熟畜肉中金黃色葡萄球菌污染標(biāo)記物動(dòng)態(tài)變化及與菌體生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)分析

胡凱麗,陳 娟,唐俊妮,代義闖,左子珍

(西南民族大學(xué),四川成都 610041)

金黃色葡萄球菌在自然界中廣泛存在,在空氣、水、灰塵、人和動(dòng)物的排泄物中都可以找到,因此金黃色葡萄球菌極易污染食物。熟肉制品因其方便美味,受到廣大消費(fèi)者的普遍喜愛,但是熟肉制品在加工、運(yùn)輸、銷售的過(guò)程中往往極易受到金黃色葡萄球菌的污染,從而引發(fā)食物中毒。容冬麗等[1]對(duì)我國(guó)15個(gè)代表性城市的即食食品中金黃色葡萄球菌污染調(diào)查表明,鹵肉中污染率為16.3%,烤肉為9.2%。魯延迅等[2]報(bào)道了吉林長(zhǎng)春市熟豬肉和熟牛肉制品中金黃色葡萄球菌污染率分別為31.1%和21.3%。Young等[3]從香港商店采集的50份烤豬肉樣品中檢出25份(50%)受到金黃色葡萄球菌的污染。許振偉等[4]對(duì)上海市場(chǎng)抽樣調(diào)查發(fā)現(xiàn),醬肉制品和腌臘肉制品中金黃色葡萄球菌污染率為23.1%和19.1%?？梢?熟肉制品中金黃色葡萄球菌的污染率很高,對(duì)廣大消費(fèi)者的生命健康存在安全隱患。

一直以來(lái),傳統(tǒng)培養(yǎng)法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(Polymerase chain reaction,PCR)都是常用的微生物鑒定方法。然而,傳統(tǒng)培養(yǎng)法存在操作繁瑣、耗時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn),PCR方法也存在假陽(yáng)性率較高、食物樣品前處理復(fù)雜等不足之處。隨著代謝組學(xué)研究技術(shù)的逐漸成熟,尋找食源性致病微生物的特征性代謝產(chǎn)物及代謝產(chǎn)物譜已成為致病菌快速檢測(cè)和鑒定研究的一個(gè)重要方向。學(xué)者們建議將食源性致病菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物分析作為臨床和食品中致病菌鑒別的替代方法[5-6]。細(xì)菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物是由復(fù)雜的揮發(fā)性化學(xué)成分組成,包括各種不同化學(xué)結(jié)構(gòu)和極性的揮發(fā)性化合物[7]。盡管某些種或?qū)俚募?xì)菌被發(fā)現(xiàn)存在著交迭的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物類型,但各種或?qū)俚募?xì)菌都有著獨(dú)特的代謝方式,典型的揮發(fā)性成分和揮發(fā)性特征必定是種或?qū)偬赜械?可以視為鑒別的生物標(biāo)志[8]。常見致病菌揮發(fā)性代謝輪廓的多元統(tǒng)計(jì)分析表明,金黃色葡萄球菌具有區(qū)別于其他致病菌的典型揮發(fā)性代謝特征[9-10]。在金黃色葡萄球菌胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)物的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物中,3-甲基丁醛、3-甲基丁酸、甲硫醇和3-羥基-2-丁酮的產(chǎn)生量顯著高于培養(yǎng)基中的本底值,是金黃色葡萄球菌釋放的主要代謝產(chǎn)物[11]。Bos等[12]綜合分析了大量文獻(xiàn)得出,3-甲基丁醛和3-甲基丁酸是金黃色葡萄球菌的特征揮發(fā)性代謝產(chǎn)物。本課題組的前期研究也發(fā)現(xiàn),金黃色葡萄球菌的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)物產(chǎn)生了3-甲基丁醛和3-甲基丁酸,且產(chǎn)量顯著高于其它致病菌[13]。因此,本研究將這兩個(gè)化合物作為金黃色葡萄球菌的揮發(fā)性標(biāo)記物。

