高效液相色譜法測定血液透析器中二苯基甲烷二異氰酸酯的溶出量

徐蘇華（通信作者），柯軍，顏林，葉曉燕，梁澤鑫

廣東省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗所 （廣東廣州 510006）

血液透析通過彌散、對流、超濾、吸附等機制清除體內(nèi)有害物質(zhì)，維持水電解質(zhì)平衡[1]。血液透析器簡稱透析器，是血液和透析液進行溶質(zhì)交換的管道和容器，是血液透析的關(guān)鍵部分。透析器主要由支撐結(jié)構(gòu)和透析膜組成，后者是其重要組成部分，為半透膜，只允許小于膜孔徑的分子通過，膜材料為改良的纖維素膜和合成膜兩種，兩者均可制成高通量的透析器。聚氨酯密封膠在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用主要是血漿分離器等中空纖維型血液透析裝置的密封,人工肝、腎器官的灌注密封等。血液透析器的主要部件中空纖維束是由密封膠澆注粘結(jié)固定在透析器的外殼之中的[2]。

二苯基甲烷二異氰酸酯（diphenylmethane diisocyanate，MDI）在工業(yè)上廣泛用于制造硬質(zhì)泡沫、熱塑性聚氨酯彈性體、涂料、粘合劑、彈性纖維、建筑材料等[3-5]。血液透析器中的聚氨酯密封膠便是由MDI合成而來，MDI因兩個異氰酸酯基團在苯環(huán)上的位置不同，有4,4'-MDI、2,4'-MDI和2,2'-MDI等異構(gòu)體。制備聚氨酯所用MDI以4,4'-MDI為主。4,4'-MDI以氣體形態(tài)存在時，具有一定的毒性，會刺激皮膚、眼睛和呼吸道，引起人類哮喘、過敏性肺炎和上呼吸道炎癥等疾病[6]。有研究表明，MDI染毒干擾了睪丸組織的有氧代謝，抑制了細胞對能量的利用,可損傷各級生精細胞，造成生精上皮的損傷,并且通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)對睪丸組織造成一定程度的損傷，繼而引起精子生成減少和睪丸重量下降,造成雄性生殖系統(tǒng)的損傷，并且這種損傷呈現(xiàn)出一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系[7]。同時，有研究表明，亞慢性毒性、慢性毒性、致癌性試驗中，MDI均有毒性反應(yīng)，其氣體對小鼠的最小安全劑量（no observed adverse effect level，NOAEL）為0.19 mg/m3[8-9]。

4,4'-MDI分子式為（C6H4NCO）2CH2，帶有兩個異氰酸酯基（-N=C=O）。MDI固體形態(tài)時，通過對小鼠重復(fù)給藥發(fā)現(xiàn)，4,4'-MDI在與血液接觸后會迅速分解，其主要降解產(chǎn)物為4,4'-二氨基二苯甲烷（MDA），分子式為C13H14N2。國際癌癥研究機構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）將MDI分級為3，即對人體不具備致癌性，而MDA的分級為2B，即可能對人體致癌[6]。國內(nèi)外對MDI的研究主要為環(huán)境中MDI對人體的影響[10-12]，醫(yī)療器械中MDI的測量較少報道[13-14]。本研究采用高效液相色譜儀，用甲醇作為浸提介質(zhì)，模擬臨床使用制備浸提液，建立了檢驗MDI的高效液相色譜法，并進行了方法學(xué)驗證。

1 材料與方法

1.1 試劑和樣品

試劑：甲醇（分析純，含量≥99.5%，廣州化學(xué)試劑廠）；乙腈（HPLC色譜純，默克股份兩合公司）；4,4'-二氨基二苯甲烷（標(biāo)準品，99.5%，北京百靈威科技有限公司）；乙酸銨（分析純，含量≥98.0%，廣州化學(xué)試劑廠）；去離子水（18.25 MΩ.cm）。樣品：血液透析器（A公司生產(chǎn)，型號：B-20HF）

