卡介菌-多糖核酸對(duì)哮喘小鼠淋巴細(xì)胞CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響

姜華 賴克方 南巖東 金發(fā)光

1空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,西安710038;2廣州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 廣州呼吸健康研究院510120

卡介菌多糖核酸 (bacillus calmette-guerin polysaccharide nucleotide,BCG-PSN)是BCG經(jīng)過滅活后制成的一種免疫制劑,具有多種免疫活性[1-2],通過動(dòng)物模型及臨床觀察均證實(shí)其對(duì)支氣管哮喘 (哮喘)有一定的防治作用[3-5],但其具體作用機(jī)制尚不清楚。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+Treg)具有免疫無能性和免疫抑制性的一類細(xì)胞,尤其是CD4+CD25+foxp3+T細(xì)胞與哮喘誘導(dǎo)免疫耐受密切相關(guān)[6],本研究通過觀察BCG-PSN對(duì)哮喘小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量及功能的影響,為其防治哮喘提供詳實(shí)的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 Balb/c小鼠 (購自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)5～6周齡,體質(zhì)量16～18 g,雌性。飼養(yǎng)在廣州呼吸疾病研究所SPF級(jí)動(dòng)物房。卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品,佐劑Al(OH)3為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。BCG-PSN購自醫(yī)院藥房 (國(guó)藥準(zhǔn)字92S020100,中國(guó)湖南斯奇生物制藥有限公司生產(chǎn))。小鼠有創(chuàng)肺功能儀為美國(guó)Buxco公司產(chǎn)品。

1.2 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清FCS均購自GIBCO公司,EZ-SepTMMouse 1×淋巴細(xì)胞分離液購自深圳達(dá)科為公司,FITC標(biāo)記的抗CD4抗體、PE標(biāo)記的抗CD25抗體、PE-cy5標(biāo)記的抗foxp3抗體、PE標(biāo)記的抗CTLA-4抗體及同型對(duì)照均購自美國(guó)eBioscience公司,IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β (transforming growth factor-β,TGF-β)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購自德國(guó)Bender公司,Trizol抽提試劑購自美國(guó)Invitrogen公司,real-time試劑盒 (DDR037,DDR041)購自日本Takara公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物致敏、激發(fā) 研究分為對(duì)照組、哮喘組和BCG-PSN干預(yù)組。每組各10只小鼠,以O(shè)VA首次致敏為第0天,在第0、7、14天時(shí)腹腔注射OVA(0.01%OVA,0.2 ml/只)致敏,第28、29、30天給予OVA(0.4%OVA,50μl/只)滴鼻激發(fā),1次/d。正常組在每次給藥時(shí)間點(diǎn)給予相應(yīng)劑量的生理鹽水。BCG-PSN干預(yù)劑量為20μg/只,體積為60μl,首次致敏前7 d腹腔注射干預(yù),動(dòng)物造模干預(yù)流程見圖1。

1.3.2 氣道反應(yīng)性檢測(cè) 氣道反應(yīng)性檢測(cè)各組在末次激發(fā)后48 h,用美國(guó)Buxco公司的有創(chuàng)氣道阻力與肺順應(yīng)性檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)小鼠的肺阻力 (lung resistance,RL),測(cè)定10μl倍增濃度的乙酰甲膽堿 (methacholine,Mch)霧化激發(fā)后RL的變化,激發(fā)濃度由低到高,依次為0、3.12、6.25、12.50、25.00和50.00 g/L,記錄各濃度級(jí)Mch激發(fā)下的RL平均值。當(dāng)前激發(fā)濃度肺阻力/生理鹽水時(shí)肺阻力的比值 (RL/NS)作為小鼠氣道反應(yīng)性的評(píng)價(jià)指標(biāo)。Han 等[7]報(bào)道,本研究評(píng)價(jià)氣道反應(yīng)性包括以下兩個(gè)方面：(1)與哮喘組相比可以顯著降低氣道反應(yīng)性 (P＜0.05)的激發(fā)濃度;(2)氣道反應(yīng)性升高為基值2 倍時(shí)的 Mch 激發(fā)濃度,值越小,氣道敏感性越高。

圖1 研究中動(dòng)物致敏、激發(fā)、BCG-PSN 干預(yù)流程

1.3.3 BALF 中EOS%分析 在實(shí)驗(yàn)流程第32天,小鼠行氣道反應(yīng)性檢測(cè)后麻醉,仰臥位,行氣管插管,以0.8 ml PBS灌洗3次,回收率在80%以上。4℃,1 500×g離心10 min,沉淀涂片并行HE染色,連續(xù)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞并計(jì)其中EOS的個(gè)數(shù),計(jì)算EOS百分比。

