農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜椒遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

蘇振華,張俊華,張澤鑫,李妹芳,郭尚敬,曹雪松,冀蘆沙,3*

(1.聊城大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 聊城 252000；2.聊城大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東 聊城 252000；3.聊城大學(xué) 藥學(xué)院，山東 聊城 252000)

隨著生命科學(xué)的蓬勃發(fā)展，分子生物學(xué)和基因工程也取得了長足的進步。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化方法[1]，由于其可導(dǎo)入大片段DNA且導(dǎo)入基因拷貝數(shù)低，高轉(zhuǎn)化率且表達效果好，引起了人們的極大關(guān)注[2]；同時由于其對儀器和操作技術(shù)要求較低，被廣泛應(yīng)用于植物基因工程中，用于研究未知基因功能、各種基因調(diào)控原件的機理等。目前，已知的80%的轉(zhuǎn)基因植物是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)完成的[3-4]。目前番茄、煙草、馬鈴薯等多數(shù)作物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)已日趨完善[5-7]，實用化程度不斷提高，而甜椒的遺傳轉(zhuǎn)化還不是十分完善，其轉(zhuǎn)化效率較低，且由于其遺傳背景較為狹窄，存在著較強的基因型依賴性，極大地限制了甜椒基因工程遺傳改良的步伐和辣椒功能基因組學(xué)研究。因此，本實驗通過研究不同因子對甜椒轉(zhuǎn)化效率的影響，優(yōu)化了甜椒遺傳轉(zhuǎn)化體系，旨在建立高效快速的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜椒遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系,為甜椒進一步的分子生物學(xué)和基因工程研究提供較好的技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 甜椒品種 低溫滲透系甜椒CL122，由聊城大學(xué)植物分子生物學(xué)實驗室根據(jù)野生甜椒CA157與栽培甜椒CA52篩選育成。

1.1.2 根癌農(nóng)桿菌菌株與載體 根癌農(nóng)桿菌GV 3101(KanR)：攜帶植物表達載體pCAMBIA-1301-GFP(抗性標(biāo)記為抗卡那霉素)。

1.1.3 培養(yǎng)基 農(nóng)桿菌培養(yǎng)基：液/固體LB培養(yǎng)基+Kan 100 mg/L+Rif 50 mg/L；組織培養(yǎng)培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基MS、1/2MS。

1.2 實驗方法

1.2.1 基本培養(yǎng)條件 培養(yǎng)溫度：(25±1) ℃；光照強度：2000～2200 lx、16 h/d，光源為熒光燈。設(shè)置3次重復(fù)，每次處理外植體個數(shù)為30個。

1.2.2 農(nóng)桿菌侵染液的制備 將含有目的基因的農(nóng)桿菌劃線接種于含有100 mg/L Kan+50 mg/L Rif的LB培養(yǎng)基上，28 ℃暗培養(yǎng)2 d至長出單菌落。隨后挑取單菌落轉(zhuǎn)接至含有100 mg/L Kan+50 mg/LRif的5 mL液體LB培養(yǎng)基中，在200 r/min、28 ℃條件下培養(yǎng)16 h后，轉(zhuǎn)接至含有100 mg/L Kan+50 mg/L Rif的50 mL液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期OD600≌0.6～1.0；以5000 r/min集菌，使用侵染緩沖液將其懸浮至OD600=0.6，4 ℃保存。

1.2.3 外植體準備 將甜椒種子用水浸泡8～10 h，流水清洗30 min，用無菌水沖洗2～4次，然后于超凈工作臺上用75%酒精消毒1 min，再用20%的84液和0.02%的TritonX-100 1∶1混合液，以180 r/min震蕩消毒10 min，用無菌水沖洗4～6次。將消毒除菌的甜椒種子接種于不含任何生長激素的1/2MS培養(yǎng)基上，25 ℃、16 h/d 光照(2000 lx)培養(yǎng)，6～7 d 后得到未長出子葉、帶有子葉節(jié)的無菌苗。

