白藜蘆醇抑制骨肉瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)研究

李國(guó)遠(yuǎn) 郭煜 羅正亮 郝永強(qiáng) 尚希福

骨肉瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)惡性骨腫瘤之一，以癌性成骨細(xì)胞分化和惡性類骨質(zhì)為特征，青少年時(shí)期發(fā)病率最高[1-2]。目前用于人類骨肉瘤治療的化療方案涉及多種化療劑的組合，如高劑量甲氨蝶呤與亞葉酸鈣、多柔比星，順鉑與異環(huán)磷酰胺、依托泊苷。雖然近幾十年來(lái)這些方案在骨肉瘤化療中發(fā)揮了重要作用，但尚無(wú)一種方法可以使生存率有重大改善[3-6]。此外，這些方案僅被證明在局部骨肉瘤治療中有效，而它們?cè)谵D(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性骨肉瘤治療中表現(xiàn)不佳[7-8]。

骨肉瘤的發(fā)展是復(fù)雜、多步驟、多因素的過(guò)程，其中腫瘤微環(huán)境和先天免疫系統(tǒng)的炎癥細(xì)胞釋放出許多因子如促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β等參與其中，這些因子均影響腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和腫瘤侵襲[9-11]。

在新型抗腫瘤藥物的研究中，生物活性天然產(chǎn)物已獲得了相當(dāng)多的研究關(guān)注。白藜蘆醇是源自葡萄等植物的中藥有效成分，可在各種類型癌癥治療中發(fā)揮作用[12-13]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇還可以在小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7中抑制干擾素(IFN)-γ或脂多糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)[14]。然而，迄今尚未闡明白藜蘆醇在骨肉瘤侵襲和遷移過(guò)程中的作用及其潛在作用機(jī)制，因此本研究擬初步探索白藜蘆醇對(duì)骨肉瘤的抗腫瘤作用及其潛在的生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞株：人骨肉瘤細(xì)胞系HOS、MG63、Saos2和U2OS購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院(中國(guó)上海)。

主要試劑：Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清、青霉素、鏈霉素(澳洲Hyclone公司)，0.25%胰蛋白酶/EDTA(美國(guó)Gibco公司)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)相關(guān)試劑盒(日本TaKaRa公司)，流式檢測(cè)試劑盒(廣州賽業(yè)生物科技有限公司)，CCK-8試劑盒(日本Dojindo公司)，Transwell小室(美國(guó)Costar公司)，Matrigel膠(美國(guó)BD Biosciences公司)，白藜蘆醇(R5010，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)。

主要儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱、低溫高速離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、ABI型快速實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)，光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio Tek公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人骨肉瘤細(xì)胞系HOS、MG63、Saos2和U2OS均在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，在37°C、5%二氧化碳(CO2)的濕潤(rùn)氣氛中培養(yǎng)。所有使用細(xì)胞均在20代內(nèi)。

1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞移出并懸浮在培養(yǎng)基中，將8 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板中，并在細(xì)胞黏附后用0、10、20、40 μmol/L濃度的白藜蘆醇處理。在白藜蘆醇處理24、48、72 h后，吸去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞，然后向每個(gè)孔中加入100 μL DMEM和10 μL CCK-8溶液，37°C孵育2.5 h。以經(jīng)0 μmol/L白藜蘆醇處理的細(xì)胞作為對(duì)照。使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

將骨肉瘤細(xì)胞以每孔2×105個(gè)接種于6孔板中，并用20 μmol/L白藜蘆醇處理，24 h后收獲。用冷PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次并離心。棄去上清液，將細(xì)胞重懸于膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液中。膜聯(lián)蛋白V-APC和碘化丙啶染色，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

