大鼠脊髓損傷后脊髓組織中上調(diào)差異基因的生物信息學(xué)分析

鐘占瓊，薛清彩，易曉紅，黃聰，于海艷，劉偉偉，陳繼蘭，夏軍，張曉

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川成都市611137；2.成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川成都市610500

作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脊髓組織在機(jī)體的生命活動中發(fā)揮重要作用，脊髓的劇烈損傷伴隨著嚴(yán)重的上行和下行通路的傳導(dǎo)障礙。隨著交通的發(fā)達(dá)和極限運(yùn)動的流行，脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)的發(fā)生率持續(xù)增加。據(jù)最新統(tǒng)計，脊髓損傷影響全球人數(shù)超過2704萬[1]。物理性損傷導(dǎo)致?lián)p傷段脊髓出血、腫脹等，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞缺血、缺氧、壞死。隨著脊髓水腫和炎癥的發(fā)生，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的壞死、凋亡向損傷中心以外的組織擴(kuò)散，神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕的形成可以穩(wěn)定繼發(fā)性損傷的擴(kuò)散，但也阻止了軸突的再生[2]。炎癥反應(yīng)、水腫、缺血、缺氧、興奮性毒性、自由基損傷、脂質(zhì)過氧化、凋亡、神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕的形成等[3]繼發(fā)性損傷嚴(yán)重影響神經(jīng)可塑性和功能恢復(fù)。

目前，有大量實驗研究顯示脊髓損傷后出現(xiàn)基因上調(diào)或下降，如白細(xì)胞介素-10(interleukin-10,IL-10)、人原肌球蛋白α4(tropomyosin 4,TPM4)、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白X(B-cell lymphoma-2 associated X protein,Bax)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3,Casp-3)、水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)[4-5]等。然而，大多研究主要從單個基因或蛋白與脊髓損傷后細(xì)胞的炎癥、凋亡和水腫等多種改變相關(guān)聯(lián)進(jìn)行研究，缺少系統(tǒng)分析。

近年來，借助生物技術(shù)手段從整體上探索基因組在疾病中的作用及規(guī)律越來越受到重視?；蛐酒夹g(shù)正是基于這種手段通過雜交測序方法，將已知序列的脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)探針與待測的經(jīng)標(biāo)記的DNA樣品雜交，同時檢測上萬種基因。具有高通量和全面特性的基因芯片技術(shù)，現(xiàn)已經(jīng)廣泛用于DNA測序、基因表達(dá)分析與基因調(diào)控機(jī)理的研究。目前，基因分析運(yùn)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究越來越多[6]，例如阿爾茨海默病[7]、孤獨癥[8]和帕金森綜合征[9]。此外，基因分析也運(yùn)用于腦損傷和脊髓損傷等疾病[10]。

本課題前期構(gòu)建大鼠脊髓損傷模型，取脊髓損傷段組織用基因芯片的技術(shù)檢測基因表達(dá)。結(jié)合課題組前期結(jié)果，本文主要分析在檢測出差異表達(dá)基因中的上調(diào)基因部分，采用基因本體論(gene ontology,GO)和基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析差異上調(diào)基因的功能定位與通路，主要從生物學(xué)途徑(biological process,BP)、細(xì)胞組件(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)三方面進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康成年雌性Sprague-Dawley大鼠6只(成都達(dá)碩公司)，體質(zhì)量(200±20)g，單籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度20～28℃。實驗動物隨機(jī)分為對照組(sham組)和脊髓損傷組(SCI組)，正常光照和飲食。

1.2 動物模型制備

3.6 %水合氯醛10 ml/kg腹腔注射麻醉實驗大鼠。俯臥位固定、消毒。定位T10棘突，常規(guī)行椎板切除術(shù)，暴露脊髓。將10 g金屬棒從30 mm處自由下落，造成脊髓鈍傷模型(脊髓損傷組)。對照組只剝離椎板，暴露脊髓但不損傷脊髓。術(shù)后逐層縫合傷口，每天給予大鼠肌肉注射青霉素80 000 IU/kg，持續(xù)3 d。大鼠正常進(jìn)食、飲水，獨籠飼養(yǎng)。每天兩次協(xié)助排尿，直至大鼠恢復(fù)自主排尿。