本研究采集不同來(lái)源和部位的豬肉、牛肉和羊肉,分別調(diào)查肉中兩個(gè)標(biāo)記物的本底值范圍;然后分別接種金黃色葡萄球菌,動(dòng)態(tài)測(cè)定標(biāo)記物的信號(hào)強(qiáng)度以及金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)數(shù)量,旨在探索標(biāo)記物的釋放規(guī)律及與金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的關(guān)聯(lián)性,揭示不同類型的肉基質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)和代謝的影響,為建立基于揮發(fā)性標(biāo)記物的肉中金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)技術(shù)提供基礎(chǔ)科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金黃色葡萄球菌參考菌株StaphylococcusaureusATCC 6538 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection);胰蛋白胨大豆肉湯(Tryptone Soy Broth,TSB)培養(yǎng)基,Baird-Parker(BP)瓊脂基礎(chǔ)、亞碲酸鹽卵黃增菌液 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;豬精瘦肉、牛精瘦肉、羊精瘦肉(見表2～表3) 成都及周邊的超市、便利店、零售肉攤和公司。

Trace DSQ型GC-MS聯(lián)用儀(配置Triplus自動(dòng)進(jìn)樣器) 美國(guó)Thermo公司;MOF-4086S低溫冰箱、MLS-3020高壓蒸汽滅菌鍋 日本三洋公司;SW-CJ-1F超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;DHG-9203A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司;GHP-9280 隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;HZQ-F160恒溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;50/30 μm碳分子篩/二乙基苯/聚二甲基硅氧烷(carboxen/divinylbenzene/polydimethylsiloxane,DVB/CAR/PDMS)萃取頭 美國(guó)Supelco公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料肉的預(yù)處理 將購(gòu)買的豬精瘦肉、牛精瘦肉和羊精瘦肉經(jīng)絞肉機(jī)絞碎后,分別稱取豬肉糜、牛肉糜和羊肉糜5.00 g裝入頂空瓶中,使用硅膠塞封口,經(jīng)高壓蒸汽滅菌(121 ℃,101 kPa,15 min)后放入干燥箱中50 ℃下干燥20 h,至瓶?jī)?nèi)肉樣品無(wú)汁液,得到無(wú)菌的熟肉樣品。

1.2.2 樣品的制備

1.2.2.1 基質(zhì)本底樣品 采集不同地點(diǎn)和部位的豬精瘦肉20份(6份里脊肉、4份前腿肉、4份后腿肉、3份前夾肉和3份腰柳肉)、牛精瘦肉20份(5份瓜條肉、3份牛肩肉、2份牛腩肉、3份后腿肉、1份筋肉、1份背柳肉、1份里脊肉、1份前夾肉、2份前腿肉和1份腰柳肉)、羊精瘦肉20份(3份羊背肉、7份羊腿肉、2份羊臂肉、2份羊脖肉、3份羊肩肉、1份羊腹肉和1份羊排肉),經(jīng)預(yù)處理后作為基質(zhì)本底樣品。

1.2.2.2 金黃色葡萄球菌污染樣品 吸取金黃色葡萄球菌冷凍保藏菌液50 μL接種入5 mL TSB培養(yǎng)基中,于(37±1) ℃,200 r/min條件下培養(yǎng)13 h。用接種環(huán)鉤取一環(huán)金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液在BP平板上劃線,于(37±1) ℃條件下培養(yǎng)(24±1) h,直到平板上長(zhǎng)出灰黑色并帶有溶菌環(huán)的典型菌落。挑取具有金黃色葡萄球菌典型特征的單菌落接入5 mL TSB培養(yǎng)基中,于(37±1) ℃,200 r/min條件下培養(yǎng)13 h。然后,將該新鮮培養(yǎng)物進(jìn)行梯度稀釋至10-7,吸取10-7菌懸液300 μL分別接入5.00 g熟豬肉糜、牛肉糜和羊肉糜中,使初始接種量達(dá)到100～200 CFU/g,于(37±1) ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h,每隔2 h取樣測(cè)定揮發(fā)性標(biāo)記物和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)數(shù)量,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做3個(gè)平行樣品。以不接種金黃色葡萄球菌的肉樣為空白樣品,進(jìn)行兩次重復(fù)試驗(yàn)。

1.2.3 揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的測(cè)定

1.2.3.1 萃取條件 采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭,在80 ℃預(yù)孵化10 min,萃取30 min[14]。

1.2.3.2 氣相色譜分析條件 TR-FF AP色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);不分流模式,不分流1 min之后分流比為50︰1;流速1 mL/min;升溫程序:40 ℃保持3 min,以7 ℃/min 升溫至220 ℃并保持2 min;載氣為99.999%氦氣;進(jìn)樣口溫度230 ℃;解吸時(shí)間2 min[14]。

1.2.3.3 質(zhì)譜分析條件 電子電離源,電子能量70 eV;離子源溫度250 ℃;傳輸線溫度220 ℃;選擇離子流掃描模式(SIM),參數(shù)見表1。