1.2 試驗儀器及條件

儀器：高效液相色譜儀（日本島津LC-20AT）。條件：色譜柱為 Inertsil?ODS-SP， 4.6 mm×250 mm，5 μm ；流動相為0.05 mol/L乙酸銨/乙腈（70/30）；流速為1.0 ml/min，檢測波長為250 nm，進樣量為20 μl。

1.3 溶液配制

1.3.1 對照品溶液制備

稱取50 mg 4,4'-二氨基二苯甲烷（MDA）對照品于100 ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋制成500 μg/ml的MDA母液。取母液用乙腈逐級稀釋分別配制0.5 μg/ml、0.7 μg/ml、1.25 μg/ml、2.5 μg/ml、5 μg/ml的系列對照品溶液。對照品溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，在上述色譜條件下進行測定，每個濃度重復(fù)測定3次取平均值，得到MDA標(biāo)準曲線。

1.3.2 浸提液和供試液的制備

取一套樣品與玻璃燒瓶連成一個循環(huán)系統(tǒng)，加入500 ml甲醇并保持在（37±1 ）℃，通過蠕動泵作用于一段盡可能短的硅橡膠管上，使甲醇分別以200 ml/min和400 ml/min的流量循環(huán)5.5 h，得到浸提液1和浸提液2。不接透析器同法制備空白溶液。分別取空白溶液、浸提液1和浸提液2各50 ml在40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸干，將殘留物溶解在2 ml 乙腈中，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，得到空白供試液、供試液1和供試液2。

2 結(jié)果

2.1 專屬性

空白溶液和濃度為0.5 μg/ml的MDA對照樣品溶液，在上述色譜條件下進行測定，結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示MDA的保留時間約為17.000 min，理論塔板數(shù)為10 532，分離度為29，拖尾因子0.984，空白溶液無待測物質(zhì)峰，待測物質(zhì)與其他峰無干擾，表明該色譜條件可用來測定MDA的含量。

圖1 液相色譜圖

在1.2的色譜條件下進樣分析，以各組分濃度峰面積和對照品濃度作圖，得到MDA標(biāo)準品曲線，見圖2?；貧w方程為Y=86678.4X＋168.116，相關(guān)系數(shù)r=0.99996123，表明MDA濃度在0.5～5.0 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 檢測限與定量限

取MDA對照品溶液，按需求等比稀釋，將得到的低濃度對照品溶液進行檢測。檢測限：平均信噪比（S/N）約3.5時，最低檢測濃度為0.02 μg/ml；定量限：平均信噪比（S/N）約為10時，檢測濃度為0.05 μg/ml。

2.3 精密度

圖2 MDA對照品線性圖

重復(fù)性：取濃度為0.5 μg/ml、1.25 μg/ml、5.0 μg/ml的標(biāo)準品各連續(xù)測定3次，計算峰面積（即濃度）的RSD值，如表1。中間精密度：在不同天由不同分析人員平行制備同重復(fù)性濃度相同的各3份標(biāo)準品連續(xù)測定計算峰面積（即濃度）的RSD 值，如表2。根據(jù)中國藥典（2015年版）9101藥品質(zhì)量標(biāo)準分析方法驗證指導(dǎo)原則，當(dāng)樣品濃度為1 μg/ml級別時，重復(fù)性RSD應(yīng)≤8%，中間精密度RSD應(yīng)≤16%[15]。從表1和表2可以看出，重復(fù)性RSD為0.096%～0.30%，日間精密度RSD為0.14%～0.52%，符合中國藥典的相關(guān)要求。

