嗜酸乳桿菌對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型的保護(hù)機(jī)制研究*

任 聰，陳向東，汪 輝，鮑張杰，練家惠

中國藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京 210009

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是炎癥性腸病的一種，潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病原因尚不明確，可能與遺傳、環(huán)境、免疫紊亂和腸道菌群失調(diào)等因素有關(guān)。臨床對(duì)于潰瘍性結(jié)腸炎主要應(yīng)用以柳氮磺胺吡啶為代表的氨基水楊酸類藥物作為主要的治療藥物[1]，對(duì)大部分輕、中度患者可收獲較好的療效，但對(duì)部分患者，特別是長期服藥的患者存在易復(fù)發(fā)和副作用大等缺陷[2]，且長期服藥價(jià)格較高。因此，尋找廉價(jià)且副作用小的新療法成為近年來醫(yī)藥學(xué)界的研究熱點(diǎn)。

近年來益生菌在UC治療中越來越受到人們的關(guān)注[3]。本課題組先前對(duì)多株益生菌進(jìn)行耐酸和耐膽鹽抗性篩選，得到一株抗性最佳的嗜酸乳桿菌作為試驗(yàn)菌株。本研究旨在通過探究嗜酸乳桿菌對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的保護(hù)作用及其作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用嗜酸乳桿菌治療和緩解潰瘍性結(jié)腸炎提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和菌株

健康SPF級(jí)ICR小鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量（18~20）g，購自南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場，合格證編號(hào)：201728275，飼養(yǎng)于中國藥科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）由中國藥科大學(xué)微生物學(xué)教研室提供。

1.2 藥品與試劑

MRS培養(yǎng)基（北京奧博星生物科技有限公司）；RNAiso Plus、2×PrimeSTAR Max Premix（Takara）；5×All-In-One MasterMix（南京愛必夢(mèng)生物材料有限公司）；2×UltraSYBR Mixture（康為世紀(jì)生物科技有限公司）；柳氮磺胺吡啶（上海信誼天平藥業(yè)）；葡聚糖硫酸鈉（MP Biomedicals）；重蒸水自制。

1.3 儀器

CFX96 real-time PCR儀、S1000TM Thermal Cycler PCR儀（美國伯樂有限公司）。

2 方 法

2.1 DSS誘導(dǎo)小鼠UC建模和給藥

將40只SPF級(jí)ICR小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為模型組、陽性藥組、菌液組和空白組。

模型組、陽性藥組和菌液組均使用葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）造模，方法為以自由飲用的方式給予小鼠質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的DSS水溶液，時(shí)長為7天，致造模成功。

模型組小鼠灌胃生理鹽水，灌胃體積為0.5mL·d-1；菌液組小鼠灌胃嗜酸乳桿菌菌液，菌濃度為1×108CFU·mL-1，體積為 0.5 mL·d-1；陽性藥組小鼠灌胃柳氮磺胺吡啶，將柳氮磺胺吡啶溶于生理鹽水，配制成 20mg·mL-1溶液，依體重給藥，終劑量為500mg·kg-1，時(shí)長為7天?？瞻捉M小鼠仍正常飼養(yǎng)。

2.2 潰瘍性結(jié)腸炎癥狀評(píng)估

每日稱量各組小鼠體重，并觀察小鼠的活動(dòng)情況、外觀變化、飲食情況、糞便性狀和便血情況，參照Liu W等[4]的方法，對(duì)小鼠進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）評(píng)分，標(biāo)準(zhǔn)為：①體重減輕（0，無減輕；1，減輕 1%～5%；2，減輕 6%～10%；3，減輕 10%～20%；4，減輕超過 20%）。②腹瀉（0，正常；2，稀便；4，水樣腹瀉）。③便血（0，無出血；2，輕微出血；4，大出血）。實(shí)驗(yàn)第8天采用頸椎脫臼法處死小鼠，解剖小鼠后取出結(jié)腸段，在冷PBS溶液中清洗后測量結(jié)腸長度。用剪刀剪取3～5 mm的結(jié)腸段落，置于4%多聚甲醛溶液固定24 h，進(jìn)行石蠟包埋后切片，厚4μm，HE染色，顯微鏡下觀察。