表1 選擇離子流掃描參數(shù)Table 1 Selective ion flow scan parameters

1.2.4 金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)數(shù)量測(cè)定 將5.00 g樣品用45 mL生理鹽水稀釋,再經(jīng)10倍梯度稀釋至適宜的稀釋度,采用平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)數(shù)量的測(cè)定。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做3個(gè)平行樣品,進(jìn)行兩次重復(fù)試驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 揮發(fā)性標(biāo)記物響應(yīng)強(qiáng)度 通過(guò)Thermo Xcalibur 2.2SP1.48軟件報(bào)告標(biāo)記物的峰面積,對(duì)于每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn),用金黃色葡萄球污染樣品的峰面積值扣除肉樣空白值后,再求平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差,用Excel 2003繪制揮發(fā)性標(biāo)記物釋放規(guī)律圖。

1.3.2 金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)數(shù)量 對(duì)于每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn),金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)數(shù)量求平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差,用Excel 2003繪制細(xì)菌生長(zhǎng)變化圖。

1.3.3 金黃色葡萄球菌在不同熟畜肉中揮發(fā)性標(biāo)記物釋放與菌體生長(zhǎng)相關(guān)性 采用SPSS 18.0 對(duì)培養(yǎng)過(guò)程中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)數(shù)量與揮發(fā)性標(biāo)記物響應(yīng)強(qiáng)度之間做Spearman相關(guān)分析,p<0.01表示差異極顯著,p<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種熟畜肉基質(zhì)本底調(diào)查結(jié)果

試驗(yàn)所用豬肉、牛肉和羊肉樣品均采自不同來(lái)源和不同部位,樣品的揮發(fā)性標(biāo)記物信號(hào)強(qiáng)度各不相同。豬肉樣品的3-甲基丁醛信號(hào)強(qiáng)度小于5×106counts×sec,3-甲基丁酸的信號(hào)強(qiáng)度與3-甲基丁醛相近,小于4×106counts×sec(見表2);牛肉樣品的3-甲基丁醛信號(hào)強(qiáng)度小于2×107counts×sec,3-甲基丁酸的信號(hào)強(qiáng)度小于6×106counts×sec(見表3);羊肉樣品的3-甲基丁醛信號(hào)強(qiáng)度小于3×107counts×sec,3-甲基丁酸的信號(hào)強(qiáng)度明顯低于3-甲基丁醛,小于4×106counts×sec(見表4)。另外,在檢測(cè)的20個(gè)牛肉和羊肉樣品中有少數(shù)幾個(gè)樣品的3-甲基丁醛信號(hào)強(qiáng)度高于107counts×sec,而在檢測(cè)的所有豬肉樣品中3-甲基丁醛信號(hào)強(qiáng)度均小于107counts×sec。

表2 熟豬肉中標(biāo)記物本底調(diào)查結(jié)果Table 2 Survey results of the signal intensities of volatile markers from cooked pork

表3 熟牛肉中標(biāo)記物本底調(diào)查結(jié)果Table 3 Survey results of the signal intensities of volatile markers from cooked beef

表4 熟羊肉中標(biāo)記物本底值的調(diào)查結(jié)果Table 4 Survey results of the signal intensities of volatile markers from cooked mutton

2.2 金黃色葡萄球菌在不同畜肉基質(zhì)中揮發(fā)性標(biāo)記物釋放與菌體生長(zhǎng)情況

2.2.1 熟豬肉中金黃色葡萄球菌揮發(fā)性標(biāo)記物釋放與菌體生長(zhǎng)情況 試驗(yàn)所用豬肉空白樣品的3-甲基丁醛信號(hào)強(qiáng)度是1.76×105counts×sec,3-甲基丁酸信號(hào)強(qiáng)度是2.56×105counts×sec,在表2豬肉本底值范圍以內(nèi)。由圖1可知,金黃色葡萄球菌在熟豬肉上生長(zhǎng)時(shí),37 ℃培養(yǎng)至12 h時(shí)3-甲基丁醛出現(xiàn)首次顯著增長(zhǎng)(p<0.05),到18 h時(shí),3-甲基丁醛的累積強(qiáng)度達(dá)到最大值(2.22×107counts×sec),18～24 h,3-甲基丁醛的強(qiáng)度迅速降低至0。3-甲基丁酸信號(hào)培養(yǎng)至14 h時(shí)出現(xiàn)首次顯著增長(zhǎng)(p<0.05),之后逐漸上升,直至24 h達(dá)到2.48×107counts×sec。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中,3-甲基丁醛的信號(hào)檢測(cè)時(shí)間略早于3-甲基丁酸,3-甲基丁醛的信號(hào)強(qiáng)度增至最大值后迅速下降至0,而3-甲基丁酸的信號(hào)強(qiáng)度呈持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)。由圖2可知,在熟豬肉上,37 ℃下金黃色葡萄球菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期約在2～14 h之間,之后進(jìn)入穩(wěn)定期,最終菌體生長(zhǎng)量可以達(dá)到1.75×109CFU/g。

