X線全身照射對(duì)2型糖尿病KKAy小鼠造血免疫系統(tǒng)功能的影響

黨女，盧延華，管博文，蘇路路，李程程，榮利，王小春, 孟愛(ài)民*

(1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)人類(lèi)疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市人類(lèi)重大疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型工程技術(shù)研究中心， 北京 100021；2. 北京市化工職業(yè)病防治院， 北京 100176)

目前，全球范圍內(nèi)糖尿病和惡性腫瘤的發(fā)病率正逐年增加。2013年的調(diào)查研究顯示，中國(guó)罹患糖尿病的成年人預(yù)計(jì)達(dá)11.6%，有50.1%的人處于糖尿病前期[1]。流行病學(xué)顯示，糖尿病與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[2-3]，糖尿病患者的惡性腫瘤發(fā)生率明顯高于非糖尿病患者。隨著老齡化的到來(lái)，惡性腫瘤患者合并糖尿病者增多，其治療問(wèn)題不容忽視。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)腫瘤的治療，主要是手術(shù)、放療、化療以及分子靶向治療等手段。放化療是惡性腫瘤的常規(guī)治療，其殺滅癌細(xì)胞的同時(shí)會(huì)損害正常組織細(xì)胞的功能，誘發(fā)胃腸道反應(yīng)，骨髓抑制和造血系統(tǒng)損傷等毒副反應(yīng)，導(dǎo)致患者難以接受進(jìn)一步的治療[4]。近年來(lái)，在小鼠，大鼠和人類(lèi)中的研究表明，糖尿病可導(dǎo)致骨髓微環(huán)境受損，如微血管病變、神經(jīng)末梢病變和干細(xì)胞動(dòng)員受損等[5-6]。糖尿病可能破壞骨髓的結(jié)構(gòu)與功能，使未成熟的細(xì)胞進(jìn)入血液，可能損害造血干細(xì)胞的潛能。糖尿病患者本身處于“慢性低水平炎癥”的狀態(tài)[7]，骨髓微環(huán)境受損，對(duì)放化療的敏感性和耐受性可能會(huì)發(fā)生變化。

KKAy小鼠是自發(fā)性2型糖尿病動(dòng)物模型，具有高血糖、糖耐量受損、高胰島素血癥、肥胖和高脂血癥等臨床表現(xiàn)。8周齡時(shí)血糖水平顯著升高[8]，且KKAy小鼠的實(shí)驗(yàn)多采用C57小鼠作為對(duì)照[9]。本研究擬建立KKAy小鼠的輻射損傷模型，與健康對(duì)照C57小鼠比較，觀察骨髓、胸腺和脾等組織功能細(xì)胞比例的變化，比較造血免疫系統(tǒng)損傷的差異，為臨床相應(yīng)情況安全用藥提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠20只，體重25～30 g，10～12周齡；SPF級(jí)雄性KK/upj-Ay/J小鼠20只，體重28～35 g，10～12周齡，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供【SCXK(京)2014-0004】。小鼠飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所屏障環(huán)境動(dòng)物房【SYXK(京)2015-0035】。飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各半交替，濕度恒定，溫度20～25℃。實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)(IACUC號(hào)：MAM18002)。

1.1.2 主要試劑及儀器

流式細(xì)胞術(shù)所需抗體Biotin-CD45R(B220)、Biotin-Ly-6G/Ly-6C、Biotin-TER-119、Biotin-CD4、Biotin-CD8a、Biotin-CD11b、PE-Sca-1、APC-c-Kit(CD117)、FITC-CD34、APC-CD3、PE-CD8a、PE-Ter119、FITC-Gr-1、APC-CD11b抗體購(gòu)于eBioscience公司；PerCP-Cy5.5-Streptavidin、PE-B220、PerCP-CD4抗體購(gòu)于BD Biosciences公司。甲基纖維素半固體培養(yǎng)基MethoCult GF(M3534)購(gòu)自STEMCELL公司。

X線輻照儀(Precision X-ray，X-RAD 225，美國(guó))，流式細(xì)胞儀(BD Biosciences，BD FACS Aria TM II，美國(guó))，全自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Horiba，ABX Pentra DX 120，法國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

為檢測(cè)電離輻射對(duì)健康小鼠和2型糖尿病小鼠的造血免疫系統(tǒng)的損傷作用，將C57BL/6J小鼠分為對(duì)照組(C57組)和照射組(C57 TBI組)，KK/upj-Ay/J小鼠分為對(duì)照組(KKAy組)和照射組(KKAy TBI組)。照射組小鼠用X線全身照射(total body irradiation，TBI)，劑量4 Gy，劑量率：0.95 Gy/ min。照射15 d后取材，檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。

1.2.2 外周血血常規(guī)檢測(cè)

