紫色小白菜有機酸的提取優(yōu)化及UPLC定量分析

陳 露，李家明，林志強，鐘鳳林*，許 茹，黃晨馨，周相助，林義章

1福建農(nóng)林大學園藝學院，福州 350002；2福建省種子管理總站，福州 350000

紫色小白菜(Brassicacampestrisssp.chinensisvar.comunisTsen et Lee)屬十字花科蕓薹屬白菜種，是小白菜的變種[1]。該品種葉片正面紫色，背面綠色，葉脈紫色，葉柄翠綠色，富含花青苷，營養(yǎng)價值高，可作為蔬菜色拉直接食用，深受消費者喜愛[2]。有機酸作為紫色小白菜的主要營養(yǎng)成分之一，具有軟化血管，幫助胃液消化脂肪和蛋白質(zhì)，促進鈣、鐵元素的吸收之功效，對預防疾病和促進新陳代謝等也具有很好的輔助療效[3]。因此，紫色小白菜有機酸的提取和定量分析具有重要的研究意義。

有機酸的提取方法主要有水提法、微波萃取法、生物酶提取法和超聲波提取法。其中，超聲波提取法具有提取時間短、效率高、操作簡單等優(yōu)點[4]，已廣泛運用于中草藥[5]、黃酮[6]、多糖[7]、花青素[8]等領域。超聲波提取法涉及到物料、超聲時間、超聲溫度等多種影響因素。響應面法在單因素試驗基礎上，通過響應面試驗設計，分析各因素交互作用的影響，具合理的試驗設計和優(yōu)良的精密度，在多糖、黃酮、花青素等天然產(chǎn)物的提取都獲得了最佳提取工藝。利用最佳提取工藝，對紫色小白菜有機酸的定性定量分析具有重要意義。超高效液相色譜法(UPLC法)測定有機酸前處理簡單，且能同時測定多種有機酸，操作簡單，分析結果良好，目前已廣泛運用于果實[9]、煙草[10]等領域。本研究針對紫色小白菜中的有機酸，采取超聲波提取法結合響應面分析法優(yōu)化提取工藝，并通過UPLC法分析有機酸組分及含量，旨在探究紫色小白菜有機酸提取的最優(yōu)工藝條件并進行定性定量分析，為深入研究及推廣紫色小白菜的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為京研益農(nóng)農(nóng)業(yè)科技有限公司的‘京研’紫色小白菜。

紫色小白菜于2018年9～11月種植于福建農(nóng)林大學蔬菜研究所，將新鮮紫色小白菜(切除根系部分)于烘箱內(nèi)110 ℃殺青30 min，然后于70 ℃恒溫條件下烘干至恒重，用粉碎機粉碎，過40目篩后，保存于-80 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.2 儀器與設備

ACQUITY UPLC?(美國WATERS公司)超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有自動進樣器、WATERS?EMPOWER?3分析軟件、QDa檢測器、ACQ-TUV紫外檢測器；ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱，2.1×100 mm，1.7 μm；FW200型高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SIGMA 3-30K高速離心機(美國SIGMA公司)；IKA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(廣州艾卡儀器設備有限公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)等。

1.3 方法

1.3.1 有機酸浸提的工藝路線

稱取紫色小白菜樣品烘干粉末，按料液比加入乙醇溶劑漩渦震蕩，在一定溫度下超聲輔助提取一段時間，離心后吸取上清液，洗滌沉淀兩次并合并濾液，將所得濾液蒸發(fā)濃縮即為待測液。

1.3.2 有機酸提取工藝單因素優(yōu)化試驗

紫色小白菜烘干樣品粉末分別對超聲時間、乙醇濃度、料液比和超聲溫度4個因素進行優(yōu)化，各因素水平設計見表1。

表1 單因素試驗設計Table 1 Design of single factor experiment

1.3.3 響應面法設計試驗

在單因素試驗的基礎上，采用中心組合試驗設計進行響應面分析試驗見表2。試驗數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0 軟件進行分析，確定紫色小白菜有機酸提取的最優(yōu)工藝參數(shù)，并采用最優(yōu)工藝參數(shù)對紫色小白菜有機酸提取進行驗證。

表2 響應面試驗因素水平Table 2 Factors in RSM experiment

1.3.4 有機酸含量測定

采用陳琦等[11]沒食子酸標準曲線，在最大吸收波長730 nm下分別測定不同濃度沒食子酸吸光值。以沒食子酸含量C對吸光度A進行回歸，得到回歸方程：A=1.784 4C+0.000 3和相關系數(shù)R2=0.999 6。按回歸方程計算總有機酸含量，計算公式如下：

其中，C為根據(jù)標準曲線計算出的總有機酸含量(mg)，VT為提取液總體積(mL)，N為稀釋倍數(shù)，m為紫色小白菜質(zhì)量(g)，VS為測定時樣品提取液體積(mL)。

