Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化三棱總黃酮的分離純化工藝研究Δ

匡宇，趙永艷，何沛煜，張軍銀，周燕，彭騰#，余成浩（.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地/中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 637；.成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，成都 637）

三棱藥材是指黑三棱科植物黑三棱（Sparganium stoloniferumBuch.-Ham.）的干燥塊莖[1]，其性平、味苦，歸肝、脾經(jīng)，具有破血行氣、消積止痛的功效，主治癥瘕痞塊、痛經(jīng)、瘀血經(jīng)閉、胸痹心痛、食積脹痛等疾病。現(xiàn)代臨床研究表明，三棱水煎液及其他炮制品具有抗血栓[2]、抗動脈粥樣硬化[3]、抗炎鎮(zhèn)痛[4]及改善腦缺血缺氧[5]等作用，三棱黃酮還具有抗腫瘤作用[6-7]。三棱化學(xué)成分復(fù)雜，結(jié)構(gòu)多樣，目前三棱中已知的化學(xué)成分按其結(jié)構(gòu)分類主要有揮發(fā)油、苯丙素類、黃酮類和生物堿類等，此外，還含有少量蒽醌、甾體及其他類化學(xué)成分[8]。

三棱中的黃酮成分是其重要有效成分之一[9]，已知三棱總黃酮類化合物有芒柄花素、山柰酚、四羥基黃酮醇-3-O-β-D-吡喃葡糖糖苷和異鼠李素-3-O-蕓香糖苷[10-11]等成分。近年來，三棱被廣泛地應(yīng)用于婦科疾病的治療中[12-13]。本課題組前期試驗(yàn)研究表明，三棱總黃酮對大鼠卵巢囊腫有一定的抑制作用[14]，因此，以三棱總黃酮為主要活性成分研究其治療婦科疾病的效果，對提高其臨床療效和研究其作用機(jī)制具有重要意義；但試驗(yàn)過程中課題組發(fā)現(xiàn)三棱總黃酮在生藥中含量過低，僅為生藥量的0.1%～0.4%[15]。筆者在此基礎(chǔ)上，以三棱總黃酮純化率為考察指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化三棱總黃酮的純化工藝，從而提高三棱總黃酮純化率，為三棱藥材的深入研究提供一定參考。

1 材料

1.1 儀器

BP211D電子天平（德國賽多利斯公司）；UV2600紫外-可見分光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮升華儀器廠）；BUJ25-12超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；DZKW-4電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；SHE-D循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

三棱藥材（批號：20180214）于2018年2月購于荷花池藥材市場，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)龍飛教授鑒定為Sparganium stoloniferumBuch.-Ham.的干燥塊莖；蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：2T25-JYG5，純度：91.9%）；大孔吸附樹脂（型號：DM130、HPD100、X-5、NKA-9、AB-8、HP20、D101）均購自滄州市同軒商貿(mào)有限公司；硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、無水乙醇等為分析純，水為超純水。

2 方法

2.1 三棱總黃酮提取液的制備

精密稱取三棱藥材適量，粉碎，過2號篩；稱取三棱粗粉40.0 g，置于500 mL圓底燒瓶中，加入8倍量70%乙醇，加熱至微沸狀態(tài)回流提取1.5 h，趁熱抽濾，重復(fù)提取2次，合并濾液得三棱提取液，備用；另按上述方法制備三棱總黃酮干浸膏（純度為4.25%）。