在術(shù)后第3天，以損傷段脊髓為中心點，取脊髓組織1 cm，-80℃冰箱保存。

1.3 基因芯片的檢測

取脊髓組織提取RNA后，進(jìn)行基因芯片檢測分析，該部分交于上海其明公司進(jìn)行操作。采用昂飛基因芯片2.0版本(Affymetrix GeneChip Gene 2.0芯片)進(jìn)行檢測分析?；蛐酒貌僮鬈浖?GeneChip Operating Software,GCOS)掃描得到的圖像，采用Agilent GeneSpring GX software(version 11.5.1)分析，所得的表達(dá)數(shù)據(jù)均已進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。用差異基因倍數(shù)改變的篩選方法，以檢測到的樣本信號強(qiáng)度比值上調(diào)或下調(diào)大于1.5倍界定為差異表達(dá)基因。采用MultiExperiment Viewer(version 4.9.0)進(jìn)行分級群聚的聚類分析，并對差異基因中的上調(diào)基因部分深入進(jìn)行GO(http://www.geneontology.org/)分析及KEGG(http:www.genome.jp/kegg/)信號通路分析[11]。

2 結(jié)果

2.1 樣本質(zhì)量

將提取脊髓組織總RNA上樣于1%瓊脂糖凝膠孔中，120 V電壓5 min。利用紫外分光光度儀測量RNA濃度，并通過A260/A280值初步判斷RNA質(zhì)量報告(表1)。釆用RNA變性瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA完整性，可見明顯的28S和18S條帶，未見其他明顯雜帶，無污染，未降解，可用于下一步分析(圖1)。

表1 樣本總RNA檢測結(jié)果

圖1 脊髓組織瓊脂糖電泳結(jié)果

2.2 差異表達(dá)基因

兩組差異表達(dá)基因4222個，其中上調(diào)基因1874個，下調(diào)基因2348個。利用Cluster軟件導(dǎo)入數(shù)據(jù)，制作熱圖(圖2)。

圖2 脊髓損傷組與對照組差異基因熱圖

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 生物學(xué)途徑

根據(jù)差異基因數(shù)量排名前15位的生物學(xué)途徑分別是：參與負(fù)調(diào)控凋亡過程(negative regulation of apoptotic process)478個，對藥物的反應(yīng)(response to drug)462個，蛋白質(zhì)磷酸化(protein phosphorylation)353個，負(fù)調(diào)控細(xì)胞增殖(negative regulation of cell proliferation)308個，細(xì)胞黏附(cell adhesion)260個，正調(diào)控凋亡過程(positive regulation of apoptotic process)258個，對缺氧的反應(yīng)(response to hypoxia)242個，細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(intracellular signal transduction)236個，對有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)(response to organic cyclic compound)230個，代謝過程(metabolic process)230個，免疫反應(yīng)(immune response)215個，對脂多糖(response to lipopolysaccharide)的反應(yīng)211個，心臟發(fā)育(heart development)191個，炎癥反應(yīng)(inflammatory response)189個，老化(aging)189個(圖3A)。