照射15 d后，小鼠眶靜脈叢取外周血(大于0.5 mL)，加入使用EDTAK3抗凝的EP管里，用全自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血小板(PLT)、血紅蛋白(HGB)和淋巴細(xì)胞比率(LYM%)等指標(biāo)。

1.2.3 造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞比例測(cè)定

分離的骨髓細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度到5×107/mL，每只小鼠取100 μL用于后續(xù)染色。按體積比1∶50加入biotin標(biāo)記的CD45R(B220)、Ly-6G/Ly-6C、TER-119、CD4、CD8a、CD11b抗體，4℃避光孵育30 min，PBS洗滌一次(1500 r/ min離心5 min)。離心后棄去上清，加入100 μL PBS重懸，加入混合二抗：PerCP-cy5.5標(biāo)記的streptavidin、PE標(biāo)記的Sca-1、APC標(biāo)記的c-Kit(CD117)、FITC標(biāo)記的CD34。4℃避光孵育1 h，PBS洗滌一次。離心后棄上清，加入300 μL PBS重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)造血祖細(xì)胞(HPC， Lin-Sca-1+c-Kit-)、造血干細(xì)胞(HSC， Lin-Sca-1+c-Kit+)、長(zhǎng)期造血干細(xì)胞(LT-HSC， CD34-Lin-Sca-1+c-Kit-)在骨髓有核細(xì)胞(bone marrow mononuclear cells，BMNCs)中所占的比例。

1.2.4 粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落形成單位測(cè)定(colony forming unit-granulocyte and macrophage assay, CFU-GM)

參考本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)表文獻(xiàn)[10]，無(wú)菌取小鼠骨髓細(xì)胞，用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度到4×105/mL，每組小鼠取0.2 mL 細(xì)胞加入到2 mL M3534培養(yǎng)基中，混合均勻后，加入到24孔板，每孔0.5 mL。將培養(yǎng)板置于37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)7 d后用顯微鏡觀察，計(jì)數(shù)粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落，以檢測(cè)小鼠造血祖細(xì)胞分化為粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的能力。

1.2.5 脾淋巴細(xì)胞分型測(cè)定

分離的脾細(xì)胞，加入裂紅液裂解紅細(xì)胞后得到細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度到1×107/mL，每只小鼠取100 μL用于后續(xù)染色。加入PE標(biāo)記的B220、APC標(biāo)記的CD3、PerCP標(biāo)記的CD4混合抗體，4℃避光孵育30 min，PBS洗滌一次(1500 r/min離心5 min)。離心后棄上清，加入300 μL PBS重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)B細(xì)胞(B220+)、T細(xì)胞(CD3+)、CD4+T 細(xì)胞(CD4+CD3+)的比例。

1.2.6 胸腺淋巴細(xì)胞分型測(cè)定

分離的胸腺細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度到1×107/mL，每只小鼠取100 μL用于后續(xù)染色。加入PerCP標(biāo)記的CD4、PE標(biāo)記的CD8混合抗體，4℃避光孵育30 min，PBS洗滌一次。離心后棄上清，加入300 μL PBS重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4CD8雙陽(yáng)性T細(xì)胞(CD4+CD8+)、CD4單陽(yáng)性T細(xì)胞(CD4+CD8-)、CD8單陽(yáng)性T細(xì)胞(CD4-CD8+)的比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 全身照射對(duì)小鼠外周血常規(guī)的影響

為檢測(cè)輻射對(duì)C57和KKAy小鼠造血系統(tǒng)的影響，4 Gy照射15 d后，檢測(cè)小鼠的外周血計(jì)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖1。照射前，KKAy小鼠的LYM%顯著低于C57小鼠，(84.80±3.55)% vs (92.18±1.18)%，P< 0.01(圖1E)，其余指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與對(duì)照組小鼠相比，4 Gy全身照射后，C57小鼠的WBC、RBC、HGB、PLT及LYM%均顯著降低。同時(shí)，與對(duì)照組小鼠相比，照射后KKAy小鼠的WBC、RBC及PLT均顯著降低，而HGB和LYM%有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其中，照射后KKAy小鼠的RBC和HGB的下降幅度明顯低于C57小鼠，分別為(12.17±6.18)% vs (30.63±5.21)%、(8.78±5.76)% vs (29.66±4.78)%。以上結(jié)果表明：C57小鼠和KKAy的LYM%可能存在差異，4 Gy全身照射可降低C57和KKAy小鼠的WBC、RBC、HGB、PLT和LYM%，而KKAy小鼠在RBC和HGB這兩項(xiàng)指標(biāo)上表現(xiàn)出對(duì)電離輻射較強(qiáng)的耐受性。