2.3 免疫組化法檢測結(jié)腸組織p-STAT3和IL-6表達(dá)

將結(jié)腸組織的石蠟切片在恒溫烘箱中于60℃下干燥1 h，在0.01 mol·L-1PBS溶液洗滌3次，每次5 min，用無水乙醇洗滌10 min，重蒸水洗滌兩次。將石蠟切片置于微波爐中，100℃保持8 min以進(jìn)行抗原修復(fù)。過氧化氫（3%）用于抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，封閉溶液用于阻斷非特異性抗原。將切片與抗p-STAT3和IL-6抗體在4℃下孵育過夜，然后與第二抗體孵育后進(jìn)行DAB染色。最后，將切片脫水、固定，在顯微鏡下觀察。

2.4 qRT-PCR檢測miR-214相關(guān)基因表達(dá)量

取小鼠結(jié)腸組織在無核酶條件下勻漿，加TRIZOL提取總RNA后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備cDNA，需在冰面上避光操作。以GAPDH為內(nèi)參基因，利用Ultra SYBR Mixture試劑盒進(jìn)行qRT-PCR。引物序列見表1。反應(yīng)體系為20μL?；虻谋磉_(dá)水平倍數(shù)用相對(duì)定量法，即2-ΔΔCt法計(jì)算。計(jì)算公式如下：

Ct2′為待測組目的基因平均Ct值；Ct1′為待測組內(nèi)參基因平均Ct值；Ct2為對(duì)照組目的基因平均Ct值；Ct1對(duì)照組內(nèi)參基因平均Ct值。

表1 qRT-PCR引物序列

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件GraphPad Prism5和SPSS19.0處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)。P＜0.05有顯著性差異。

3 結(jié) 果

3.1 潰瘍性結(jié)腸炎癥狀評(píng)估

在各組小鼠中，模型組小鼠體重嚴(yán)重下降，萎靡不振，毛發(fā)無光澤，實(shí)驗(yàn)第3天出現(xiàn)糞便稀軟、不成形，粘附于肛門周圍，第6天出現(xiàn)血便，證明造模成功。陽性藥組和菌液組小鼠各項(xiàng)癥狀均有明顯好轉(zhuǎn)，未出現(xiàn)嚴(yán)重血便?？瞻捉M體重穩(wěn)步增長，各項(xiàng)體征正常。

由圖1可見，模型組小鼠體重較空白組顯著下降（P＜0.01），陽性藥組和菌液組小鼠體重下降程度較模型組顯著減小（P＜0.05）。

由圖2可見，模型組小鼠DAI評(píng)分較空白組顯著增加（P＜0.01），而陽性藥組和菌液組小鼠DAI評(píng)分較模型組顯著降低（P＜0.01）。以上結(jié)果表明，嗜酸乳桿菌對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠UC有明顯的緩解作用。

由圖3可見，模型組小鼠結(jié)腸長度較空白組明顯縮短（P＜0.01），說明模型組小鼠有嚴(yán)重的潰瘍性結(jié)腸炎癥狀，而陽性藥組和菌液組小鼠結(jié)腸長度較模型組顯著增加（P＜0.01）。

圖1 4組體重變化曲線（n=10）

圖2 4組DAI評(píng)分（n=10）

圖3 4組結(jié)腸拍照的長度比較（n=10）

3.2 結(jié)腸組織病理學(xué)變化

結(jié)腸組織HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，由圖4可見空白組（A）小鼠結(jié)腸壁清晰，上皮完整，腺體排列整齊，隱窩正常，杯狀細(xì)胞豐富，無炎細(xì)胞浸潤。模型組（B）小鼠結(jié)腸上皮壞死脫落，腸壁變薄，腺體凌亂，潰瘍癥狀嚴(yán)重，黏膜肌層出現(xiàn)大量炎細(xì)胞浸潤。陽性藥組（C）和菌液組（D）小鼠結(jié)腸上皮潰瘍癥狀有明顯改善，無嚴(yán)重潰瘍癥狀。