圖1 熟豬肉中金黃色葡萄球菌揮發(fā)性標(biāo)記物的釋放規(guī)律

圖2 熟豬肉中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)情況

2.2.2 熟牛肉中金黃色葡萄球菌揮發(fā)性標(biāo)記物釋放與菌體生長(zhǎng)情況 試驗(yàn)所用牛肉空白樣品的3-甲基丁醛信號(hào)強(qiáng)度是2.75×106counts×sec,3-甲基丁酸信號(hào)強(qiáng)度是2.95×105counts×sec,在表3牛肉本底值范圍以內(nèi)。由圖3可知,金黃色葡萄球菌在熟牛肉上生長(zhǎng)時(shí),37 ℃培養(yǎng)至12 h時(shí),3-甲基丁醛出現(xiàn)首次顯著增長(zhǎng)(p<0.05),到18 h時(shí)3-甲基丁醛的累積強(qiáng)度達(dá)到最大值(4.48×107counts×sec),從18 h到24 h,3-甲基丁醛的強(qiáng)度迅速降低至0。3-甲基丁酸的信號(hào)培養(yǎng)至14 h時(shí)出現(xiàn)首次顯著增長(zhǎng)(p<0.05),之后逐漸上升,直至24 h達(dá)到3.27×107counts×sec。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中,3-甲基丁醛的信號(hào)檢測(cè)時(shí)間略早于3-甲基丁酸,3-甲基丁醛的信號(hào)強(qiáng)度增至最大值后迅速下降至0,而3-甲基丁酸的信號(hào)強(qiáng)度呈持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)。由圖4可知,在熟牛肉上,金黃色葡萄球菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期約在2～16 h之間,之后進(jìn)入穩(wěn)定期,最終菌體生長(zhǎng)量可以達(dá)到1.96×109CFU/g。

圖3 熟牛肉中金黃色葡萄球菌揮發(fā)性標(biāo)記物的釋放規(guī)律

圖4 熟牛肉中金黃色葡萄球菌的菌體生長(zhǎng)情況

2.2.3 熟羊肉中金黃色葡萄球菌揮發(fā)性標(biāo)記物釋放與菌體生長(zhǎng)情況 試驗(yàn)所用羊肉空白樣品的3-甲基丁醛信號(hào)強(qiáng)度是3.85×106counts×sec,3-甲基丁酸信號(hào)強(qiáng)度是6.74×105counts×sec,在表4羊肉本底值范圍以內(nèi)。由圖5可知,金黃色葡萄球菌在熟羊肉上生長(zhǎng)時(shí),37 ℃培養(yǎng)至12 h時(shí),3-甲基丁醛出現(xiàn)首次顯著增長(zhǎng)(p<0.05),到18 h時(shí),3-甲基丁醛的累積強(qiáng)度達(dá)到最大值(8.05×107counts×sec),從18 h到24 h,3-甲基丁醛的強(qiáng)度迅速降低至0。3-甲基丁酸的信號(hào)培養(yǎng)至14 h時(shí),出現(xiàn)首次顯著增長(zhǎng)(p<0.05),之后逐漸上升,直至24 h達(dá)到6.33×107counts×sec。在培養(yǎng)過(guò)程中,3-甲基丁醛的信號(hào)檢測(cè)時(shí)間早于3-甲基丁酸,3-甲基丁醛的信號(hào)強(qiáng)度增至最大值后迅速下降至0,而3-甲基丁酸的信號(hào)強(qiáng)度在24 h內(nèi)持續(xù)增長(zhǎng)。由圖6可知,在熟羊肉上,金黃色葡萄球菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期約在2～14 h之間,之后進(jìn)入穩(wěn)定期,最終菌體生長(zhǎng)量可以達(dá)到2.84×109CFU/g。