1.3.4 小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液的制備 小鼠無菌取脾,在60 mm 培養(yǎng)皿中加入3 ml EZ-SepTMMouse 1×淋巴細(xì)胞分離液,按照說明書制備脾臟淋巴細(xì)胞懸液,加入RPMI1640 培養(yǎng)液,臺(tái)盼藍(lán)染色證實(shí)活細(xì)胞＞95%,計(jì)數(shù)約為2×107/ml,37 ℃,5%CO2孵箱孵育72 h。

1.3.5 ELISA 檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞懸液CD4+CD25+Treg細(xì)胞/CD4+T 細(xì)胞比例 取上述懸液200μl(細(xì)胞總數(shù)約1×106個(gè)),加入 CD4-FITC 及CD25-PE 同型對(duì)照及抗體,室溫,避光孵育30 min,加入2 ml 1×PBS,重懸混勻,2 000×g離心10 min,4℃避光孵育30 min,洗滌后緩沖液重懸細(xì)胞后ELISA 上機(jī)檢測(cè)。

1.3.6 Realtime-PCR 檢測(cè) 脾臟淋巴細(xì)胞中foxp3 m RNA 及CTLA-4 mRNA 的表達(dá) 取前述所得脾淋巴細(xì)胞,按照Trizol說明書提取RNA,稀釋50倍后經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)260 nm OD 值,計(jì)算RNA 濃度,按照說明書采用一步法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),獲得cDNA,以此為模板進(jìn)行real-time-PCR 反應(yīng),各個(gè)反應(yīng)物引物：按參考文獻(xiàn) [8-9],foxp3 上 游 引 物：5'-CCCAGGAAAGACAGCAACCTT-3',下游引物：5'-TTCTCACAACCAGGCCACTTG-3';CTLA-4 上游引物：5'-GGGCTGGGTCTTTACACTCATTTT-3',下游引物：5'-CTTCCTGTGGCATTAACTTTGTGT-3'。 反應(yīng)體系：以94 ℃ 10 min,94 ℃ 15 s,56 ℃ 20 s,72 ℃15 s的方式循環(huán)45次,最后55 ℃記錄熔解曲線,采用2ΔCt方法計(jì)算foxp3、CTLA-4 基因的表達(dá)水平。

1.3.7 ELISA 檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞上清液中IL-10和TGF-β的含量 具體操作見相應(yīng)說明書。

2 結(jié)果

2.1 氣道反應(yīng)性

2.1.1 RL/NS 哮喘組在 Mch 各個(gè)激發(fā)濃度3.12、6.25、12.50、25.00和50.00 g/L RL/NS均明顯高于正常組,說明該模型小鼠具備氣道高反應(yīng)性,BCG-PSN干預(yù)組在 Mch 激發(fā)濃度為3.12、6.25、12.50 g/L時(shí)可顯著降低RL/NS,見圖2、表1。

圖2 BCG-PSN 腹腔注射干預(yù)對(duì)哮喘小鼠RL/NS的影響

2.1.2 氣道反應(yīng)性升高為基值2倍時(shí)的Mch激發(fā)濃度 正常組明顯高于哮喘組,說明造模小鼠氣道敏感性高,BCG-PSN 干預(yù)組 Mch 激發(fā)濃度為(12.61±5.33)g/L,與哮喘組 (7.73±2.69)g/L相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01),見圖3。

表1 BCG-PSN 腹腔注射干預(yù)對(duì)哮喘小鼠RL/NS的影響 (g/L,±s)

表1 BCG-PSN 腹腔注射干預(yù)對(duì)哮喘小鼠RL/NS的影響 (g/L,±s)

注：RL/NS為當(dāng)前激發(fā)濃度肺阻力與生理鹽水激發(fā)時(shí)肺阻力的比值;Mch為乙酰甲膽堿;BCG-PSN 為卡介菌多糖核酸;與哮喘組比較,a P ＜0.05

組別 鼠數(shù)Mch激發(fā)濃度3.12 6.25 12.50 25.00 50.00正常組 10 119.34±8.45a 148.10±17.56a 186.54±21.96a 309.06±72.26a 447.84±70.21a哮喘組 10 199.76±29.13 259.10±35.91 373.24±71.56 497.24±153.68 576.24±153.57 BCG-PSN 干預(yù)組 10 136.44±12.73a 212.59±26.56a 280.26±45.11a 411.94±68.56 542.89±81.30