根據(jù)富集倍數(shù)排名前15位的生物學(xué)途徑分別是：模式識別受體信號通路(pattern recognition receptor signaling pathway)、吞噬溶酶體組裝(phagolysosome assembly)、細(xì)胞-基底連接組件(cell-substrate junction assembly)、參與免疫反應(yīng)的嗜中性粒細(xì)胞活化(neutrophil activation involved in immune response)、參與免疫反應(yīng)的白細(xì)胞活化(leukocyte activation involved in immune response)、神經(jīng)節(jié)苷脂分解代謝過程(ganglioside catabolic process)、寡糖分解代謝過程(oligosaccharide catabolic process)、銅離子的解毒(detoxification of copper ion)、抗原加工和通過主要組織相容性復(fù)合體I類呈遞內(nèi)源性肽抗原(antigen processing and presentation of endogenous peptide antigen via major histocompatibility complex class I)、檢測脂多糖(detection of lipopolysaccharide)、Toll樣受體7信號通路(Toll-like receptor 7 signaling pathway)、Fc-γ受體信號傳導(dǎo)途徑(Fc-gamma receptor signaling pathway)、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子蛋白酪氨酸磷酸化的正調(diào)控(positive regulation of tyrosine phosphorylation of signal transducer and activator of transcription protein)、抗原加工和通過主要組織相容性復(fù)合體I類呈遞外源性肽抗原(antigen processing and presentation of exogenous peptide antigen via major histocompatibility complex class I)、負(fù)向調(diào)節(jié)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞(negative regulation of viral entry into host cell)(圖 3B)。

根據(jù)富集積分(enrichment score)排名前15位的生物學(xué)途徑分別是：先天免疫反應(yīng)(innate immune response)、對脂多糖的反應(yīng)(response to lipopolysaccharide)、炎癥反應(yīng)(inflammatory response)、對有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)(response to organic cyclic compound)、對藥物的反應(yīng)(response to drug)、正調(diào)控凋亡過程(positive regulation of apoptotic process)、細(xì)胞黏附(cell adhesion)、負(fù)調(diào)控凋亡過程(negative regulation of apoptotic process)、細(xì)胞遷移的正調(diào)控(positive regulation of cell migration)、細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)(cellular response to lipopolysaccharide)、整合素介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑(integrin-mediated signaling pathway)、正調(diào)節(jié)IκB 激酶/核因子-κB級聯(lián)反應(yīng)(positive regulation of I-kappaB kinase/nuclear factor-kappaB cascade)、老化(aging)、蛋白質(zhì)磷酸化(protein phosphorylation)、免疫反應(yīng)(immune response)(圖 3C)。

本研究在查閱大量相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗的目的和計劃，著重探討大花序桉莖段外植體消毒及其芽誘導(dǎo)組織培養(yǎng)技術(shù)，采用正交設(shè)計或完全組合設(shè)計安排試驗，探討外源激素的添加效果，篩選最有利的內(nèi)外源激素的組合和比例，篩選出最優(yōu)技術(shù)參數(shù)組合，從外源激素的協(xié)調(diào)上建立大花序桉最優(yōu)組培快繁體系。

2.3.2 細(xì)胞組分

根據(jù)差異基因數(shù)量排名前15位的細(xì)胞組件分別是：細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)455個、細(xì)胞核(nucleus)432個、細(xì)胞外囊泡外泌體(extracellular vesicular exosome)405個、微膜(integral to membrane)319個、質(zhì)膜(plasma membrane)300個、細(xì)胞膜(membrane)271個、細(xì)胞外空間(extracellular space)173個、核仁(nucleolus)158個、細(xì)胞成分(cellular_component)150個、細(xì)胞質(zhì)溶膠(cytosol)142個、細(xì)胞內(nèi)(intracellular)114個、細(xì)胞表面(cell surface)108個、線粒體(mitochondrion)93個、局部性黏附(focal adhesion)93個、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum)84個 (圖4A)。