1.3.5 有機酸定性及定量分析

取待測液經(jīng)0.22 μm的水相微孔濾膜過濾，采用超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行檢測。色譜條件：色譜柱ACQUITY UPLC?BEH C18柱(2.1×100 mm，1.7 μm)；流動相A為0.1% 甲酸/水，流動相B為0.1% 甲酸/乙腈；流速0.25 mL/min；柱溫30 ℃；進樣體積3 μL；檢測波長210 nm；采用等梯度洗脫程序0～6 min 99% 體積濃度的0.1% 甲酸/水+1% 甲酸/乙腈；掃描方式：負離子掃描；積分方式：母離子積分。

測得蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、丙二酸、酒石酸標準曲線分別為：y= 24 925x+ 5 835.7(R2= 0.995 4)；y= 34 446x+ 10 370(R2= 0.996 9)；y= 23 113x+ 1 014.3(R2= 0.993 6)；y= 5 472.2x+ 231.13(R2= 0.990 8)；y= 44 233x+2 478.9(R2= 0.996 9)，x代表UPLC-MS中所測定有機酸的峰面積，y代表所測有機酸濃度(mg/mL)[12]。經(jīng)計算獲取供試樣品中的有機酸類物質(zhì)的含量，計算公式如下：

其中C為標準曲線上所查濃度(mg/mL)；V為樣品定容體積(mL)；M干樣為樣品干重(g)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert v8.0.6 軟件進行響應面中心組合試驗設計，采用DPS(7.05)軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，用LSD法進行差異顯著性分析，顯著性水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

通過對超聲時間、乙醇濃度、料液比、超聲溫度4個因素進行試驗，結果表明，超聲時間10 min，乙醇濃度70%，料液比1∶20，超聲溫度70 ℃是紫色小白菜有機酸提取單因素試驗的最優(yōu)條件。如圖1所示，隨著超聲時間的延長、乙醇濃度的升高、料液比的增加、超聲溫度的上升，有機酸得率均呈先增加后減少的趨勢。在超聲時間為10 min時有機酸得率達到最大，超過10 min后，有機酸得率隨時間延長而減少。這可能是因為超聲時間過長導致其他物質(zhì)的溶出或揮發(fā)性有機酸發(fā)生降解。乙醇濃度達到70%后，有機酸得率隨乙醇濃度的增加而減少。伴隨乙醇濃度的增加，脂溶性色素的含量也會增加，從而減少有機酸得率。在料液比為1∶20時有機酸得率達到最大。當料液比增加到一定量趨于飽和狀態(tài)后，再增加料液比反而導致其他物質(zhì)的溶出，從而減少有機酸得率。超聲溫度為70 ℃時有機酸得率達到最大。溫度持續(xù)升高可能會導致有機酸類物質(zhì)穩(wěn)定性下降。

圖1 單因素對有機酸得率的影響Fig.1 Effects of factors on the yield of organic acids注：A超聲時間(min)，B乙醇濃度(%)，C料液比(mg/g)，D超聲溫度(℃)。Note:A Ultrasonic time (min),B Ethanol concentration (%),C Ratio of solid to liquid (mg/g),D Ultrasonic temperature (℃).

2.2 響應面試驗設計與結果

在單因素試驗的基礎上，探究各因素之間的交互作用對紫色小白菜有機酸得率的影響(表3)。以超聲時間(A)、乙醇濃度(B)、料液比(C)、超聲溫度(D)為影響因素，以有機酸得率(mg/g)為響應值，設計4因素3水平試驗(共29個試驗點，其中5個重復試驗點用以估計誤差)，并通過Design-Expert 8.0軟件對響應面試驗結果進行分析，經(jīng)回歸擬合得到二次回歸方程：

Y=19.95+0.23A+0.48B+0.33C-0.18D+0.11AB+0.097AC-0.032AD-0.23BC+0.24BD-0.13CD-0.79A2-0.78B2-1.16C2-1.33D2。

表3 有機酸提取的試驗設計與結果Table 3 The experimental design and results of organic acid extraction

2.3 響應面分析

根據(jù)紫色小白菜有機酸得率的回歸模型作出三維響應面圖和等高曲線圖(圖2)，每個響應面對其中兩個因素進行分析，另外兩個因素固定在零水平[14,15]。通過三維圖與二維圖可以直觀地將不同因素對紫色小白菜有機酸得率的影響及各因素之間交互作用表現(xiàn)出來。響應曲面傾斜度越大，坡度越陡，表明該因素對紫色小白菜有機酸得率的影響越顯著。等高線形狀越接近橢圓形，表明兩個因素之間的交互作用對有機酸得率的影響越顯著[16,17]。

通過Design-Expert 8.0軟件對紫色小白菜有機酸提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化分析，得到預測的提取最佳工藝條件：乙醇濃度為73%，料液比為1∶20.6，超聲時間為10.9 min，超聲溫度為69.5 ℃，此時預測