1.2.4 影響甜椒遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素 在使用農(nóng)桿菌對甜椒外植體進行侵染的過程中，影響因子包括：Kan選擇壓、農(nóng)桿菌菌液濃度、AS濃度、預(yù)培養(yǎng)時間、侵染時間、共培養(yǎng)時間、不同激素濃度等。在實驗設(shè)計過程中，分別以某一因子為單一變量，其他因子以轉(zhuǎn)化程序為標(biāo)準，觀察不同影響因子對甜椒再生效率和轉(zhuǎn)化效率的影響。

1.2.4.1 卡那霉素(Kan)選擇壓的確定 在超凈工作臺中，切取甜椒子葉節(jié)，將其作為外植體，接種至含有不同Kan濃度(0、25、50、75、100 mg/L)的生芽培養(yǎng)基上。每個濃度重復(fù)3次，每次處理外植體個數(shù)為30個。培養(yǎng)條件同無菌苗的培養(yǎng)，每隔10 d 進行繼代，于30 d后觀察外植體狀態(tài)，測定愈傷誘導(dǎo)率和平均每個外植體抗性芽數(shù)。

愈傷誘導(dǎo)率(%)=(產(chǎn)生愈傷的外植體數(shù)/總外植體數(shù))×100%

平均每個外植體抗性芽數(shù)=抗性芽數(shù)總數(shù)/外植體總數(shù)

1.2.4.2 AS濃度的確定 基本條件同1.2.4.1，設(shè)置的AS濃度分別為0、50、100、150、200、300、500 μmol/L。

1.2.4.3 預(yù)培養(yǎng)時間的確定 切取甜椒子葉節(jié)作為遺傳轉(zhuǎn)化的外植體，將外植體接種至含有2.0 mg/L AgNO3+2.0 mg/L 6-BA的MS預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基，置于25 ℃暗培養(yǎng)培養(yǎng)箱，分別培養(yǎng)0～5 d，每個時間處理重復(fù)3次，每次處理外植體個數(shù)為30個。

1.2.4.4 農(nóng)桿菌侵染時間的確定 使用制備好的農(nóng)桿菌侵染緩沖液侵染預(yù)培養(yǎng)的甜椒外植體，為保證侵染時間一致，可先將外植體取出，放置于滅菌的濾紙上，再將所有外植體同時放入侵染緩沖液中，侵染時間分別為0、5、10、15、20、25、30 min。取出經(jīng)過侵染的外植體，將表面的菌液吸干，將其放入共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS+2 mg/L 6-BA+2 mg/L AgNO3+100 μmol/L AS)，25 ℃暗培養(yǎng)2 d，每種時間處理重復(fù)3次，每次處理外植體個數(shù)為30個。

1.2.4.5 共培養(yǎng)時間的確定 農(nóng)桿菌侵染外植體后，將被侵染的外植體轉(zhuǎn)接至共培養(yǎng)基，共培養(yǎng)時間分別為0、1、2、3、4、5 d。 25 ℃下，暗培養(yǎng)，每種時間重復(fù)3次，每次處理外植體個數(shù)為30個。

1.2.4.6 Timentin 抑菌濃度的選擇 在對農(nóng)桿菌侵染后的外植體進行選擇和生根培養(yǎng)時，需要加入一定濃度的抗生素進行抑菌，同時因為Timentin具有抑菌作用且毒性較小，故在選擇和生根培養(yǎng)基中加入200 mg/L Timentin，對外植體生長和污染狀況進行觀察。

1.2.4.7 選擇培養(yǎng)及植株再生 共培養(yǎng)結(jié)束后，將外植體轉(zhuǎn)接至選擇培養(yǎng)基(MS+2.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L AgNO3+400 mg/L Timentin +Kan)中進行培養(yǎng)，根據(jù)不同Kan選擇壓，每種重復(fù)3次，每次重復(fù)外植體個數(shù)為 30個。培養(yǎng)條件為25 ℃，光照16 h/d 。