圖3 上調(diào)基因的分子生物學(xué)途徑分析圖

根據(jù)富集度排名前15位的細(xì)胞組分分別是：肌動蛋白相關(guān)蛋白2/3復(fù)合體(actin-related protein-2/3 complex,Arp2/3 protein complex)、炎性小體3復(fù)合體(NOD-like receptor pyrin domain containing 3 inflamma-some complex,NLRP3 complex)、凝聚核染色體外著絲粒(condensed nuclear chromosome outer kinetochore)、異常糖鏈糖蛋白復(fù)合體(transporter of antigenic peptides,TAP complex)、轉(zhuǎn)化生長因子β受體同型二聚復(fù)合物(transforming growth factor beta receptor homodimeric complex,TGF-βr homoderic complex)、炎性小體1復(fù)合體(NOD-like receptor pyrin domain containing 1 inflammasome complex,NLRP1 complex)、胞質(zhì)分裂相關(guān)蛋白復(fù)合體(centralspindlin complex)、I型膠原蛋白(collagen type I)、早期內(nèi)體腔(early endosome lumen)、B細(xì)胞淋巴瘤3基因/核轉(zhuǎn)錄因子2復(fù)合物(B-cell lymphoma 3/nuclear factor-kappaB 2 complex,Bcl3/NF-κB2 complex)、整聯(lián)蛋白α1β1復(fù)合物(alpha1-beta1 integrin complex,α1β1 integrin complex)、整聯(lián)蛋白αLβ2復(fù) 合 物 (alphaL-beta2 integrin complex,αLβ2 integrin complex)、Toll樣受體2-Toll樣受體6蛋白復(fù)合物(Tolllike receptor 2-Toll-like receptor 6 protein complex)、β-連環(huán)蛋白-轉(zhuǎn)錄因子7類似物2復(fù)合物(beta-catenintranscription factor 7-like-2 complex,β-catenin-TCF7L2 complex)、α9-β1-整合素-去整合素和金屬蛋白酶域-8復(fù)合物(alpha9-beta1 integrin-a disintegrin and metalloprotease complex, α9-β1 intergin-ADAM8 complex)(圖 4B)。

根據(jù)富集積分排名前15位的細(xì)胞組件分別是：細(xì)胞外囊泡外泌體(extracellular vesicular exosome)、細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)、細(xì)胞核(nucleus)、細(xì)胞膜(membrane)、細(xì)胞外空間(extracellular space)、質(zhì)膜(plasma membrane)、細(xì)胞表面(cell surface)、局部性黏附(focal adhesion)、積分膜(integral to membrane)、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix)、細(xì)胞質(zhì)溶膠(cytosol)、核仁(nucleolus)、細(xì)胞內(nèi)(intracellular)、溶酶體(lysosome)、細(xì)胞成分(cellular component)(圖4C)。

圖4 上調(diào)基因的細(xì)胞組分分析圖

2.3.3 分子功能

按照差異基因數(shù)量排名前15位的分子功能分別是：與分子功能相關(guān)(molecular function)189個，與蛋白質(zhì)結(jié)合(protein binding)154個，與腺嘌呤核苷三磷酸結(jié)合(Adenosine triphosphate binding,ATP binding)150個，與DNA結(jié)合(DNA binding)96個，與金屬離子結(jié)合(metal ion binding)93個，與鋅離子結(jié)合(zinc ion binding)93個，與蛋白質(zhì)同源二聚化活性(protein homodimerization activity)79個，與相同的蛋白結(jié)合(identical protein binding)72個，與鈣離子結(jié)合(calci-um ion binding)70個，與蛋白質(zhì)異源二聚化活性(protein heterodimerization activity)69個，與蛋白激酶結(jié)合(protein kinase binding)60個，與序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性(sequence-specific DNA binding transcription factor activity)56個，與蛋白復(fù)合物結(jié)合(protein complex binding)50個，與蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)42個，與碳水化合物結(jié)合(carbohydrate binding)42個(圖 5A)。

根據(jù)富集度排名前15位的分子功能分別是：趨化因子受體3結(jié)合(C-X-C chemokine receptor type 3,CXCR3 chemokine receptor binding)、脂多糖受體活性(lipopolysaccharide receptor activity)、脂磷壁酸結(jié)合(lipoteichoic acid binding)、β-N-乙酰己糖胺酶活性(beta-N-acetylhexosaminidase activity)、前膠原-賴氨酸 5-雙加氧酶活性(procollagen-lysine 5-dioxygenase activity)、嘌呤核苷酸結(jié)合(purine nucleotide binding)、IgG受體活性(IgG receptor activity)、嘌呤核苷堿基結(jié)合(purine nucleobase binding)、磷酸二酯酶I活性(phosphodiesterase I activity)、芳基烴受體活性(aryl hydrocarbon receptor activity)、白細(xì)胞介素-10受體活性(interleukin-10 receptor activity)、花生四烯酸11,12-環(huán)氧化酶活性(arachidonic acid 11,12-epoxygenase activity)、肽抗原轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶活性(peptide antigen-transporting ATPase activity)、凋亡蛋白酶激活劑活性(apoptotic protease activator activity)、主要組織相容性復(fù)合體Ib類蛋白結(jié)合(major histocompatibility complex class Ib protein binding)(圖 5B)。

