納米硒對肉雞六價鉻中毒的影響

趙雅麗 周東海

摘要：目前肉雞鉻中毒沒有具體明確的治療方案，納米硒在減輕重金屬中毒方面作用突出。為研究納米硒補充劑對鉻（VI）（K2Cr2O7）中毒肉雞的影響，通過高通量測序選取兩個改變比較大的基因ACACA和CPT1A.，以此來探索納米硒是否對肉雞鉻中毒具有預(yù)防和治療作用。試驗將180只一日齡肉雞分成6組：空白對照組、鉻中毒組、納米硒保護組、納米硒治療組、納米硒預(yù)防組、納米硒對照組，每組3次重復(fù)。喂養(yǎng)35 d后，取出肝臟，HE染色，RT-qPCR進行驗證。結(jié)果表明：①鉻中毒組肉雞的肝臟切片可見細胞破裂，輪廓不清晰，細胞核破裂，核固縮，肝竇間隙增大，中央靜脈管擴張;其他組的一部分肝臟細胞處于正常狀態(tài)，一小部分被破壞。②用納米硒治療之后，ACACA基因上調(diào)幅度降低，CPT1A基因下調(diào)幅度降低，說明納米硒可以減輕鉻對肉雞的影響。該結(jié)論為以后研究鉻中毒和治療鉻中毒提供了一個重要思路和方向。

關(guān)鍵詞：鉻中毒;納米硒;肉雞;ACACA基因;CPT1A基因

中圖分類號：S859.8? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? 文章編號：1007-273X（2019）05-0010-02

鉻是一種微量元素，常見的價態(tài)為+2、+3、+6，三價鉻是對人體有益的微量元素，六價鉻的毒性較強.一般認為六價鉻毒性是三價鉻的1 000倍，Cr（VI） 還具有強氧化性和腐蝕性，因此，鉻的毒性研究主要集中在Cr（VI）化合物上[1].目前為止，人們在鉻中毒上的研究都是在大鼠，小鼠上[2]，肉雞鉻中毒研究幾乎空白，肉雞鉻中毒的預(yù)防和治療方法較少，所以我們對此進行了研究。已知納米硒是一種新型材料，對于預(yù)防重金屬中毒有重要作用，早期在動物的基礎(chǔ)日糧中添加諸如Na2SeO4、Na2SeO3等無機硒，這一補硒方式有很多明顯缺點，如轉(zhuǎn)化率低，對環(huán)境有害等，當前已經(jīng)有部分國家禁止無機硒作為補充劑來直接使用，而廣泛使用有機硒[3-6]。鉻也是一種重金屬，因此用納米硒去預(yù)防和治療肉雞鉻中毒是可行的。

肉雞鉻中毒之后，通過高通量測序，檢測到ACACA和CPT1A這兩個基因表達量變化較大，ACACA是一個上調(diào)基因，CPT1A是一個下調(diào)基因。本試驗主要是采用納米硒治療鉻中毒肉雞，通過HE染色和RT-qPCR觀察ACACA和CPT1A基因上調(diào)下調(diào)情況，以此來驗證納米硒對肉雞鉻中毒是否有預(yù)防、治療和保護作用。

1? 材料與方法

1.1? 材料

一日齡肉雞（購于宜昌正大畜牧武漢分公司）;重鉻酸鉀（化學式：K2Cr2O7;分子質(zhì)量：294.19;基準級，天津天灝化工廠生產(chǎn)，含量99.8%以上）;納米硒（含量99.99%以上，200目，平均粒徑40 nm）;伊紅染色液;蘇木素染液;10%福爾馬林溶液; RNA提取、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（武漢谷歌生物公司）;初級兔單克隆抗ACACA和CPT1A抗體（武漢AB克隆技術(shù)公司）。

1.2? 方法

急性試驗：選取健康雛雞20只適應(yīng)性喂養(yǎng)6 d后，隨機分為A、B、C、D 4組，每組5只。依照預(yù)試驗中確定的雛雞致死濃度范圍，按Horn氏法設(shè)計 K2Cr2O7劑量如下：0.100、0.464、1.000和2.150 g/kg體重。經(jīng)口灌胃染毒，灌胃容積按照各自雛雞體重的1%計算，灌胃前將試驗用雛雞禁食6 h，飲水不限，觀察14 d。根據(jù)Horn表計算得出K2Cr2O7對雛雞的半數(shù)致死量（LD50）為0.464 g/kg體重，95%可信限為2.98～7.23[7，8]。