2.2 三棱總黃酮的含量測定

2.2.1 蘆丁對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品0.010 3 g，置于100 mL量瓶中，加適量70%乙醇超聲（頻率：50 kHz，功率：500 W，下同）溶解，放冷，再以70%乙醇補(bǔ)足至刻度，搖勻，即得0.103 mg/mL的蘆丁對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取“2.1”項(xiàng)下制備的干浸膏適量，再用適量70%乙醇溶解該浸膏，置于200 mL量瓶中，再以70%乙醇稀釋至刻度，即得供試品溶液。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密量取蘆丁對照品溶液5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 mL，置于25 mL量瓶中，精密加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加入10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加入氫氧化鈉試液10 mL，加70%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置15 min，得系列質(zhì)量濃度的對照品溶液，采用紫外分光光度法于480 nm波長處測定蘆丁吸光度，以對照品系列質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y＝0.084 2x+0.000 7（r＝0.999 8）。結(jié)果，蘆丁檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.020 6～0.041 2 mg/mL。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 精密量取蘆丁對照品溶液7 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下“精密加入5%……靜置15 min”方法操作后，于480 nm波長處連續(xù)測定蘆丁吸光度6次。結(jié)果，蘆丁吸光度的RSD為0.08%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液5 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下“精密加入5%……靜置15 min”方法操作后，于室溫下放置0、15、30、45、60 min后，于480 nm波長處測定蘆丁吸光度。結(jié)果，供試品溶液中蘆丁吸光度的RSD為1.18%（n＝5），表明供試品溶液在60 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取三棱粗粉5 g，置于100 mL圓底燒瓶，按“2.1”項(xiàng)下的方法制備6份，按“2.2.3”項(xiàng)下“精密加入5%……靜置15 min”方法操作后，于480 nm波長處分別測定蘆丁吸光度。結(jié)果，蘆丁吸光度RSD為1.99%（n＝6），表明重復(fù)性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取6份“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液5 mL（總黃酮含量為2.97 mg），轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，精密加入蘆丁對照品溶液20 mL，以70%乙醇補(bǔ)足至刻度，按“2.2.3”項(xiàng)下“精密加入5%……靜置15min”方法操作后，于480 nm波長處測定蘆丁吸光度，計(jì)算蘆丁加樣回收率及RSD。結(jié)果，蘆丁平均加樣回收率為98.71%，RSD為1.02%（n＝6）。

2.3 大孔吸附樹脂型號篩選

取不同型號（DM130、HPD100、X-5、NKA-9、AB-8、HP20、D101）的大孔吸附樹脂各10 g，分別置于100 mL錐形瓶中，加入三棱提取液50 mL（原液），常溫振搖12 h，取出，過濾，得吸附液，旋干，用70%乙醇溶解，定容至50 mL，搖勻，測定吸光度，計(jì)算原液總黃酮含量和吸附液中總黃酮含量。將上述過濾后的各類大孔吸附樹脂轉(zhuǎn)置于100 mL錐形瓶中，各加30 mL無水乙醇，超聲2 h，過濾，收集濾液；再將大孔吸附樹脂放于錐形瓶中，再加20 mL無水乙醇，超聲20 min，過濾，收集濾液，重復(fù)該步驟，直至溶液超聲至無色為止；合并收集的濾液，得解吸液，旋干，用70%乙醇溶解，定容至25 mL，搖勻，測定吸光度，計(jì)算解吸液總黃酮含量。以吸附率和解吸附率為指標(biāo)，篩選大孔吸附樹脂型號。吸附量（mg/g）＝（原液總黃酮含量－吸附液總黃酮含量）/大孔吸附樹脂質(zhì)量；吸附率（%）＝[（原液總黃酮含量－吸附液總黃酮含量）/原液總黃酮含量] ×100%；解吸附量（mg/g）＝解吸液總黃酮含量/大孔吸附樹脂質(zhì)量；解吸附率（%）＝解吸附量/吸附量×100%。結(jié)果，型號為HP20的大孔吸附樹脂的吸附率和解吸附率最優(yōu)，因此選用HP20型大孔吸附樹脂進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。大孔吸附樹脂型號篩選結(jié)果見表1。

表1 大孔吸附樹脂型號篩選結(jié)果Tab 1 Screening of macroporous resin types

2.4 三棱總黃酮分離純化工藝優(yōu)化的單因素試驗(yàn)

2.4.1 徑高比 取HP20型大孔吸附樹脂裝于5根規(guī)格相同的柱子中，使其徑高比分別為1∶6、1∶7、1∶8、1∶9，將三棱提取液濃縮成生藥質(zhì)量濃度為0.8 g/mL的上樣液，

按照大孔吸附樹脂比例分別量取三棱上樣液30、35、40、45 mL，調(diào)pH為4，以0.5 BV/h的流速上樣，至柱面液體略高于大孔吸附樹脂，靜置1 h后，用水沖柱至流出液無色，再以70%乙醇、1 BV/h流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，旋干，用70%乙醇溶解，定容至10 mL，搖勻，測定吸光度，計(jì)算總黃酮純化率（洗脫液總黃酮量/上樣液總黃酮量×100%，下同）。結(jié)果，當(dāng)樹脂徑高比為1∶6、1∶7、1∶8、1∶9時，總黃酮純化率分別為43.07%、45.74%、45.69%、45.03%，故確定最優(yōu)徑高比為1∶7。