1.2.4.8 不同激素濃度的生根培養(yǎng)基 當(dāng)選擇培養(yǎng)基中的外植體不定芽生長至1～2 cm時即可將其轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基，首先將其轉(zhuǎn)接至不同激素濃度的生根培養(yǎng)基，3～5 d后轉(zhuǎn)接至MS+400 mg/L Cef培養(yǎng)基中繼續(xù)生根培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為25 ℃，光照16 h/d。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因苗PCR檢測

1.2.5.1 轉(zhuǎn)基因苗DNA提取 按照以下步驟操作：(1)組織處理：收取轉(zhuǎn)基因甜椒葉片，放置于1.5 mL EP管中，通過高通量組織研磨儀進行研磨。(2)向EP管中加入500 μL SDS-DNA提取Buffer，充分混勻后65 ℃溫浴10 min。(3)常溫、12000 r/min 離心10 min，取上清。(4)加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)，12000 r/min離心10 min，取上清。(5)加入0.5倍體積異丙醇，充分混勻，轉(zhuǎn)至吸附柱中，12000 r/min離心2min，棄廢液。重復(fù)2次。(6)向吸附柱中加入600 μL無水乙醇，12000 r/min離心30 s，棄廢液。重復(fù)兩次。(7)將吸附柱12000 r/min離心2 min，放入新EP管中。(8)向吸附柱中加入40 μL TE洗脫，12000 r/min離心2 min。

1.2.5.2 PCR檢測PCR反應(yīng)體系：模板1.0 μL、20 μmol/L eGFP3′ 0.2 μL、20 μmol/L eGFP5′ 0.2 μL、Taq酶0.2 μL、10 mmol/L dNTP 0.4 μL、10×PCR buffer 2.0 μL、ddH2O 15.2 μL、總體積20.0 μL。

PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min(預(yù)變性)、94 ℃ 30 s(變性)、59 ℃ 40 s(退火)、72 ℃ 40 s(延伸)、72 ℃ 5 min(延伸)、4 ℃冷卻；共30個循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 卡那霉素(Kan)對甜椒外植體分化的影響

由表1可知，在甜椒進行遺傳轉(zhuǎn)化的過程中，Kan對甜椒外植體愈傷組織的形成與分化有明顯的影響，隨著培養(yǎng)基Kan濃度的提高，甜椒外植體愈傷誘導(dǎo)率與抗性芽數(shù)均明顯降低。當(dāng)培養(yǎng)基中無Kan時，愈傷誘導(dǎo)率與抗性芽數(shù)均為最高，分別為73.33%和1.25個。當(dāng)Kan濃度提高至75 mg/L時，外植體無法生成愈傷并停止分化。當(dāng)Kan濃度為50 mg/L時，甜椒外植體愈傷誘導(dǎo)率和抗性芽數(shù)極低，分別為17.67%和0.13個，因此將此濃度定為甜椒外植體分化的最低抑制濃度，同時，確定Kan選擇壓為50 mg/L。

2.2 菌液中加入 AS 對甜椒子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響

AS是一種高效激素，一定濃度的AS可以提高外植體的愈傷誘導(dǎo)率和抗性芽數(shù)，并能夠提高農(nóng)桿菌的侵染效率，提高轉(zhuǎn)化率。因此我們在菌液中加入不同濃度的AS，研究AS對甜椒外植體分化的影響。表2顯示，不同濃度AS對甜椒外植體的再生分化有一定的影響，并存在一定的差異。如表2所示，當(dāng)AS濃度上升至100 μmol/L時，隨AS濃度增大，甜椒愈傷誘導(dǎo)率與抗性芽數(shù)均有增長，但在AS濃度大于100 μmol/L后，甜椒再生分化效率均有所降低，但多數(shù)均大于AS濃度為0時的數(shù)值，且當(dāng)AS濃度為100 μmol/L時，甜椒外植體愈傷誘導(dǎo)率和抗性芽數(shù)均為最高，分別為73.33%和1.48個。由此說明一定濃度的AS可以促進外植體的再生與分化，且在100 μmol/L時效率最高。