2.2 全身照射對(duì)小鼠造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞比例的影響

為探究輻射對(duì)小鼠造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞比例的影響，小鼠照射后15 d后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠的骨髓細(xì)胞。參考已發(fā)表文獻(xiàn)[11]，流式細(xì)胞儀分析時(shí)門(mén)的設(shè)置如圖2所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，照射前，KKAy小鼠的HSC和LT-HSC的比例顯著低于C57小鼠(圖3B，3C)。4 Gy全身照射后C57小鼠的HPC、HSC、LT-HSC的比例顯著下降；KKAy小鼠的HPC的比例明顯下降，但HSC和LT-HSC有下降趨勢(shì)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。KKAy小鼠，照射后HSC和LT-HSC的下降幅度則顯著低于C57小鼠，分別為(29.49±13.86)% vs (62.48±5.77)%、(35.74±3.60)% vs (79.82±4.21)%。以上結(jié)果表明，C57小鼠和KKAy小鼠的HSC和LT-HSC比例可能存在差異，4 Gy輻射暴露降低C57和KKAy小鼠的HPC、HSC和LT-HSC的比例，而KKAy小鼠反而表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性。

注：與對(duì)照組相比，*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001。(下圖同)圖1 全身照射對(duì)C57和KKAy小鼠外周血常規(guī)的影響Note．Compared with the control group, *P< 0.05, **P< 0.01,***P< 0.001.(The same in the following figures)Figure 1 Effect of X-ray whole-body irradiation on the peripheral blood routine test of C57 and KKAy mice

圖2 流式細(xì)胞儀分析時(shí)門(mén)的設(shè)置Figure 2 Gate setting of the flow cytometry analysis

圖3 全身照射對(duì)C57和KKAy小鼠HPC、HSC和LT-HSC比例的影響Figure 3 Effect of whole-body irradiation on the percentages of mouse HPC, HSC and LT-HSC

2.3 全身照射對(duì)小鼠CFU-GM的影響

檢測(cè)粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落形成能力(CFU-GM)，以評(píng)價(jià)小鼠造血祖細(xì)胞的增殖能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，照射前，C57和KKAy的CFU-GM數(shù)目沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；4 Gy全身照射后，與對(duì)照組相比，C57小鼠和KKAy小鼠的CFU-GM數(shù)目明顯降低。KKAy小鼠與C57小鼠的降低幅度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，(64.71±11.15)% vs (62.93±7.00)%，P> 0.05。以上結(jié)果表明：4 Gy輻射暴露可顯著降低C57和KKAy小鼠的CFU-GM數(shù)目，但照射前后，兩者的造血祖細(xì)胞功能均沒(méi)有表現(xiàn)出差異。

圖4 全身照射對(duì)C57和KKAy小鼠CFU-GM的影響Figure 4 Effect of whole-body irradiation on CFU-GM of the C57 and KKAy mice

2.4 全身照射對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞比例的影響

為了檢測(cè)輻射對(duì)小鼠脾免疫細(xì)胞的影響，我們檢測(cè)了脾中B細(xì)胞、T細(xì)胞以及CD4+T細(xì)胞的比例。結(jié)果如圖5所示。照射前，KKAy小鼠與C57小鼠相比，B細(xì)胞、T細(xì)胞以及CD4+T細(xì)胞的比例均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4 Gy照射后，與對(duì)照組相比，C57小鼠和KKAy小鼠的B細(xì)胞、T細(xì)胞以及CD4+T細(xì)胞的比例均顯著降低。KKAy小鼠與C57小鼠相比，B細(xì)胞、T細(xì)胞以及CD4+T細(xì)胞的下降幅度的比例均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果表明：4 Gy輻射暴露可顯著降低C57和KKAy小鼠脾中B細(xì)胞、T細(xì)胞以及CD4+T細(xì)胞的比例，但照射前后，兩者的脾免疫細(xì)胞比例沒(méi)有表現(xiàn)出差異。

2.5 全身照射對(duì)小鼠胸腺免疫細(xì)胞比例的影響

為了檢測(cè)輻射對(duì)小鼠胸腺免疫細(xì)胞的影響，我們檢測(cè)了胸腺中CD4CD8雙陽(yáng)性T細(xì)胞、CD4單陽(yáng)性T細(xì)胞及CD8單陽(yáng)性T細(xì)胞的比例。結(jié)果如圖6所示。照射前，KKAy小鼠的CD8單陽(yáng)性T細(xì)胞的比例顯著低于C57小鼠，(2.92 ± 0.51)% vs (4.34 ± 1.10)%，P< 0.05，如圖6C所示)。4 Gy照射后，與對(duì)照組相比，C57小鼠的CD4CD8雙陽(yáng)性T細(xì)胞的比例顯著降低，CD4單陽(yáng)性T細(xì)胞的比例顯著增加，CD8單陽(yáng)性T細(xì)胞的比例略有增加，但無(wú)顯著性差異；KKAy小鼠的CD4CD8雙陽(yáng)性T細(xì)胞的比例顯著降低，CD4單陽(yáng)性T細(xì)胞和CD8單陽(yáng)性T細(xì)胞的比例略有增加，但無(wú)顯著性差異。其中，照射后KKAy小鼠的CD4單陽(yáng)性T細(xì)胞比例升高幅度顯著低于C57小鼠，(15.30 ± 17.00)% vs (115.90 ± 33.85)%，P< 0.001。以上結(jié)果表明：4 Gy輻射暴露可顯著降低C57和KKAy小鼠脾中CD4CD8雙陽(yáng)性T細(xì)胞的比例。