2.4.2 上樣液濃度 量取三棱提取液適量，分別濃縮成生藥質(zhì)量濃度為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 g/mL的上樣液各50 mL，調(diào)pH為4，大孔吸附樹脂徑高比為1∶7，以0.5 BV/h的流速上樣，同“2.4.1”項(xiàng)下方法“至柱面液體略高于大孔吸附樹脂……計(jì)算總黃酮純化率”。結(jié)果，當(dāng)提取液上樣濃度為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 g/mL時，總黃酮純化率分別為53.43%、52.98%、52.19%、51.83%、51.12%，故確定最優(yōu)提取液上樣濃度為0.4 g/mL。

2.4.3 上樣液流速 量取三棱提取液適量，濃縮成生藥質(zhì)量濃度為0.4 g/mL的上樣液，再量取上樣液50 mL，各4份，均調(diào)pH為4，大孔吸附樹脂徑高比為1∶7，分別以0.5、1.0、1.5、2.0 BV/h的流速上樣，同“2.4.1”項(xiàng)下方法“至柱面液體略高于大孔吸附樹脂……計(jì)算總黃酮純化率”。結(jié)果，當(dāng)上樣流速為0.5、1.0、1.5、2.0 BV/h時，總黃酮純化率分別為53.19%、53.14%、51.44%、51.12%，故確定最優(yōu)上樣液流速為0.5 BV/h。

2.4.4 上樣液pH 量取三棱提取液適量，濃縮成生藥質(zhì)量濃度為0.4 g/mL的上樣液，再量取上樣液50 mL，各4份，調(diào)pH分別為2、4、6、8，大孔吸附樹脂徑高比為1∶7，以0.5 BV/h流速上樣，同“2.4.1”項(xiàng)下方法“至柱面液體略高于大孔吸附樹脂……計(jì)算總黃酮純化率”。結(jié)果，當(dāng)上樣液pH分別為2、4、6、8時，總黃酮純化率分別為44.85%、58.61%、57.09%、50.35%，故確定最優(yōu)上樣液pH為4。

2.4.5 洗脫液流速 量取三棱提取液適量，濃縮成生藥質(zhì)量濃度為0.4 g/mL的上樣液，再量取上樣液50 mL，各4份，調(diào)pH為4，大孔吸附樹脂徑高比為1∶7，以0.5 BV/h的流速上樣，至柱面液體略高于大孔吸附樹脂，靜置1 h后，用水沖柱至流出液無色，加70%乙醇，分別以1、2、3、4 BV/h進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，旋干，用70%乙醇溶解，定容至10 mL，搖勻，測定吸光度，計(jì)算總黃酮純化率。結(jié)果，當(dāng)洗脫液流速分別為1、2、3、4 BV/h時，總黃酮純化率分別為62.14%、57.33%、59.24%、55.58%，故確定最優(yōu)洗脫液速度為1 BV/h。

2.4.6 洗脫液濃度 量取三棱提取液適量，濃縮成生藥質(zhì)量濃度為0.4 g/mL的上樣液，再量取上樣液50 mL，各7份，調(diào)pH為4，大孔吸附樹脂徑高比為1∶7，以0.5 BV/h的流速上樣，至柱面液體略高于大孔吸附樹脂，靜置1 h后，用水沖柱至流出液無色，分別加30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇，以1 BV/h進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，旋干，用70%乙醇溶解，定容至10 mL，搖勻，測定吸光度，計(jì)算總黃酮純化率。結(jié)果，當(dāng)洗脫液濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%時，總黃酮純化率分別為25.36%、30.14%、50.84%、57.72%、68.59%、62.13%、61.15%，故確定最優(yōu)洗脫液濃度為70%。

2.5 三棱總黃酮分離純化工藝響應(yīng)面試驗(yàn)

2.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)，筆者發(fā)現(xiàn)上樣液pH、洗脫液流速、洗脫液濃度3個因素對總黃酮純化率影響最大，因此使用Design-Expert 8.06軟件，根據(jù)中心組合試驗(yàn)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理選擇上樣液pH（A）、洗脫液流速（B）、洗脫液濃度（C）作為影響因素（自變量），總黃酮純化率（Y）作為評價指標(biāo)（響應(yīng)值），優(yōu)化三棱總黃酮的純化工藝，因素與水平見表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3。