圖5 熟羊肉中金黃色葡萄球菌揮發(fā)性標(biāo)記物的釋放規(guī)律

圖6 熟羊肉中金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)情況

2.2.4 揮發(fā)性標(biāo)記物出現(xiàn)首次顯著增長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)水平分析 由圖1～圖6可知，在熟豬肉中,3-甲基丁醛首次顯著(p<0.05)增長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)數(shù)量為2.68×107CFU/g,3-甲基丁酸首次顯著增長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)數(shù)量為7.35×107CFU/g。在熟牛肉中,金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)至1.67×107CFU/g時(shí),3-甲基丁醛出現(xiàn)首次增長(zhǎng),金黃色葡萄球菌菌體達(dá)到1.85×108CFU/g時(shí),3-甲基丁酸出現(xiàn)首次增長(zhǎng)。在熟羊肉中,3-甲基丁醛首次顯著增長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)數(shù)量為1.25×107CFU/g,3-甲基丁酸首次顯著(p<0.05)增長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)數(shù)量為8.65×107CFU/g。可見,當(dāng)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)達(dá)到107CFU/g時(shí)3-甲基丁醛信號(hào)可被明顯檢出,而3-甲基丁酸信號(hào)則需要金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)量接近108CFU/g時(shí)才可被明顯檢測(cè)到。

2.3 金黃色葡萄球菌在不同熟畜肉中揮發(fā)性標(biāo)記物釋放與菌體生長(zhǎng)相關(guān)分析

鑒于金黃色葡萄球菌在熟豬肉、熟牛肉和熟羊肉中培養(yǎng)18 h之后,3-甲基丁醛的信號(hào)強(qiáng)度均顯著降低(p<0.05),針對(duì)0～18 h培養(yǎng)過(guò)程,檢測(cè)到3-甲基丁醛的信號(hào)強(qiáng)度與細(xì)菌菌體生長(zhǎng)數(shù)量之間均呈極顯著相關(guān)(p<0.01,見表5)。在0～24 h整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中,檢測(cè)到3-甲基丁酸的信號(hào)強(qiáng)度與細(xì)菌菌體生長(zhǎng)數(shù)量之間均呈極顯著相關(guān)(p<0.01,見表5)。

表5 三種熟肉中金黃色葡萄球菌揮發(fā)性 標(biāo)記物與菌體生長(zhǎng)的Spearman相關(guān)系數(shù)Table 5 Spearman correlation coefficients of volatile markers and bacterial growth on three cooked meats

3 討論

徐薇薇等[15]報(bào)道了3-甲基丁醛是寧夏灘羊后腿肉的關(guān)鍵風(fēng)味成分之一。Takakura等[16]采用二乙醚萃取結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜分析牛肉的風(fēng)味物質(zhì),得到3-甲基丁酸是對(duì)牛肉風(fēng)味有積極貢獻(xiàn)的香味活性化合物。Inagaki等[17]分析了日本神戶牛肉和澳洲牛肉的風(fēng)味特征,從兩種牛肉樣品中均檢出3-甲基丁酸。再者,不同的烹飪條件包括加熱溫度和加熱時(shí)間等都會(huì)影響到肉質(zhì)化學(xué)反應(yīng)的類型和程度,進(jìn)而直接影響風(fēng)味物質(zhì)的形成。Pulgar等[18]發(fā)現(xiàn),在真空低溫烹調(diào)豬肉時(shí),與60 ℃相比,80 ℃烹飪的豬肉樣品被檢出更高含量的3-甲基丁醛,進(jìn)而推測(cè)加熱溫度越高越利于氨基酸的降解反應(yīng)產(chǎn)生更高含量的3-甲基丁醛。張迪雅等[19]也得出,與60 ℃加熱相比,120 ℃加熱的牛肉中3-甲基丁醛明顯增多。3-甲基丁醛是亮氨酸的Strecker降解產(chǎn)物,3-甲基丁醛進(jìn)一步氧化則形成3-甲基丁酸。本實(shí)驗(yàn)中采用的豬肉、牛肉和羊肉樣品都是經(jīng)過(guò)高壓滅菌處理(121 ℃,101 kPa,15 min),從三種肉樣中檢出一定強(qiáng)度的3-甲基丁醛和3-甲基丁酸,提示在建立基于揮發(fā)性標(biāo)記物檢測(cè)肉中金黃色葡萄球菌方法時(shí)首先要考慮肉的本底值情況。