圖3 各組氣道反應(yīng)性升高為基值2倍時(shí)的Mch激發(fā)濃度

2.1.3 氣道炎癥 哮喘小鼠BALF中EOS(47.61±6.91)%,明顯高于正常組 (0.19±0.03)%,說明造模小鼠具備高EOS 為特征的氣道炎癥。BCGPSN 干預(yù)組BALF中EOS占 (36.28±10.01)%,與哮喘組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01),見圖4。

圖4 BCG-PSN 對(duì)哮喘小鼠BALF中EOS%的影響

2.1.4 BCG-PSN 對(duì)哮喘小鼠脾臟淋巴細(xì)胞CD4+CD25+Treg 細(xì)胞數(shù)量的影響 哮喘組CD4+CD25+Treg 細(xì) 胞/CD4+T 細(xì) 胞 比 例 (3.71±2.19)%明顯低于正常組 (6.44±1.16)% (P＜0.01),BCG-PSN 干預(yù)組為 (6.75±1.63)%與哮喘組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01),見圖5。

圖5 BCG-PSN 對(duì)哮喘小鼠脾臟淋巴細(xì)胞CD4+CD25+Treg細(xì)胞/CD4+細(xì)胞比例的影響

2.1.5 BCG-PSN 對(duì)哮喘小鼠脾臟淋巴細(xì)胞foxp3 m RNA 及 CTLA m RNA 的 影響

2.1.5.1 哮喘組foxp3 m RNA 及CTLA m RNA的相對(duì)表達(dá)量 哮喘組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞foxp3 m RNA 的表達(dá)量?jī)H為正常組的 (0.23±0.21)倍,而CTLA-4m RNA 的表達(dá)量為正常組 (0.65±0.31)倍,提示哮喘組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞foxp3 m RNA 及CTLA m RNA 表達(dá)明顯降低,見圖6。

2.1.5.2 BCG-PSN 干預(yù)對(duì)哮喘小鼠脾臟淋巴細(xì)胞foxp3 m RNA、CTLA-4 mRNA 的影響 BCGPSN 干預(yù)組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞foxp3 m RNA 表達(dá)量是哮喘組的 (1.82±0.76)倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05),CTLA-4 m RNA 表達(dá)量是哮喘組的 (1.66±0.57)倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05),見圖7。

2.1.6 BCG-PSN 干預(yù)對(duì)哮喘小鼠脾淋巴細(xì)胞上清液IL-10、TGF-β的影響 哮喘小鼠脾臟淋巴細(xì)胞上清中IL-10、TGF-β 的含量明顯少于正常組。BCG-PSN組IL-10含量為 (210.32±88.23)ng/L,顯著高于哮喘組 (114.41±73.58)ng/L (P＜0.05)。BCG-PSN 組 TGF-β 含量 為 (487.66±32.57)ng/L, 顯著高于哮喘組(97.76 ±23.58)ng/L (P＜0.01),見表2。

圖6 哮喘組與正常組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞Foxp3 mRNA 及CTLA-4 mRNA 的表達(dá)

圖7 BCG-PSN 干預(yù)對(duì)哮喘小鼠脾臟淋巴細(xì)胞foxp3 m RNA (A)、CTLA-4 m RNA (B)的影響

表2 BCG-PSN 干預(yù)對(duì)哮喘小鼠IL-10及TGF-β的影響 (ng/L,±s)

表2 BCG-PSN 干預(yù)對(duì)哮喘小鼠IL-10及TGF-β的影響 (ng/L,±s)

注：BCG-PSN 為卡介菌多糖核酸;TGF-β為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β;與哮喘組比較,a P ＜0.05,b P ＜0.01

組別 鼠數(shù) IL-10 TGF-β正常組 10 218.91±53.91a 549.66±261.41b哮喘組 10 114.41±73.58 97.76±23.58 BCG-PSN 干預(yù)組 10 210.32±88.23a 487.66±32.57b

3 討論

哮喘是由多種細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病,以氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥為重要特征,可自然緩解或經(jīng)治療后緩解,發(fā)病率呈增高趨勢(shì)[10-12]。2006年亞太哮喘見解與現(xiàn)實(shí)第2 階段調(diào)查結(jié)果顯示,亞太地區(qū)哮喘患者只有2.5%達(dá)到哮喘控制[13],CD4+CD25+Treg 細(xì)胞是一種具有免疫抑制及免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞,具有獨(dú)特的作用方式和功能特征,有可能在哮喘等變態(tài)反應(yīng)性疾病和一些自身免疫性疾病的發(fā)病中起重要作用[14-15],大量動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)BCG[16-19]通過CD4+CD25+Treg細(xì)胞防治哮喘,但完整的BCG 因其成分復(fù)雜,且副作用大,無法直接用于臨床,BCG-PSN 是BCG經(jīng)熱酚法去除蛋白后提取BCG-PSN,配以滅菌生理鹽水制成的以多糖成分為主的一種非特異免疫調(diào)節(jié)劑,多個(gè)研究[2-5]證實(shí)其對(duì)哮喘有保護(hù)作用,但具體作用機(jī)制仍未明確。