表1 Kan對甜椒子葉節(jié)分化的影響

表2 菌液中加入 AS 對甜椒子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響

2.3 預(yù)培養(yǎng)時間對甜椒子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響

如表3所示，甜椒外植體的預(yù)培養(yǎng)時間對其愈傷誘導(dǎo)率影響較小，但各組數(shù)值均大于預(yù)培養(yǎng)時間為0時的愈傷誘導(dǎo)率；預(yù)培養(yǎng)時間對抗性芽數(shù)有明顯的影響，各組數(shù)值差異較大，在預(yù)培養(yǎng)2 d時外植體抗性芽數(shù)最多，且愈傷誘導(dǎo)率最高，由此確定最適宜的外植體預(yù)培養(yǎng)時間為2 d 。

2.4 農(nóng)桿菌侵染時間對甜椒子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響

在構(gòu)建甜椒遺傳轉(zhuǎn)化體系過程中，利用農(nóng)桿菌侵染甜椒外植體是最為重要的過程，其中農(nóng)桿菌侵染時間決定了外植體的再生分化效率。農(nóng)桿菌侵染時間對甜椒外植體愈傷誘導(dǎo)率和抗性芽數(shù)的影響如表4所示，農(nóng)桿菌侵染時間對甜椒外植體遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響，呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，并在侵染5 min時，愈傷誘導(dǎo)率和抗性芽數(shù)達到最高，分別為98.41%和1.87個，明顯高于其他處理時間下的；當(dāng)侵染時間為0 min和11 min時，愈傷誘導(dǎo)率和抗性芽數(shù)明顯低于其他處理時間下的。由此說明，過短或過長侵染時間均不利于甜椒的遺傳轉(zhuǎn)化，且侵染最適時間為5 min。

表3 預(yù)培養(yǎng)時間對甜椒子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響

表4 農(nóng)桿菌侵染時間對甜椒子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響

2.5 共培養(yǎng)時間對甜椒子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響

共培養(yǎng)時間是甜椒遺傳轉(zhuǎn)化效率的重要影響因素之一，是農(nóng)桿菌將目的基因整合進入甜椒基因組的重要過程。把甜椒外植體侵染過后轉(zhuǎn)接至共培養(yǎng)培養(yǎng)基，研究共培養(yǎng)時間對甜椒外植體遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響，結(jié)果見表5。隨著共培養(yǎng)時間的延長，甜椒外植體的再生分化效率呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，并在2 d時達到最高，愈傷誘導(dǎo)率和抗性芽數(shù)分別為99.89%和1.79個；2 d后隨著時間的延長，農(nóng)桿菌較難抑制，外植體污染率增大，致使愈傷誘導(dǎo)率和抗性芽數(shù)降低，因此選取共培養(yǎng)時間為2 d。

2.6 不同激素組合對甜椒子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化苗生根的影響

當(dāng)外植體不定芽生長至1 cm左右時，選取生長狀況良好的不定芽，接種至含激素如表6所示的培養(yǎng)基，于該培養(yǎng)基25 ℃、16 h/d光照下培養(yǎng)，4 d后將不定芽轉(zhuǎn)接至含不同濃度激素的MS+400 mg/LTimentin的生根培養(yǎng)基。如表6所示，經(jīng)MS+0.2 mg/L IAA+400 mg/L Timentin 培養(yǎng)4 d后轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基，此時外植體生根率最高，為100%，且可迅速生長形成植株，與其他不同激素組合有明顯差異。1～4號不同激素配比的培養(yǎng)基均沒有誘導(dǎo)外植體生根，只對愈傷組織產(chǎn)生了一定影響，差異較小。6、7號培養(yǎng)基雖然可以誘導(dǎo)生根，但同時會誘導(dǎo)產(chǎn)生大量愈傷組織，影響外植體根系發(fā)育，不利于植株生長。