根據(jù)富集積分排名前15位的分子功能分別是：分子功能(molecular function)、蛋白質(zhì)結(jié)合(protein binding)、ATP結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚化活性(protein heterodimerization activity)、蛋白激酶結(jié)合(protein kinase binding)、相同的蛋白結(jié)合(identical protein binding)、蛋白質(zhì)同源二聚化活性(protein homodimerization activity)、DNA結(jié)合、整合素結(jié)合(integrin binding)、碳水化合物結(jié)合(carbohydrate binding)、肝素結(jié)合(heparin binding)、蛋白復(fù)合物結(jié)合(protein complex binding)、鋅離子結(jié)合(zinc ion binding)、鈣離子結(jié)合(calcium ion binding)、金屬離子結(jié)合(metal ion binding)(圖 5C)。

圖5 上調(diào)基因的分子功能分析圖

2.4 信號通路

脊髓損傷組上調(diào)顯著的信號通路共103個，根據(jù)P值的高低，前15種信號通路分別是：破骨細(xì)胞分化(osteoclast differentiation)、吞噬體(phagosome)、人類嗜T細(xì)胞病毒I型感染(human T cell leukemia virus type-I,HTLV-I infection)、溶酶體(lysosome)、Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)、磷脂酰肌醇三激酶-蛋白激酶B信號通路(phosphatidylinositol 3-kinase protein kinase B signaling pathway,PI3K-Akt signaling pathway)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus)、趨化因子信號通路(chemokine signaling pathway)、局部黏附(focal adhesion)、結(jié)核(tuberculosis)、利什曼病(leishmaniasis)、甲型流感(influenza A)、細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用(extracellular matrix receptor interaction)、弓形體病(toxoplasmosis)(圖 6)。

圖6 上調(diào)基因的信號通路

3 討論

脊髓損傷后，原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷導(dǎo)致感覺和運(yùn)動功能障礙，嚴(yán)重影響家庭的生活質(zhì)量，因此，深入研究治療脊髓損傷具有重大的意義。當(dāng)前研究的主要目標(biāo)是找出影響脊髓損傷后功能恢復(fù)的關(guān)鍵基因和蛋白。本研究系統(tǒng)檢測了脊髓損傷后基因的表達(dá)變化，采用生物信息學(xué)的方法分析差異上調(diào)基因的主要功能、定位和通路，為后續(xù)找準(zhǔn)關(guān)鍵靶點指明方向。

當(dāng)前，眾多脊髓損傷實驗研究根據(jù)不同的實驗?zāi)康暮鸵螅瑩p傷實驗動物T10脊髓段，并選取對應(yīng)損傷點1 cm脊髓組織用于研究[12]，或損傷T9～T10胸椎，并選取對應(yīng)脊髓段(T8～T10)用于后續(xù)的基因水平表達(dá)或蛋白的研究[13]。本課題組前期預(yù)實驗結(jié)果顯示，脊髓損傷后同一基因在脊髓損傷段和損傷上段、損傷下段表達(dá)有差異，為了得到更為準(zhǔn)確的結(jié)果，本研究構(gòu)建脊髓鈍挫傷模型，根據(jù)動物脊髓對應(yīng)的節(jié)段范圍，選取以損傷段為中心的損傷段脊髓(約1 cm)用以研究。