1.3? 造模

180只AA一日齡雛雞，飼養(yǎng)1周之后分為6組：空白對照組（基礎(chǔ)日糧和清水）、鉻中毒組[0.037 g/（kg·d）的K2Cr2O7）、納米硒對照組（基礎(chǔ)日糧和0.5 mg/（kg·d）的納米硒]、納米硒保護組[0.037 g/（kg·d）的K2Cr2O7和0.5 mg/（kg·d）納米硒同時飼喂]、納米硒治療組[飼喂2周0.037 g/（kg·d）的K2Cr2O7之后加入0.5 mg/（kg·d）納米硒飼喂]、納米硒預(yù)防組[飼喂2周 0.5 mg/（kg·d）納米硒后再加入0.037 g/（kg·d）的K2Cr2O7飼喂]。試驗雞采用舍內(nèi)籠養(yǎng)，自由采食飲水。育雛時溫度控制在34 ℃左右，然后每周控制溫度下降2～3 ℃直至恒溫，直到試驗結(jié)束[9，10]。

1.4? HE染色

35 d之后，處死肉雞，按照試驗要求取肝臟，用生理鹽水清洗，然后迅速放入4%多聚甲醛固定液中固定，24 h后進行組織蠟塊制作。

1.5? RT-qPCR

根據(jù)試驗要求提取總RNA，然后電泳檢測RNA的穩(wěn)定性.之后進行反轉(zhuǎn)錄，再根據(jù)NCBI主頁GeneBank已公布的目的基因序列，應(yīng)用Primer premier 5.0軟件設(shè)計引物，同時參考文獻中提及的引物序列。引物設(shè)計見表1。之后進行實時熒光定量PCR，熒光定量體系見表2。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 生長特征觀察

在整個試驗過程中，空白對照組和納米硒對照組雞的行為特征，體重以及剖檢病變無異常;鉻中毒組雞的精神不佳，體型偏小，被毛粗亂無光澤;添加納米硒組雞比鉻中毒組雞體型稍大，體重增加，精神狀態(tài)良好。試驗過程中無試驗動物死亡。

2.2? 病理切片觀察

肉雞肝臟組織病理切片見圖1。圖1a和圖1f為空白對照組和納米硒對照組，可見其細胞膜、細胞核清晰，肝竇隙均正常;圖1b為鉻中毒組的肝臟切片，可見其細胞破裂，輪廓不清晰，細胞核破裂，核固縮，肝竇間隙增大，中央靜脈管擴張;圖1c為納米硒保護組的肝臟切片，可見其一部分肝細胞處于正常狀態(tài)，小部分被破壞;納米硒治療組（圖1d）和納米硒預(yù)防組（圖1e）肝細胞比鉻中毒組的肝細胞狀態(tài)好。

2.3? Rt-qPCR

圖2顯示了35 d肉雞肝細胞內(nèi)ACACA基因的相對表達水平。與空白對照組比較，鉻中毒組的ACACA基團表達水平顯著升高（P<0.01）。與鉻中毒組相比，納米硒對照組、納米硒保護組、納米硒治療組及納米硒預(yù)防組的肝臟樣本中的ACACA基因相對表達水平顯著下調(diào)（P<0.05）。

圖3顯示了35 d肉雞肝臟的CPT1A基因相對表達水平。與空白對照組相比，鉻中毒組CPT1A基因相對表達水平顯著降低（P<0.01）。與鉻中毒組相比，添加納米硒的4個組CPT1A 相對表達水平均顯著上調(diào)（P<0.05）。

3? 討論

通過納米硒預(yù)防和治療肉雞鉻中毒試驗可知，使用納米硒添加劑之后，肉雞的體重、毛色、肝臟病理狀態(tài)都有所好轉(zhuǎn);ACACA和CPT1A兩個基因的表達水平比鉻中毒狀態(tài)下的改變幅度降低。由此可知，納米硒對肉雞鉻中毒有預(yù)防和保護作用，該結(jié)論可為今后研究肉雞鉻中毒的機理提供參考。

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