在Transwell小室中將約1×105個(gè)細(xì)胞接種到涂有Matrigel膠(1∶3稀釋)的小室(直徑6.5 mm，孔徑8.0 μm)上，并保持在含有0.2%牛血清白蛋白(BSA)和DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，分別加入濃度為0、10、20或40 μmol/L的白藜蘆醇。將含有10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液加入下室中。在37°C、5%CO2氣氛中溫育32 h后，用PBS緩沖液洗滌小室，并用棉簽擦拭小室內(nèi)表面的細(xì)胞，遷移至室外的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，用0.1%結(jié)晶紫染色，并進(jìn)行顯微鏡檢查。細(xì)胞計(jì)數(shù)以200倍視野下隨機(jī)拍攝各組圖像的5個(gè)視野進(jìn)行平均計(jì)數(shù)。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞侵襲相關(guān)基因表達(dá)

將骨肉瘤細(xì)胞消化并重懸于培養(yǎng)基中，將1×106個(gè)細(xì)胞接種到6孔板中，并用濃度為0、10、20、40 μmol/L的白藜蘆醇處理72 h。使用AxyPrep Multisource Total RNA Miniprepkit分離總RNA。使用PrimeScript RT試劑盒將等量的RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。使用ABI 7500測(cè)序檢測(cè)系統(tǒng)和SYBR Premix Ex Taq進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以經(jīng)0 μmol/L白藜蘆醇處理的骨肉瘤細(xì)胞作為對(duì)照。循環(huán)條件為40個(gè)循環(huán)，95°C持續(xù)5 s，60°C持續(xù)34 s。引物序列見(jiàn)表1。

表1 定量引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用單因素方差分析(ANOVA)評(píng)估組內(nèi)數(shù)據(jù)整體差異的顯著性，各組間差異比較采用最小顯著性差異法(LSD)檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖及促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡

白藜蘆醇相對(duì)分子質(zhì)量為228.24，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。為研究白藜蘆醇對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的作用，使用CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞增殖和凋亡分析。用0、10、20和40 μmol/L濃度的白藜蘆醇處理HOS、MG63、Saos2及U2OS細(xì)胞，24、48、72 h后OD值見(jiàn)表2。所有細(xì)胞經(jīng)白藜蘆醇處理后增殖均受到抑制，且白藜蘆醇對(duì)HOS、MG63、Saos2和U2OS骨肉瘤細(xì)胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性(圖2)。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)白藜蘆醇具有促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的作用(下頁(yè)圖3)。

圖1 白藜蘆醇結(jié)構(gòu)示意圖

表2 經(jīng)白藜蘆醇處理后骨肉瘤細(xì)胞的OD值

*表示與對(duì)照組相比，P<0.05

2.2 抑制骨肉瘤細(xì)胞侵襲

進(jìn)行Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)經(jīng)不同濃度的白藜蘆醇處理后骨肉瘤細(xì)胞的侵襲能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白藜蘆醇以劑量依賴性的方式抑制HOS、MG63、Saos2和U2OS骨肉瘤細(xì)胞侵襲(下頁(yè)圖4)。

2.3 下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶基因表達(dá)

為探索白藜蘆醇抑制骨肉瘤細(xì)胞侵襲分子機(jī)制，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢查基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)基因表達(dá)的變化。用0、10、20和40 μmol/L濃度的白藜蘆醇處理HOS、MG63、Saos2及U2OS細(xì)胞后MMP1、MMP2及MMP9基因的相對(duì)表達(dá)水平見(jiàn)下頁(yè)表3。這提示經(jīng)白藜蘆醇處理后HOS、MG63、Saos2和U2OS骨肉瘤細(xì)胞中MMP1、MMP2和MMP9的基因表達(dá)水平以劑量依賴性的方式降低(下頁(yè)圖5)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MMP1、MMP2和MMP9是白藜蘆醇抑制骨肉瘤細(xì)胞侵襲的作用靶點(diǎn)。