本研究采用Affymetrix GeneChip Gene 2.0芯片檢測脊髓損傷組和對照組在損傷后脊髓損傷段組織的差異表達(dá)基因，結(jié)果顯示上調(diào)或下調(diào)1.5倍的差異基因有4222個，包括1874個上調(diào)基因和2348個下調(diào)基因。脊髓損傷后有大量基因發(fā)生差異性變化，尤其是下調(diào)基因占多數(shù)。以往的實驗研究結(jié)果顯示，與神經(jīng)痛相關(guān)的環(huán)指蛋白34(ring finger protein 34,RNF34)和垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide,PACAP)基因水平在脊髓損傷后增加[14]，與炎癥相關(guān)的白細(xì)胞介素-6、白血病抑制因子、白細(xì)胞介素-11等基因水平在脊髓損傷后增加[15]。與凋亡有關(guān)的鋅指蛋白38基因水平下調(diào)[16]，而哺乳動物無菌-20樣激酶1(mammalian ste20-like kinase 1,Mst1)在野生型小鼠損傷的脊髓組織中表達(dá)升高[17]；在脊髓完全損傷的模型中，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell-derived neurotrophic factor,GDNF)的表達(dá)降低[18]。在脊髓損傷后48 h，AQP4表達(dá)降低[19]。結(jié)合本實驗芯片結(jié)果，我們認(rèn)為脊髓損傷后有差異基因上調(diào)或者下調(diào)，這與基因參與脊髓損傷后功能相一致。此外，同一個基因在不同的損傷階段和不同的組織中可能會出現(xiàn)不同的結(jié)果，甚至相反的結(jié)果。實驗研究表明，AQP4在脊髓損傷后的急性期和慢性期表達(dá)不一樣，與損傷后不同時間段水腫有關(guān)[20]。

根據(jù)芯片的檢測結(jié)果進(jìn)行初步分析后，將1874個上調(diào)基因按照生物學(xué)途徑進(jìn)行分類，分別從生物學(xué)過程分類排序、富集倍數(shù)和富集分?jǐn)?shù)選取排名前15位的生物學(xué)途徑。綜合三項結(jié)果分析，脊髓損傷后上調(diào)基因大多參與負(fù)調(diào)控凋亡過程、蛋白質(zhì)磷酸化、負(fù)調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞黏附、正調(diào)控凋亡過程、對缺氧的反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)、代謝過程、免疫反應(yīng)、抗原加工和通過主要組織相容性復(fù)合體I類呈遞內(nèi)源性肽抗原、對脂多糖的反應(yīng)、心臟發(fā)育、炎癥反應(yīng)、老化、對藥物的反應(yīng)、神經(jīng)節(jié)苷脂分解代謝過程，提示脊髓損傷過程中出現(xiàn)大量涉及細(xì)胞基本代謝、凋亡、炎癥和免疫反應(yīng)的基因表達(dá)上調(diào)，可能與脊髓損傷后神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞變性、死亡、凋亡等密切相關(guān)，并引發(fā)炎癥和免疫應(yīng)答反應(yīng)，因此影響細(xì)胞功能的過程，是一個多基因參與的復(fù)雜過程。脊髓損傷后炎癥反應(yīng)引發(fā)機(jī)體的功能障礙，予芬維A胺、沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(silent information regulator 2,SIRT1)等都有助于減輕炎癥，促進(jìn)運(yùn)動功能的恢復(fù)[21]。

從細(xì)胞組分定位結(jié)果分析，脊髓損傷后脊髓組織中1874個上調(diào)基因，大部分定位在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞外囊泡外泌體、微膜、質(zhì)膜、細(xì)胞膜、細(xì)胞外、核仁、細(xì)胞成分、細(xì)胞內(nèi)、線粒體。根據(jù)富集度和富積分?jǐn)?shù)選取排名靠前的細(xì)胞組分，主要是肌動蛋白相關(guān)蛋白2/3復(fù)合體、炎性小體3復(fù)合體、異常糖鏈糖蛋白復(fù)合體、轉(zhuǎn)化生長因子β受體同型二聚復(fù)合物、炎性小體1復(fù)合體、胞質(zhì)分裂相關(guān)蛋白復(fù)合體、B細(xì)胞淋巴瘤3基因/核轉(zhuǎn)錄因子2復(fù)合物、整聯(lián)蛋白αLβ2復(fù)合物、Toll樣受體2-Toll樣受體6蛋白復(fù)合物、β-連環(huán)蛋白-轉(zhuǎn)錄因子7類似物2復(fù)合物、α9-β1-整合素-去整合素和金屬蛋白酶域-8復(fù)合物等。說明脊髓損傷后亞急性期，定位于以上亞細(xì)胞器的基因較為敏感甚至直接受到損害，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)、缺血缺氧等。提示在脊髓損傷的不同階段實施不同治療措施，或許對脊髓損傷的急性期和慢性期有一定的作用，但仍需要進(jìn)一步研究證實。