表4 中心組合試驗的方差分析Table 4 ANOVA analysis of central composite test

注：**P<0.01；*P<0.05。

有機酸得率可達到20.065 mg/g?？紤]到實際操作的局限性，將提取工藝條件中乙醇濃度優(yōu)化為73%，料液比為1∶21，超聲時間為11 min ，超聲溫度為70 ℃ ，在此條件下，重復試驗5次，紫色小白菜中有機酸的得率為19 .686 mg/g，與預測值基本符合，證實了該方程的準確性和實用性。

2.4 有機酸定性及定量分析

采用超高效液相色譜法測定紫色小白菜中有機酸含量，樣品峰圖如圖3。參考周相助[18]有機酸標準品回歸方程及相關系數(shù)，各有機酸組分的相關系數(shù)在0.990 8～0.998之間，表明采用該方法測定有機酸類組分標準品其濃度與峰面積有良好的線性關系，可達到有機酸類物質(zhì)定性定量分析的要求。通過對樣品中有機酸峰圖的分析，定性地確定樣品中的有機酸，并根據(jù)標準曲線定量計算紫色小白菜中各有機酸組分含量[18,19]。

有機酸作為紫色小白菜中主要營養(yǎng)物質(zhì)之一，它的種類和含量既和蔬菜的風味、品質(zhì)有關，又為蔬菜加工貯藏提供重要依據(jù)，是一個重要的品質(zhì)指標。通過超高效液相定性及定量分析紫色小白菜可食用部分的有機酸，葉片和葉柄部位均檢測到五種有機酸，分別為蘋果酸、檸檬酸、丙二酸、琥珀酸和酒石酸(表5)。葉片中有機酸濃度從高到低的順序為：蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、酒石酸和丙二酸，其中蘋果酸、檸檬酸、丙二酸和酒石酸濃度均明顯高于葉柄。葉柄中有機酸濃度從高到低的順序為：蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、丙二酸和酒石酸。另外，葉片和葉柄部位均未檢測出順烏頭酸和丙酮酸，可能是因為含量低于儀器檢測范圍。

3 結論

利用超聲輔助提取，在單因素試驗的基礎上設計響應面試驗，針對超聲時間、乙醇濃度、料液比、超聲溫度進行工藝條件優(yōu)化，建立回歸模型進行參數(shù)優(yōu)化，結合實際操作，最終確定紫色小白菜有機酸提取工藝條件為乙醇濃度73%，料液比1∶21，超聲時間11 min ，超聲溫度70 ℃ ，在此條件下紫色小白菜中有機酸的得率為19.686 mg/g。模型擬合程度高，試驗誤差小，可用于實際預測。另外，通過超高效液相色譜法定性及定量分析紫色小白菜中有機酸類物質(zhì)，在葉片和葉柄部位均檢測到五種有機酸，分別為蘋果酸、檸檬酸、丙二酸、琥珀酸和酒石酸，其中蘋果酸含量最高，分別為15.968、5.019 mg/g，其次為檸檬酸。

圖2 各因素交互作用對有機酸得率影響的響應面圖和等高線圖Fig.2 Responses surface and contour plot for the effects of organic acid extraction注：A超聲時間(min)和乙醇濃度(%)，B超聲時間(min)和料液比(mg/g)，C超聲時間(min)和超聲溫度(℃)， D乙醇濃度(%)和料液比(mg/g)，E乙醇濃度(%)和超聲溫度(℃)，F(xiàn)料液比(mg/g)和超聲溫度(℃)。Note:A Ultrasonic time (min) and ethanol concentration (%),B Ultrasonic time (min) and ratio of solid to liquid (mg/g), C Ultrasonic time (min) and ultrasonic temperature (℃),D Ethanol concentration (%) and ratio of solid to liquid (mg/g), E Ethanol concentration (%) and ultrasonic temperature (℃),F Ratio of solid to liquid (mg/g) and ultrasonic temperature (℃).

圖3 超高效液相色譜圖Fig.3 UPLC chromatograms注：(A)樣品1-紫色小白菜葉片 a：酒石酸、b：蘋果酸、c：丙二酸、d：檸檬酸、e：琥珀酸；(B)樣品2-紫色小白菜葉柄。Note:(A) sample 1-purple cabbage leaves a.tartaric acid;b.malic acid;c.malonic acid; d.citric acid;e.succinic acid(B)sample 1-purple cabbage petioles.

表5 紫色小白菜樣品中有機酸含量分析(mg/g)Table 5 Analysis of organic acid contents in purple cabbage samples(mg/g)

本試驗利用響應面法對紫色小白菜有機酸提取工藝進行優(yōu)化，研究了紫色小白菜有機酸組分并進行定量分析，為紫色小白菜品質(zhì)評價提供良好技術平臺，為深入研究及推廣紫色小白菜的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供參考。