圖4 4組結(jié)腸組織HE染色觀察（200×）

3.3 結(jié)腸組織IL-6、p-STAT3蛋白表達(dá)結(jié)果

通過免疫組化法對(duì)比IL-6、p-STAT3在各組小鼠結(jié)腸組織中的表達(dá)情況。由圖5可見，與空白組相比，在模型組中，IL-6和p-STAT3表達(dá)呈強(qiáng)陽性。與模型組相比，陽性藥組和菌液組表達(dá)呈弱陽性。

3.4 miR-214通路相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果

qRT-PCR檢測結(jié)果如圖6所示，與空白組比較，模型組 miR-214、IL-6、TNF-α 基因表達(dá)量明顯提高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組和菌液組miR-214、IL-6、TNF-α 表達(dá)量顯著降低 （P＜0.01）。與空白組比較，模型組PTEN、PDLIM2基因表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組和菌液組PTEN、PDLIM2 基因表達(dá)顯著提高（P＜0.01）。

4 討 論

本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠較空白組小鼠存在明顯的潰瘍性結(jié)腸炎癥狀，陽性藥組和菌液組小鼠體重變化等各項(xiàng)癥狀均顯著改善，結(jié)腸組織完整程度較好，已接近空白組。此前研究證明，益生菌具有免疫調(diào)節(jié)功能，改善黏膜上皮屏障功能和競爭性抑制致病菌在腸上皮的定植等[5，6]。因?yàn)橐嫔杞?jīng)胃后定植于腸道起作用，所以其對(duì)胃酸和膽鹽的抗性對(duì)發(fā)揮益生作用至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)采用篩選出的一株耐酸耐膽鹽抗性較好的嗜酸乳桿菌作為試驗(yàn)菌株，研究結(jié)果表明，嗜酸乳桿菌能夠?qū)SS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎有較好的保護(hù)作用。

圖5 免疫組化法檢測4組小鼠結(jié)腸IL-6和p-STAT3表達(dá)（100×）

圖6 4組qRT-PCR檢測結(jié)果（n=10）

潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中炎癥是重要原因，p-STAT3是一個(gè)標(biāo)志性的炎癥因子，磷酸化程度越高，則炎癥越明顯，IL-6可促進(jìn)p-STAT3磷酸化[7]。本研究通過免疫組化法測定小鼠結(jié)腸組織中IL-6和p-STAT3的表達(dá)，結(jié)果顯示，模型組表達(dá)水平最高，表明模型組產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，而陽性藥組和菌液組表達(dá)顯著減少，說明此兩組炎癥反應(yīng)較模型組輕。Farraye FA等[8]研究證明，UC患者機(jī)體內(nèi)miR-214的表達(dá)與UC發(fā)病程度呈顯著正相關(guān)。miR-214表達(dá)上調(diào)可抑制PTEN和PDLIM2的表達(dá)，進(jìn)而使核轉(zhuǎn)錄因子kappa B（nuclear factor-kappa B，NF-κB）和蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB）表達(dá)升高，導(dǎo)致下游促炎癥因子如IL-6、TNF-α等表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，模型組miR-214表達(dá)較空白組顯著上調(diào)，而PTEN和PDLIM2的表達(dá)則降低，炎癥因子IL-6、TNF-α表達(dá)升高，表明模型組miR-214及下游通路發(fā)生紊亂。而陽性藥組和菌液組則通過下調(diào)miR-214表達(dá)，解除其對(duì)PTEN和PDLIM2的抑制，改善了該通路紊亂的情況，最終使促炎因子IL-6、TNF-α表達(dá)降低，從而改善了炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究證明，嗜酸乳桿菌對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎具有較好的保護(hù)作用，并進(jìn)一步證明其作用機(jī)制是通過下調(diào)miR-214，從而改善下游通路紊亂，最終改善炎癥反應(yīng)，為使用嗜酸乳桿菌進(jìn)行潰瘍性結(jié)腸炎的臨床治療提供了依據(jù)。