表2 因素與水平Tab 2 Factors and levels

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 3 Design and results of test

2.5.2 模型建立與方差分析 采用Design-Expert V 8.0.6軟件進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)，并分析處理數(shù)據(jù)，得到二次多項(xiàng)回歸方程Y＝69.54+6.04A+0.40B+3.05C－1.02AB－0.14AC+0.12BC－ 0.599A2－ 2.17B2－ 8.93C2（R2＝0.824 2）。方差分析結(jié)果見表4。

由表4可知，三棱總黃酮的純化工藝模型的P＜0.000 1，表明該回歸模型顯著，用該模型對三棱總黃酮的純化工藝進(jìn)行分析試驗(yàn)是合理的。根據(jù)表4中F值大小，推測影響本試驗(yàn)總黃酮純化率的因素大小順序?yàn)锳＞C＞B。

2.5.3 響應(yīng)面分析 采用Design-Expert V 8.0.6軟件分析，得出三棱總黃酮純化率各因素交互作用的響應(yīng)面圖。各因素與三棱總黃酮純化率之間的等高線圖和響應(yīng)面圖見圖1。

表4 方差分析結(jié)果Tab 4 Analysis of variance

圖1 各因素與三棱總黃酮得率之間的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig 1 Contour plot and response surface plot of each factor to the yield of total flavonoids of S.stoloniferum

由圖1可知，因素A的曲面較陡峭，提示因素A對響應(yīng)值影響顯著，這一結(jié)果與方差分析的結(jié)果一致。最后，經(jīng)Design-Expert V 8.0.6軟件優(yōu)化得出三棱總黃酮的分離純化工藝條件為上樣液pH 4.83，洗脫流速2.01 BV/h，洗脫液濃度為72.30%。結(jié)合可行性及實(shí)際所需，最終修正其為上樣液pH 4.8，洗脫液流速2.0 BV/h，洗脫液濃度72%。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

取三棱提取液50 mL 3批，濃縮成生藥質(zhì)量濃度為0.4 g/mL的上樣液，調(diào)整上樣液pH至4.8，大孔吸附樹脂徑高比為1∶7，以0.5 BV/h的流速上樣，至柱面液體略高于大孔吸附樹脂，靜置1 h后，用水沖柱至流出液無色，加72%乙醇，以2.0 BV/h進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，旋干，用70%乙醇溶解，定容至10 mL，搖勻，測定吸光度。結(jié)果，3批樣品純化后的總黃酮純化率為72.34%（RSD＝1.77%，n＝3）（純度為40.83%），與預(yù)測值（73.99%）的相對誤差為2.13%，提示該優(yōu)化工藝可靠。

3 討論

目前對于三棱的藥理作用已有很多研究[8]，其中三棱總黃酮是其主要的有效成分，但是在本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，三棱總黃酮的含量較少，為了深入三棱藥材的研究，筆者在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對三棱總黃酮的純化工藝進(jìn)行優(yōu)化。Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法是優(yōu)化純化工藝條件的常用方法，具有試驗(yàn)次數(shù)少、精度高、預(yù)測值精準(zhǔn)的優(yōu)點(diǎn)，本試驗(yàn)采取單因素試驗(yàn)結(jié)合Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化三棱總黃酮分離純化工藝，在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)三棱提取液經(jīng)上樣后，使用水洗脫，可去掉大部分雜質(zhì)；30%、40%、50%、60%乙醇洗脫后，三棱總黃酮純化率較低，70%、80%乙醇洗脫后，三棱總黃酮純化率較高，由此推測，三棱總黃酮成分極性不大，可能與70%～80%乙醇極性較為接近，從而較容易洗脫；驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性與可預(yù)測性良好，有效地提高了三棱總黃酮純化率。因此筆者在課題后續(xù)試驗(yàn)中，可以對純化后的三棱總黃酮與未純化的三棱總黃酮進(jìn)行化學(xué)成分分析，并深入了解三棱總黃酮的藥理藥效作用，為三棱總黃酮的開發(fā)和利用提供一定的參考。