通過研究證實(shí)哮喘小鼠CD4+CD25+T 細(xì)胞數(shù)量明顯低于正常組,說明哮喘小鼠體內(nèi)的CD4+CD25+Treg 的確存在數(shù)量上的缺陷,Fontenot等[20]發(fā)現(xiàn),高表達(dá)foxp3 的轉(zhuǎn)基因小鼠CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量明顯增加,foxp3敲除小鼠活化的CD4+細(xì)胞增多,卻缺乏獨(dú)立的CD4+CD25+Treg細(xì)胞,因而導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生,此后多個(gè)研究[21-22]表明foxp3 是調(diào)控CD4+CD25+Treg細(xì)胞發(fā)育及啟動(dòng)抑制功能的關(guān)鍵因子。通過real-time-PCR 測(cè)定了哮喘小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中foxp3基因的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)僅為正常組的23%左右,提示哮喘小鼠體內(nèi)還存在著CD4+CD25+Treg的功能缺陷。BCG-PSN 干預(yù)可明顯提高CD4+CD25+Treg 細(xì)胞/CD4+T 細(xì)胞比例,上調(diào)哮喘小鼠foxp3 m RNA 的表達(dá)水平。因此說明BCG-PSN 干預(yù)顯著增加CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量和功能。

CD4+CD25+Treg細(xì)胞可通過CTLA-4介導(dǎo)的細(xì)胞接觸依賴機(jī)制發(fā)揮其免疫抑制功能,從而阻止哮喘的發(fā)生。CTLA-4是CD4+CD25+Treg細(xì)胞上膜分子,是T 細(xì)胞活化所需的協(xié)同刺激分子CD28的同源異構(gòu)體,CTLA-4對(duì)效應(yīng)性T 細(xì)胞的B7-1分子的親和力比CD28更強(qiáng),抑制效應(yīng)性T 細(xì)胞的增殖和活化,從而調(diào)節(jié)哮喘等疾病的免疫失衡[23-24]。說明CTLA-4對(duì)于誘導(dǎo)CD4+CD25+Treg細(xì)胞的抑制功能是十分重要的;研究結(jié)果顯示哮喘組CTLA-4m RNA 的水平為正常組的65%左右,說明哮喘小鼠存在CTLA-4mRNA 低表達(dá),而BCG-PSN 干預(yù)組的CTLA-4m RNA 表達(dá)水平與哮喘組相比明顯增高,說明BCG-PSN 可上調(diào)CTLA-4m RNA 的表達(dá),并通過CTLA-4 介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞接觸抑制從而對(duì)哮喘小鼠產(chǎn)生保護(hù)作用。

此外CD4+CD25+Treg細(xì)胞也可通過分泌細(xì)胞因子 (IL-10、TGF-β)而介導(dǎo)抑制效應(yīng)[25]。研究顯示哮喘組中IL-10及TGF-β的分泌水平明顯低于正常組,BCG-PSN 干預(yù)組的IL-10及TGF-β的分泌水平明顯高于哮喘組,說明BCG-PSN 可能通過分泌抑制性細(xì)胞因此IL-10 及TGF-β從而產(chǎn)生對(duì)哮喘小鼠的保護(hù)作用。同時(shí),除了CD4+CD25+Treg細(xì)胞外,機(jī)體內(nèi)還存在著一類能分泌IL-10的Tr1 (抑制由Th1介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)的T 細(xì)胞)[26]和能分泌TGF-β的Th3[27]。因此,本實(shí)驗(yàn)IL-10和TGF-β可能是多來源的,提示可能BCG-PSN 還可通過其他機(jī)制如樹突狀細(xì)胞、Tr1、Th3等發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

綜上所述,BCG-PSN 干預(yù)可增加哮喘小鼠CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量及功能,具體可能通過促進(jìn)IL-10、TGF-β等抑制性細(xì)胞因子的分泌及CTLA-4介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞接觸抑制機(jī)制誘導(dǎo)免疫耐受,從而降低哮喘小鼠的氣道反應(yīng)性和氣道炎癥。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突