表5 共培養(yǎng)時間對甜椒子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響

表6 甜椒子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化苗生根效果

2.7 轉(zhuǎn)基因植株的獲取與檢測

2.7.1 轉(zhuǎn)基因植株的獲取 基礎(chǔ)實驗表明，最適的卡那霉素選擇壓為 50 mg/L，乙酰丁香酮濃度在100 μmol/L時可以明顯提高外植體的抗性芽數(shù)，2 d為最適合的預(yù)培養(yǎng)時間和共培養(yǎng)時間，5 min 作為侵染的最佳時間，在MS+0.2 mg/L IAA(吲哚乙酸)+400 mg/L 特美汀培養(yǎng)基上的生根率最高。因此，根據(jù)結(jié)果配置不同階段培養(yǎng)基(表7)，以獲取轉(zhuǎn)基因植株(圖1)。

表7 不同階段培養(yǎng)基成分

a：篩選培養(yǎng)基生成愈傷組織；b：篩選培養(yǎng)基生成再生芽；

2.7.2 轉(zhuǎn)基因植株檢測結(jié)果 對獲得的植株進行PCR鑒定，有12株植株擴增出750 bp左右與陽性對照相同的條帶，其他植株則擴增出與陰性對照相同的目的條帶(圖2)。通過熒光倒置顯微鏡對PCR鑒定結(jié)果為陽性的植株進行檢測，結(jié)果可以成功激發(fā)出綠色熒光(圖3)，表明綠色熒光蛋白基因已被成功整合到甜椒基因組中。

3 結(jié)論與討論

當(dāng)前，利用農(nóng)桿菌進行遺傳轉(zhuǎn)化已廣泛應(yīng)用于多種轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化途徑可以實現(xiàn)外源基因的導(dǎo)入[4]，并已經(jīng)在番茄[5]、馬鈴薯[6]、辣椒[7]等多種茄科植物中獲得成功。但由于在甜椒轉(zhuǎn)化過程中，其受環(huán)境等因素影響較大，目前還存在一些問題亟待解決，因此建立并逐步優(yōu)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜椒遺傳轉(zhuǎn)化體系是必需的。本實驗以甜椒再生體系為基礎(chǔ)，選取甜椒子葉節(jié)為遺傳轉(zhuǎn)化的外植體，對不同條件對甜椒遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響進行研究，建立了一個高效穩(wěn)定的甜椒遺傳轉(zhuǎn)化體系，并為下一步外源基因的導(dǎo)入，快速獲得甜椒突變體，研究基因功能等創(chuàng)造了條件。

1～18為轉(zhuǎn)基因植株，CK為未轉(zhuǎn)基因植株，CK1為陽性對照。

3.1 甜椒遺傳轉(zhuǎn)化中抗生素的篩選

在植物進行遺傳轉(zhuǎn)化的過程中，陽性轉(zhuǎn)化的篩選是一個重要的步驟[8]，篩選體系的確定直接影響陽性轉(zhuǎn)化植株的獲取。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系中，由于Kan毒性較小，且對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化有一定的針對性，所以研究者普遍使用Kan對陽性轉(zhuǎn)化進行篩選。在利用Kan對被農(nóng)桿菌侵染的外植體進行篩選時，非轉(zhuǎn)化的外植體無法生長，而轉(zhuǎn)化成功的外植體可成功誘導(dǎo)愈傷，并且在適宜條件下可發(fā)育成為完整植株。因此，適宜的Kan選擇壓可以在不影響正常轉(zhuǎn)化植株的情況下，最大限度地抑制非轉(zhuǎn)化植株的生長，進而提高轉(zhuǎn)化效率。袁靜等[9]研究發(fā)現(xiàn)50 mg/L Kan 對辣椒外植體篩選濃度影響最佳；羅齊軍[10]認為辣椒外植體的最佳 Kan 篩選濃度是 35 mg/L。 本試驗研究發(fā)現(xiàn)甜椒遺傳轉(zhuǎn)化體系最合適的Kan選擇壓濃度為 50 mg/L。