圖5 全身照射對(duì)C57和KKAy小鼠脾淋巴細(xì)胞的影響Figure 5 Effect of whole-body irradiation on the percentages of splenic lymphocytes in the C57 and KKAy mice

圖6 全身照射對(duì)C57和KKAy小鼠胸腺淋巴細(xì)胞的影響Figure 6 Effect of whole-body irradiation on the percentages of thymic lymphocytes in the C57 and KKAy mice

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)采用X線亞致死劑量(4 Gy)全身照射小鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)電離輻射對(duì)小鼠明顯的骨髓抑制和免疫功能損傷作用，4 Gy全身照射小鼠可以損傷造血免疫系統(tǒng)功能，降低外周血WBC、RBC、PLT的數(shù)目，降低HGB含量和LYM%，降低HPC、HSC和LT-HSC的比例，降低脾B細(xì)胞和T細(xì)胞的比例，降低胸腺CD4CD8雙陽(yáng)性細(xì)胞的比例。

比較發(fā)現(xiàn),2型糖尿病KKAy小鼠的HSC和LT-HSC的比例以及外周血LYM%低于C57小鼠，提示糖尿病與健康小鼠在造血免疫功能上存在差異。這與之前發(fā)表的糖尿病中HSC功能受損的研究結(jié)果一致[12-13]。4 Gy全身照射15 d后，KKAy小鼠與C57小鼠某些指標(biāo)降低的幅度也存在顯著性差異，KKAy小鼠的骨髓HSC和LT-HSC的降低幅度明顯低于C57小鼠，外周血RBC和HGB也發(fā)生了同樣的變化，提示我們KKAy小鼠可能比C57小鼠表現(xiàn)出對(duì)電離輻射更強(qiáng)的耐受性。但由于糖尿病本身造血免疫系統(tǒng)受損，KKAy小鼠未必表現(xiàn)出對(duì)長(zhǎng)期的電離輻射更強(qiáng)的耐受性，需要進(jìn)一步的研究。

Bannon等[14]研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病中造血干細(xì)胞的譜系分化改變，在向淋巴細(xì)胞分化過(guò)程中，糖尿病小鼠與健康小鼠的HSC分化偏移不同，糖尿病小鼠更易M1型巨噬細(xì)胞分化，導(dǎo)致長(zhǎng)期的炎癥狀態(tài)，引起糖尿病創(chuàng)面難愈的狀態(tài)。糖尿病小鼠長(zhǎng)期處于“慢性炎癥”的應(yīng)激狀態(tài)，可能導(dǎo)致其對(duì)單次全身照射的耐受更強(qiáng)。此外，2型糖尿病KKAy小鼠表現(xiàn)出對(duì)機(jī)體輻射損傷的耐受性作用類(lèi)似于適應(yīng)性反應(yīng)。低劑量單次全身照射可誘導(dǎo)小鼠免疫適應(yīng)性反應(yīng)[15]，低劑量輻射可激活細(xì)胞中的信號(hào)傳遞系統(tǒng)，使損傷后DNA修復(fù)，通過(guò)凋亡等機(jī)制清除損傷細(xì)胞進(jìn)而對(duì)相繼高劑量輻射產(chǎn)生耐受性。糖尿病小鼠中是否存在類(lèi)似的機(jī)制導(dǎo)致其對(duì)高劑量輻射產(chǎn)生耐受性也是一個(gè)值得研究的內(nèi)容。

電離輻射可通過(guò)引起小鼠造血祖細(xì)胞凋亡，造成急性骨髓抑制；通過(guò)引起造血干細(xì)胞衰老，導(dǎo)致長(zhǎng)期的骨髓抑制[16-17]。細(xì)胞衰老與2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[18]，因此細(xì)胞衰老可能與糖尿病小鼠在電離輻射的耐受性有關(guān)。

本項(xiàng)研究分析比較了糖尿病小鼠與對(duì)照小鼠造血免疫細(xì)胞輻射損傷，為糖尿病小鼠輻射敏感性深入研究提供了基礎(chǔ)資料。糖尿病與惡性腫瘤的放療損傷敏感性的相關(guān)性有待進(jìn)一步觀察和探討。