從差異基因數(shù)量、富集倍數(shù)和富集分?jǐn)?shù)研究上調(diào)基因的分子功能，結(jié)果顯示，排名靠前的基因功能主要與細(xì)胞成分、離子以及生物活性因子等結(jié)合，如分子功能、ATP結(jié)合、嘌呤核苷酸結(jié)合、DNA結(jié)合、嘌呤核苷堿基結(jié)合、蛋白復(fù)合物結(jié)合、金屬離子結(jié)合、鋅離子結(jié)合、鈣離子結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、整合素結(jié)合、碳水化合物結(jié)合、肝素結(jié)合、脂磷壁酸等；與多種細(xì)胞酶或受體活性等有關(guān)，如β-N-乙酰己糖胺酶活性、前膠原-賴氨酸5-雙加氧酶活性、磷酸二酯酶I活性、花生四烯酸11,12-環(huán)氧化酶活性、肽抗原轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶活性、蛋白激酶活性、凋亡蛋白酶激活劑活性、趨化因子受體3、脂多糖受體活性、IgG受體活性、芳基烴受體活性、白細(xì)胞介素-10受體活性等。提示在脊髓損傷后，脊髓組織中上調(diào)的功能基因與脊髓中神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的功能受損或缺失有關(guān)系，并發(fā)現(xiàn)有與凋亡、趨化因子和炎癥等相關(guān)的受體相關(guān)的上調(diào)基因，進(jìn)一步說明脊髓損傷后在急性期和亞急性期有炎性因子的浸潤，繼發(fā)性引發(fā)細(xì)胞功能障礙。我們推測這些基因表達(dá)差異可能與脊髓運(yùn)動功能和感覺功能缺損密切相關(guān)，但還有待進(jìn)一步的證實。

將上調(diào)的差異基因進(jìn)行信號通路分析，參與的通路共有103個，但主要有破骨細(xì)胞分化、吞噬、溶酶體、Toll樣受體信號通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、PI3K-Akt信號通路、趨化因子信號通路，結(jié)果提示，在脊髓損傷后有多條信號通路發(fā)生顯著改變，涉及到多種細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)過程，找出信號通路中的關(guān)鍵因子對脊髓損傷后的治療有重要意義。有實驗研究表明，纖維母細(xì)胞生長因子10(fibroblast growth factor 10,FGF10)可以通過減少細(xì)胞凋亡以及通過PI3K/Akt途徑修復(fù)神經(jīng)突，改善脊髓損傷后的功能[22]。

綜上所述，本研究通過采用基因芯片技術(shù)，研究脊髓損傷組和對照組脊髓組織中的差異表達(dá)基因，進(jìn)一步從生物學(xué)途徑、細(xì)胞組分和分子功能三個方面分析上調(diào)差異表達(dá)基因，結(jié)果提示，在脊髓損傷急性期上調(diào)差異基因變化參與多條信號通路，與細(xì)胞凋亡、炎性、免疫應(yīng)答等有關(guān)。機(jī)體發(fā)生脊髓損傷后，發(fā)生一系列多基因協(xié)同參與調(diào)控的復(fù)雜過程，對差異表達(dá)的基因進(jìn)行系統(tǒng)分析有助于闡明脊髓損傷后發(fā)生變化的生物學(xué)機(jī)制，為后續(xù)研究脊髓損傷提供理論依據(jù)。