表1 重復(fù)性試驗結(jié)果（n=3）

表2 日間精密度試驗結(jié)果 （n=3）

2.4 回收率

取加標(biāo)濃度為0.55 μg/ml、0.80 μg/ml、1.55 μg/ml的樣品各3份，分別測定3次，計算平均回收率，如表3。加標(biāo)樣品制備方法：取樣品9份，向其中加入標(biāo)準品，制備理論濃度為0.55 μg/ml、0.80 μg/ml、1.55 μg/ml的樣品各3份。根據(jù)中國藥典（2015年版）9101藥品質(zhì)量標(biāo)準分析方法驗證指導(dǎo)原則，當(dāng)樣品濃度為1 μg/ml級別時，回收率應(yīng)符合80%～120%[15]。從表3可以看出，平均回收率為99.88%～103.33%，符合中國藥典的相關(guān)要求。

表3 回收率試驗結(jié)果（n=3）

2.5 樣品MDI溶出量

空白供試液、供試液1、供試液2的MDA濃度及每套血液透析器MDI溶出量見表4，色譜圖見圖3。

計算過程如下：在浸提溶劑中，MDI轉(zhuǎn)變?yōu)镸DA，且是等濃度轉(zhuǎn)變，因此，供試液中MDA的濃度即為MDI的濃度。MDI溶出量 M=（C供試液×2）×（500/50）=20C供試液。其中，M為每套血液透析器中MDI溶出量，單位為μg；C供試液為供試液MDA濃度，單位為μg/ml；2為復(fù)溶使用的乙腈體積，單位為ml；500為每套血液透析器制備的浸提液體積，單位為ml；50為旋轉(zhuǎn)蒸干的浸提液體積，單位為ml?？瞻坠┰囈?和空白供試液2未檢出，因此，其MDA濃度均小于檢出限，即為＜0.02 μg/ml。

表4 血液透析器中MDI溶出量結(jié)果

圖3 MDA含量液相色譜圖

3 討論

因MDI在水中極易水解生成MDA，因此本研究以MDA為對象進行。美國毒物和疾病登記署（Agency for Toxic Substances and Disease Registry ，ATSDR）及美國國家衛(wèi)生基金會（National Sanitation Foundation，NSF）評估了MDA的毒性，給出了短期每日安全劑量值，根據(jù)小鼠重復(fù)給藥12周得到的最小安全劑量值為8.3 mg/（kg·d），采用不確定因子100（100=10×10，10為物種間差異，10為人體間差異），則人員短期每日安全劑量值為8.3/100=0.083 mg/（kg·d），即為可耐受攝入量TI值。

采用GB/T16886.17-2005《醫(yī)療器械生物學(xué)評價第17部分：可瀝慮物允許限量的建立》中公式推導(dǎo)，可耐受限量TE=TI×m×UTF，UTF=CEF×PEF，PEF=nexp/nuse，則可耐受限量TE=TI×m×CEF×（nexp/nuse）。公式中：TI為耐受攝入量，0.083 mg/（kg·d）；m為醫(yī)療器械接觸群體的體重，以體重70 kg計；CEF為多器械因子，缺省值為0.2；nexp為一種器械接觸類別的天數(shù)，本產(chǎn)品最高接觸6 h，0.25 d；nuse為器械的使用時間，本產(chǎn)品最高使用時間6 h，0.25 d。則 MDI的可耐受限量 TE=0.083×70×0.2×（0.25/0.25）=1.162 mg/次，因本產(chǎn)品為一次性使用，即可認為產(chǎn)品中MDI的最高溶出限量為1.162 mg/套。當(dāng)流速分別為200 ml/min和400 ml/min時，每套血液透析器MDI含量分別為5.82 μg、5.98 μg，均在安全限量范圍之內(nèi)。

本研究建立了高效液相色譜儀檢測血液透析器中MDI溶出量的分析方法，該方法具有處理簡單、重復(fù)性好、定量準確等特點。同時，本研究進一步推導(dǎo)了血液透析器中MDI的安全限量值，可為使用聚氨酯密封膠密封血液透析器的醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)提供很好參考價值。