本研究結(jié)果得出,3-甲基丁醛和3-甲基丁酸出現(xiàn)首次顯著(p<0.05)增長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)量分別約為107和108CFU/g。同樣,在Filipiak等[11]的研究中也指出,金黃色葡萄球菌在TSB中培養(yǎng)時(shí),菌體生長(zhǎng)量分別達(dá)到7×106和5×107CFU/mL時(shí)3-甲基丁醛和3-甲基丁酸才出現(xiàn)首次顯著增長(zhǎng)。Hettinga等[20]研究也表明,在牛乳中,金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)達(dá)到107CFU/mL時(shí)其典型的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物才會(huì)積累達(dá)到可檢測(cè)水平。這說(shuō)明,只有當(dāng)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)水平達(dá)到某個(gè)閾值時(shí),揮發(fā)性代謝產(chǎn)物才會(huì)出現(xiàn)明顯增長(zhǎng)。對(duì)于其他微生物而言,揮發(fā)性代謝產(chǎn)物釋放特征也有相似報(bào)道[21]。研究已證實(shí),食物中金黃色葡萄球菌數(shù)量高于105CFU/(g或mL)是腸毒素產(chǎn)生的必要條件,腸毒素是引發(fā)葡萄球菌食物中毒的主要原因[22]。因此,推測(cè)3-甲基丁醛和3-甲基丁酸在作為金黃色葡萄球菌污染食物的標(biāo)記物的同時(shí),該兩個(gè)標(biāo)記物的檢出還可以指示食物的不安全狀態(tài)。

隨著當(dāng)前檢測(cè)技術(shù)手段和統(tǒng)計(jì)分析方法的不斷完善,氣味指紋技術(shù)和氣味標(biāo)記物技術(shù)在肉品品質(zhì)及安全檢測(cè)中具有廣闊的應(yīng)用前景[23]。該技術(shù)具有敏感、快速、樣品用量少、操作簡(jiǎn)單、不采用溶劑等優(yōu)勢(shì),滿足肉品安全的在線檢測(cè)需要。金偉平等[24]采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法分析了單核細(xì)胞增生李斯特菌污染冷藏牛肉的揮發(fā)性物質(zhì),找出了可以表征冷藏牛肉被單增李斯特菌污染的特征性氣味物質(zhì)。Xu等[25-26]對(duì)自然污染和人工污染鼠傷寒沙門氏桿菌的豬肉進(jìn)行了揮發(fā)性和非揮發(fā)性代謝物質(zhì)分析,不僅采用多元統(tǒng)計(jì)分析能將兩類樣品區(qū)分開,還鑒定出了準(zhǔn)確區(qū)分兩類樣品的17個(gè)非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物和16個(gè)揮發(fā)性代謝產(chǎn)物。這些研究報(bào)道說(shuō)明,肉品營(yíng)養(yǎng)豐富,易受微生物污染,其次級(jí)代謝產(chǎn)物會(huì)產(chǎn)生特定的揮發(fā)性氣味物質(zhì),基于這點(diǎn)可以利用氣味技術(shù)檢測(cè)肉中的微生物。然而,目前未見金黃色葡萄球菌污染肉的氣味檢測(cè)技術(shù)報(bào)道。在前期研究基礎(chǔ)上,本研究以3-甲基丁醛和3-甲基丁酸為金黃色葡萄球菌的揮發(fā)性標(biāo)記物,發(fā)現(xiàn)在不同類型的畜肉中金黃色葡萄球菌標(biāo)記物釋放與細(xì)菌生長(zhǎng)均呈現(xiàn)良好的相關(guān)性,說(shuō)明畜肉的類型不會(huì)影響標(biāo)記物釋放與菌體生長(zhǎng)的關(guān)聯(lián),為建立基于揮發(fā)性標(biāo)記物的金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

4 結(jié)論

從熟豬肉、牛肉和羊肉基質(zhì)中均檢出一定強(qiáng)度的揮發(fā)性標(biāo)記物(3-甲基丁醛和3-甲基丁酸),檢測(cè)值只有明顯高于此本底值時(shí),才可判定肉中存在金黃色葡萄球菌污染。金黃色葡萄球菌在畜肉中生長(zhǎng)時(shí),菌體生長(zhǎng)量分別達(dá)到107、108CFU/g 時(shí)才能明顯檢測(cè)到3-甲基丁醛和3-甲基丁酸信號(hào)的增長(zhǎng),分別在0～18 h和0～24 h 培養(yǎng)期間,3-甲基丁醛和3-甲基丁酸釋放與菌體生長(zhǎng)極顯著相關(guān)(p<0.01)。