圖3 白藜蘆醇促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡

圖4 白藜蘆醇以劑量依賴性方式抑制骨肉瘤細(xì)胞侵襲

3 討論

骨肉瘤是一組異質(zhì)性惡性腫瘤，其特征在于存在不同程度的間充質(zhì)分化。目前骨肉瘤臨床治療面臨兩大挑戰(zhàn)。首先，盡管手術(shù)前后化療可以提高5年生存率，但與化療相關(guān)的毒性反應(yīng)和不良反應(yīng)可能會(huì)顯著降低患者生活質(zhì)量[15-16]。其次，骨肉瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率很高，這是大多數(shù)骨肉瘤患者預(yù)后不佳的主要原因[17]。骨肉瘤早期極易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，90%轉(zhuǎn)移累及肺臟，在臨床診斷明確時(shí)多已成為高等級(jí)的惡性腫瘤[18]。早期發(fā)生轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致骨肉瘤預(yù)后差的重要因素，存在腫瘤轉(zhuǎn)移的患者遠(yuǎn)期生存率僅為10%～30%。其他與預(yù)后相關(guān)的因素包括原發(fā)腫瘤部位與大小、早期手術(shù)干預(yù)效果及對(duì)化療的敏感性等。隨著對(duì)骨肉瘤發(fā)生發(fā)展認(rèn)識(shí)的不斷深入，其轉(zhuǎn)移及侵襲機(jī)制也逐漸成為研究熱點(diǎn)。因此，探索調(diào)控骨肉瘤轉(zhuǎn)移及侵襲的信號(hào)靶點(diǎn)，并以此進(jìn)行針對(duì)性干預(yù)，確定毒性較小且更有效的治療方案，將有望提高骨肉瘤的臨床療效及預(yù)后。目前越來(lái)越多的注意力集中在天然產(chǎn)物在骨肉瘤治療中的應(yīng)用。

表3 經(jīng)白藜蘆醇處理后骨肉瘤細(xì)胞MMP1、MMP2及MMP9基因表達(dá)

*表示與對(duì)照組相比，P<0.05

白藜蘆醇是從植物中提純的生物活性成分之一，是一種多酚化合物，是植物為抵抗外界刺激如紫外線、真菌、病毒感染或機(jī)械損傷而產(chǎn)生的植物抗毒素。目前進(jìn)行的腫瘤治療研究明確了白藜蘆醇的藥理作用，如可抑制脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷炎癥[19]。白藜蘆醇通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)抑制肝臟惡性腫瘤生長(zhǎng)[20]。因此，白藜蘆醇可能是治療炎癥和腫瘤的潛在有效選擇。然而，白藜蘆醇在影響骨肉瘤侵襲中的功能和潛在機(jī)制至今尚未闡明。

我們的研究目的是探索白藜蘆醇是否具有抗人類骨肉瘤活性的能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白藜蘆醇以劑量依賴性方式抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制包括抗氧化活性、清除自由基、抑制DNA合成、阻滯細(xì)胞周期并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[21]。白藜蘆醇的這些干預(yù)作用可能與活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved caspase-3)上調(diào)相關(guān)。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)在細(xì)胞凋亡中起著不可替代的作用。caspase-3可被多種因子激活，是細(xì)胞凋亡過(guò)程中主要的末端剪切酶[22-23]。白藜蘆醇促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的具體作用機(jī)制有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索。

由于轉(zhuǎn)移是骨肉瘤治療中的挑戰(zhàn)之一，我們還觀察了白藜蘆醇對(duì)骨肉瘤細(xì)胞侵襲的作用。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可有效抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲，可能在骨肉瘤治療中具有抑制其轉(zhuǎn)移的能力。此外，通過(guò)對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在白藜蘆醇作用下MMP1、MMP2和MMP9基因表達(dá)受到明顯抑制。MMP1、MMP2和MMP9基因在骨肉瘤轉(zhuǎn)移中非常重要[24-25]，它們可能是白藜蘆醇作用于骨肉瘤細(xì)胞的靶點(diǎn)，但確切的作用機(jī)制有待今后的深入研究。