GABA、TRP等氨基酸類神經遞質，以及DA代謝產物DOPAC、HVA、3-MT，5-HT代謝產物5-HIAA，TRP代謝產物KYN、3-HK、3-HAA。本實驗與其他國內外研究者在測定大腦中所含神經遞質的結果有很大不同。

表4 大鼠脊髓突觸體中神經遞質的含量(ng/g)

多數(shù)研究者采用高效液相色譜法[19]測定出大鼠大腦中含有8種單胺類神經遞質以及Glu、GABA、Gly、Asp等幾種主要氨基酸。本實驗測定出3-MT、KYN、3-HK、3-HAA，經查詢相關文獻并未在大腦中測出。其中3-MT是DA的代謝產物，KYN、3-HK、3-HAA是TRP的代謝產物。3-MT在多巴胺能神經元的細胞體中合成[20]，并儲于紋狀體的含致密中心囊泡的膨體中，在DA神經元興奮時可導致其末梢釋放，通過激活獨特的DA受體，而產生生理效應。3-MT在醫(yī)療上用作升壓藥，作用為興奮心臟、增強腎血流量。KYN、3-HK、3-HAA是TRP在犬尿氨酸途徑[21]生成的代謝中間產物，犬尿氨酸途徑與心血管疾病有密切聯(lián)系。用同一種方法，其他研究者在測定大腦中神經遞質時，只測出其中含有幾種單胺類神經遞質，或者用同一種方法，只測出其中含有幾種氨基酸。沒有相關文獻報道他們在大腦中同時測出含有單胺類和氨基酸類神經遞質。我們在大鼠脊髓突觸體中檢測出這兩類神經遞質。

以上結果說明大腦和脊髓突觸體中的神經遞質雖有許多相同之處，但還是有一些細微的差別；也間接說明脊髓突觸體是具有生理活性的物質。它類似于一個功能完整的活細胞[2]，但與細胞又有很大區(qū)別，無論是從形態(tài)還是內在結構。我們測出脊髓突觸體中所含有的神經遞質，對于臨床有很大幫助。例如，阿爾茨海默病[22]患者5-HT系統(tǒng)嚴重受損，5-HT是維持大腦正常智力的重要遞質；高血壓[23]患者NE水平發(fā)生改變，導致血管收縮，血壓升高；白內障患者3-HK水平改變，可以放大氧化應激反應，修飾晶狀體蛋白[24]。對這些神經遞質進行分析研究，能得出某種神經遞質與某種疾病之間存在的關系，這有助于我們對臨床疾病做出正確的診斷以及治療方案。下一步我們將從脊髓突觸體出發(fā)，研究脊髓損傷后如何使患者盡可能向正常生理狀態(tài)恢復，這是臨床上較難克服的問題。