圖3 熒光倒置顯微鏡468 nm激發(fā)甜椒葉片GFP熒光

3.2 預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)時間

遺傳轉(zhuǎn)化體系中的預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)時間的選擇尤為重要。預(yù)培養(yǎng)時間太長或太短，均不利于外植體的生長。羅齊軍[10]發(fā)現(xiàn)預(yù)培養(yǎng) 2 d 外植體生長良好，這與本試驗結(jié)果一樣，同時也和黎定軍[11]的研究結(jié)果一致。同時，如果共培養(yǎng)時間過短，則會導(dǎo)致侵染不充分，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率的降低；如果共培養(yǎng)時間過長，由于共培養(yǎng)過程中沒有抑菌劑的加入，會導(dǎo)致外植體大量死亡。因此，有人也會在共培養(yǎng)后進行脫菌處理再進行篩選培養(yǎng)[12,13]，這也是為了防止農(nóng)桿菌對外植體造成污染。

3.3 甜椒遺傳轉(zhuǎn)化中 AS 濃度的選擇

AS可以提高農(nóng)桿菌侵染的轉(zhuǎn)化效率，常被用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化過程中[14-16]。Kim等[17]研究發(fā)現(xiàn)在利用農(nóng)桿菌對辣椒進行遺傳轉(zhuǎn)化的過程中添加AS，可以明顯提高辣椒遺傳轉(zhuǎn)化效率，將其提高至95%以上；羅齊軍[10]研究發(fā)現(xiàn)在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜椒遺傳轉(zhuǎn)化體系中，在菌液和共培養(yǎng)基中加入 100 μmol/L AS可以顯著提高外植體愈傷誘導(dǎo)率和不定芽分化率。同時，楊國順等[18]認為最合適的AS濃度為200 μmol/L。本實驗在菌培養(yǎng)及共培養(yǎng)階段均添加了AS,得到了明顯高于對照組外植體分化再生效率的結(jié)果，并發(fā)現(xiàn)甜椒遺傳轉(zhuǎn)化體系中適宜的AS濃度為100 μmol/L。

3.4 侵染時間對甜椒遺傳轉(zhuǎn)化的影響

農(nóng)桿菌侵染時間直接影響農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率，并與外植體誘導(dǎo)抗性芽數(shù)有密切關(guān)系。適宜的侵染時間十分重要，如果農(nóng)桿菌侵染時間過長，則外植體上會有大量的農(nóng)桿菌殘留，在后期的培養(yǎng)過程中，可能會出現(xiàn)，且難以控制，導(dǎo)致植株死亡；侵染時間過短，菌液與外植體接觸不夠充分，會降低轉(zhuǎn)化效率，導(dǎo)致大量非抗性苗出現(xiàn)。同時侵染時間的選擇也同菌液濃度有關(guān)，一般選擇菌液濃度OD600為0.3～0.5。黃妤等研究農(nóng)桿菌侵染辣椒的最適時間為5 min[19]。也有人發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌侵染辣椒7～8 min 對再生頻率和抗性芽數(shù)影響效果最好[20]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，甜椒遺傳轉(zhuǎn)化體系中最適合的侵染時間為5 min，且侵染時間不宜有太大變化。

3.5 抑菌劑(Timentin)濃度的選擇

Timentin作為一種抑菌劑，可以用來抑制農(nóng)桿菌，同時由于其對外植體毒害作用較小，所以常用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化過程中。在實驗初始階段，進行生根培養(yǎng)時，由于沒有加入Timentin，出現(xiàn)了大量的植株污染現(xiàn)象。后經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，在生根過程中加入一定濃度的Timentin可以降低污染，同時轉(zhuǎn)化植株長勢良好，無黃葉出現(xiàn)。在本次試驗過程中我們主要是參考敬國興等對這一部分的研究[21]，如果 Timentin 濃度過低時，生長一段時間后農(nóng)桿菌會大量再生，引起植株大量的污染，最后造成植株死亡。在試驗過程中研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加200 mg/L Timentin可以有效抑制農(nóng)桿菌的生長。